Summary
Nous décrivons ici un protocole pour isoler des sous-ensembles de précurseurs des lymphocytes B du sang de cordon ombilical. Une quantité suffisante et de qualité des acides nucléiques peut être extrait des cellules et utilisées dans des essais ultérieurs en utilisant l'ADN ou de l'ARN.
Abstract
Sang du cordon ombilical est fortement enrichie en cellules souches hématopoïétiques à différentes phases de l'engagement lignée. Nous avons élaboré un protocole pour isoler précurseur de cellules B à quatre différents stades de différenciation. Parce que les gènes sont exprimés et les modifications épigénétiques se produisent d'une manière spécifique d'un tissu, il est essentiel de distinguer les tissus et types cellulaires afin d'être en mesure d'identifier les modifications dans le génome et l'épigénome qui peuvent conduire à l'apparition de la maladie. Ce procédé peut être adapté à n'importe quel type de cellule présente dans le sang du cordon ombilical, à tout stade de différenciation.
Cette méthode comporte 4 étapes principales. Tout d'abord, les cellules mononucléées sont séparées par centrifugation par densité. Deuxièmement, les cellules B sont enrichis en utilisant des anticorps conjugués biotine qui reconnaissent et enlever les cellules B non à partir des cellules mononucléées. Tiers les cellules B sont marqués par fluorescence avec des anticorps spécifiques des protéines de surface cellulaire à des stades différentsdu développement des cellules B. Enfin, les cellules marquées par fluorescence sont triés et populations individuelles sont récupérés. Les cellules récupérées sont en quantité et qualité suffisantes pour être utilisés dans des dosages d'acides nucléiques en aval.
Introduction
Afin d'identifier les aberrations qui sont présents dans la maladie, il est extrêmement important que nous utilisions les tissus sains ou des cellules qui correspondent au type de tissus ou de cellules touchées par la maladie. Une raison à cela est que la variation épigénétique chez les types de tissus est responsable de la régulation de l'expression génique et est essentiel pour la différenciation cellulaire au cours du développement humain normal 1,2. Une deuxième raison est que la réglementation tissu aberrant gène spécifique peut avoir des conséquences désastreuses sur le développement normal et est connu pour contribuer à une multitude d'états pathologiques comme le cancer. Par conséquent, une meilleure compréhension d'une maladie qui implique des cellules hématopoïétiques nécessite la connaissance de saines cellules hématopoïétiques.
Le développement des cellules hématopoïétiques dans la moelle osseuse du produit au moyen d'un ordre systématique des événements, caractérisé par des changements dans l'expression de marqueurs de surface cellulaire 3. Les études portant sur les participants adultes ontmontré que la moelle osseuse contient généralement un faible nombre de cellules B précurseurs 4,5, alors que les études impliquant des participants pédiatriques ont montré que le pourcentage de précurseur de cellules B est relativement élevée chez les individus de moins de 5 ans d'âge de 6 ans. Le sang de cordon ombilical est utilisé comme source de cellules souches hématopoïétiques dans le traitement des troubles du sang et des tumeurs malignes liées, est facilement accessible par l'intermédiaire des banques de sang de cordon et est enrichie en B et les lymphocytes T immatures 7 qui sont des cellules cibles de troubles multiples, y compris la leucémie et lymphomes.
Précurseur de lymphocytes B dans la moelle osseuse ont été largement phénotypées 8,9 et peut être défini par la présence de certains marqueurs de surface cellulaire qui peut être utilisé pour trier ces cellules en sous-ensembles distincts. Normales produit de différenciation des cellules B à travers une série d'étapes dans la moelle osseuse en commençant par les premières cellules pro-B et culminant dans immatures ou cellules B naïves. Selonà van Zelm et ses collègues 10, cellules pro-B sont caractérisées par la présence de CD34 et de la transition vers la phase 2 (Pré-BI) CD19 est acquise. Cellules étape 3 (Pré-BII) ne expriment CD34 et commencent à exprimer des IgM cytoplasmique. Enfin, une caractéristique essentielle de l'étape 4 (immature des cellules B) est l'expression d'IgM de surface. La stratégie de tri décrite dans ce protocole a d'abord été décrite par Caldwell et ses collègues 6 et comprend l'utilisation de seulement 3 marqueurs de surface cellulaire, ce qui réduit considérablement la complexité et le coût de la réalisation d'expériences de tri cellulaire. Dans leur travail, une relation entre CD45 et les étapes de la différenciation des cellules B-a été mis en place. Ils ont observé que les lymphocytes B dans la moelle osseuse présentent des niveaux variables d'expression de CD45. Plus précisément, les cellules qui expriment des niveaux élevés de CD45 correspondent aux cellules qui expriment IgM de surface (cellules B immatures), ceux qui ont exprimé un niveau intermédiaire de CD45 correspondent aux cellules qui expriment cytoplasmic IgM (pré-BII cellules), et ceux qui expriment des niveaux faibles de CD45 correspondent à des cellules qui n'ont pas exprimé IgM cytoplasmique (pré-BI cellules). Ce protocole utilise la stratégie élaborée par Caldwell et ses collègues 6 à isoler des sous-ensembles de précurseurs des cellules B du sang de cordon ombilical (Figure 1) qui peuvent être utilisés dans des essais en aval nécessitant élevés d'acides nucléiques de qualité tels que le dosage méthylé CpG île de récupération (MIRA ) 11 et quantitatives en temps réel PCR. Le procédé emploie une séparation initiale en utilisant des billes magnétiques d'épuiser toutes les cellules non B provenant du sang de cordon ombilical et nécessite seulement la coloration avec 3 anticorps (CD34, CD19 et CD45). Les cellules qui sont récupérés représentent 4 étapes de la différenciation des cellules B-1) CD34 +; CD19 + (fin) pro-B et au début du pré-BI; 2) CD34 -, CD19 +, CD45 faible (fin pré-BI); 3) CD34 -; CD19 +; CD45 med (pré-BII), et 4) CD34 -; CD19 +; CD45 élevé (les cellules B immatures).
Protocol
1. Isolement des cellules mononucléées du sang de cordon ombilical
- Préparer l'EDTA-tampon PBS-ajouter 5 ml de sérum bovin solution d'albumine actions (BSA) à 95 ml de tampon de rinçage (dilution 1:20). Degas le tampon et garder le tampon sur la glace. IMPORTANT: Ne pas dégazer le tampon peut entraîner moins de résultats optimaux lors de l'isolation CD19 + cellules B parce que les bulles peuvent bloquer la colonne isolement.
- Préparer 50 ml tubes coniques pour la centrifugation en gradient de densité. Déterminer le nombre de tubes nécessaires pour le traitement du sang de cordon ombilical (1 tube peut traiter 8 ml de sang) et ajouter 15 ml de Ficoll-Paque PLUS pour chaque tube.
- Diluer 8 ml de sang de cordon avec du DPBS ml 24 (1X) et soigneusement couche du mélange de cordon sang dilué sur le dessus du Ficoll-Paque PLUS dans chacun des tubes coniques de 50 ml. Ne pas mélanger le sang et Ficoll-Paque PLUS IMPORTANT:. Afin d'éviter le mélange du sang de cordon et de Ficoll-Paque PLUS, tenir le tube à un angle de 45 degrés etcouche du mélange sang lentement.
- Centrifuger à 400 xg pendant 40 min à 20 ° C. Les cellules mononucléaires (MNC) restera au plasma Ficoll-Paque PLUS d'interface alors que les granulocytes et les érythrocytes de sédiments dus à une densité plus élevée à la pression osmotique de Ficoll-Paque PLUS. Étiquette Seven 5 ml à fond rond tubes à être utilisés dans la partie 3 de l'identification de l'échantillon, la date et le suivant:
| Tube | Étiquette | But |
| 1 | Sans tache | Cellules non colorées pour la normalisation au cours de la cytométrie en flux |
| 2 | 7AAD | Pour déterminer la viabilité pendant la cytométrie en flux |
| 3 | + + + | Contient les cellules qui seront triés |
| 4 | 34 + | Pour collecter les cellules CD34 + / CD19 +(Fin de pro-B - début de pré-BI), les cellules |
| 5 | 45 faible | Pour collecter CD34 - / CD19 + / CD45 faible (pré-BI), les cellules |
| 6 | 45 med | Pour collecter CD34 - / CD19 + CD45 / med (pré-BII), les cellules |
| 7 | 45 High | Pour collecter CD34 - / CD19 + / CD45 élevé (B) des cellules immatures |
Manteau tubes 4, 5, 6 et 7 avec 2% de FBS et placer tous les tubes sur la glace.
- Aspirer la couche supérieure de plasma avec soin et éviter tout contact avec la couche de cellules mononucléaires. En utilisant une pipette de 10 ml en verre, soigneusement transférer la couche de cellules mononucléaires à un nouveau 50 ml tube conique. Combinez les cellules mononucléaires de trois tubes ensemble dans un seul tube de 50 ml.
- Remplir le tube avec du PBS, mélanger doucement et centrifuger à 300 xg pendant 10 min à20 ° C. Aspirer soigneusement le surnageant sans déranger le culot cellulaire. Répétez 1x. Après le premier lavage, remettre en suspension les culots et transférer dans un seul tube de 50 ml conique.
- Resuspendre doucement le culot cellulaire dans 200 pi de PBS. Retirer 1 ul de la suspension cellulaire, l'ajouter à 1 ml de PBS dans un tube de 1,5 ml et mis de côté pour le comptage (comptage des cellules après avoir placé la suspension de 50 ml de cellules dans la centrifugeuse). Remplir le tube avec du PBS et centrifuger à 200 xg pendant 15 min pour éliminer les plaquettes. Retirer le surnageant sans déranger le culot cellulaire.
2. Mise à jour des lymphocytes B Isolement de cellules mononucléaires en utilisant une séparation MACS
- Reprendre le culot de l'étape 1.7 avec 160 ul froid (4 ° C) EDTA-tampon PBS.
- Ajouter 40 ul de LLC-B cocktail d'anticorps biotine. Introduire à la pipette pour bien mélanger et incuber pendant 10 min à 4 ° C.
- Laver les cellules - ajouter 1 ml froide (4 ° C) EDTA-tampon PBS pour 10 millions de cellules (cellule numbre déterminé à l'étape 1.7) et centrifuger à 300 xg pendant 10 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 320 ul froid (4 ° C) EDTA-tampon PBS.
- Ajouter 80 ul anti-biotine microbilles, bien mélanger et incuber pendant 15 min à 4 ° C.
- Laver les cellules - ajouter 1 ml froide (4 ° C) EDTA-tampon PBS pour 10 millions de cellules et centrifuger à 300 xg pendant 10 min. Remettre en suspension jusqu'à 100 millions de cellules dans 500 ul de froid (4 ° C) EDTA-tampon PBS. Volume tampon échelle en fonction du nombre de cellules.
- Préparer colonnes MACS MACS et séparateurs lors de la centrifugation (étape 2.5). Placer une colonne LS dans le champ magnétique du séparateur MACS, ajouter 3 ml d'eau froide (4 ° C) EDTA-tampon PBS sur la colonne et permettre au tampon de s'écouler à travers la colonne. Utiliser un récipient pour attraper le flux à travers. Jeter l'effluent à travers.
- Placer un tube conique de 50 ml en dessous de la colonne et introduire à la pipette la suspension cellulaire sur la colonne. Laisser les cellules non marquées à couler through et la colonne dans le tube conique de 50 ml. IMPORTANT: Ce sont les cellules qui seront utilisés pour l'étiquetage des anticorps et tri cellulaire. Ne jetez pas le débit à travers. De récupérer la totalité des cellules de l'étape 2,5, ajouter un supplément de 1 ml de froid (4 ° C) EDTA-tampon PBS sur les parois du tube conique. Mélanger doucement et introduire à la pipette la suspension de cellules restant sur la colonne. Répétez 1x. Passer à l'étape 2,8 en utilisant les cellules non marquées recueillies dans le tube conique après avoir traversé la colonne.
- Remplir le tube conique contenant des cellules non marquées avec du PBS et centrifuger à 300 xg pendant 10 min. Retirez délicatement le surnageant sans déranger le culot cellulaire. Ajouter 200 ul d'EDTA-tampon PBS et remettre les cellules en douceur.
3. Marquage de l'anticorps et la préparation au tri cellulaire
- Aspirer 1 ul de la suspension cellulaire et le lieu dans le tube étiqueté «sans tache» (étape 1.4). Ajouter 500 ul d'EDTA-tampon PBS et stocker le tube sur la glace.
- Ajouter 20ul de chaque anticorps (CD19, CD34 et CD45) par million de cellules dans la suspension de cellules restant. Bien mélanger et placer le tube dans l'obscurité pendant 30 min à température ambiante. Anticorps CD sont sensibles à la lumière, suivez les étapes 2-4 avec les lumières éteintes.
- Après 30 min d'incubation avec des anticorps, aspirer 40 ul de la suspension cellulaire et le placer dans le tube étiqueté «7AAD". Ajouter 1 ml de PBS dans le tube et centrifuger à 500 xg pendant 2 min. Enlever le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 ul de tampon de liaison. Ajouter 7 pi de 7AAD (7-aminoactinomycine D) et incuber à l'obscurité pendant 10 min à température ambiante. Lors de l'étape 10 min d'incubation complète 3.4.
- Ajouter du PBS à la partie supérieure du tube contenant les cellules restantes avec des anticorps marqués CD. Centrifuger le tube à 500 xg pendant 3 min. Retirer le surnageant, ajouter 500 ul d'EDTA-tampon PBS et remettre en suspension le culot cellulaire. Transférer la totalité du volume de la suspension cellulaire dans le tube étiqueté "+ + +". Pour récupérer la totalité de la suspension cellulaire d'undd un supplément de 1 ml d'EDTA-tampon PBS au tube conique de 50 ml et transférer dans le tube étiqueté "+ + +".
- Après incubation (étape 3.3), ajouter 300 ul de tampon de liaison dans le tube 7AAD. La "tache", "7AAD" et "+ + +" échantillons et le "34 +", "45 bas", "45 med" et "45" de haute tubes sont prêts pour la cytométrie en flux.
4. Tri cellule à l'aide du cytomètre de flux XDP MoFlo
- Set-up MoFlo de tri: Aligner les lasers, de stabiliser courant de gouttelettes, de déterminer temporisation à la chute.
- Préparer simples commandes de compensation de couleur à l'aide de la souris Invitrogen AbC perle kit (ou similaire) selon les instructions du fabricant. Exécuter des contrôles simples de couleur, le réglage des tensions de canaux de fluorescence pour une séparation optimale des populations positives et négatives. Définir et appliquer des coefficients de compensation paramètre compensée au protocole de collecte. Rétablir coefficients de compensation à chaque fois qu'un nouveau lot d'anticorps est obtenue.
- Créer protocole, y compris les parcelles comme le montre la figure 2.
- Exécutez l'échantillon sans tache, régler la tension et le gain de dispersion vers l'avant et de côté, et d'identifier les populations négatifs de fluorescence. Parce récupération de l'ADN est le but de la sorte, le seuil devrait être faible (≤ 1%), de sorte que l'ADN contenant des débris ne pas contaminer les échantillons récupérés. * Assurez-vous que le système d'évacuation des aérosols est en marche à tout moment que vivent les cellules humaines sont en cours d'exécution sur le MoFlo.
- Exécuter une petite aliquote des échantillons + + + (~ 50,000 événements) pour définir la stratégie de déclenchement (Figure 2). Parce que les progéniteurs des lymphocytes B ne se dispersent pas identique à mûrir les cellules B, CD19-grille non synchronisées + / CD34 + de la population sur le terrain de la SSC vs FSC pour assurer le portail des lymphocytes comprend potentiels cellules pro-B. De cet échantillon a également mis la population négative de fluorescence pour 7AAD.
- Exécutez l'exemple 7AAD pour déterminer la viabilité de l'échantillon. Seules les cellules de tri à partir d'un échantillon avec une grande viabilité audépart (≥ 95%) que les cellules mortes tache sans discernement et peuvent contaminer les populations de tri.
- Mettre en place des décisions de tri pour recueillir des quatre populations: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 faible, CD19 + / CD34 - / CD45 med, et CD19 + / CD34 - / CD45 élevé. Inclure les lymphocytes et les portes discrimination doublet dans les décisions de tri de toutes les populations.
- Pour éviter les obstructions à la pointe de tri, de filtre + + + échantillon à travers un tamis 40 pm cellule immédiatement avant le triage et re-filtre si aucune agrégation se produit dans l'échantillon au cours de tri.
- Trier les cellules dans des tubes collecteurs (étape 1.4) recouvertes avec du FBS à 2% dans du PBS dans un porte-tube refroidi ou sous glace.
- Immédiatement après tri est terminé, extraire l'ADN.
Representative Results
Entre l'échantillon variation joue un rôle dans le succès de ce genre de cellule (tableau 1). Les échantillons avec des bons taux de réussite de faibles niveaux de contamination de débris (figure 3A) et les échantillons avec des taux de réussite pauvres ont des niveaux élevés de contamination de débris (figure 3B). Entre l'échantillon variation peut être quelque peu contrôlée si l'échantillon de sang de cordon ont été recueillies dans les 24 heures d'expédition (O / N priorité).
Les cellules d'écoulement triés de chacun des précurseurs des lymphocytes B sont sous-ensemble de la quantité et de qualité suffisantes pour effectuer isolement d'acides nucléiques. L'ADN isolé est de bonne qualité et peut être utilisé dans des analyses en aval. Nous avons l'habitude d'utiliser cet ADN dans MIRA 11 à enrichir de l'ADN méthylé (figure 4).
| Données de sang de cordon installations | Trier Mauvais | |
| Volume sanguin Travailler avec anticoagulant (ml) | 110 | 104 |
| White Blood Cells [10 3 / ul] | 8,68 | 11,19 |
| Lymphocytes [10 3 / ul] | 3,88 | 3,76 |
| Lymphocytes (%) | 44,70 | 33,6 |
| Globules rouges [10 6 / ul] | 3,65 | 3,05 |
| In-house de données | ||
| Nombre de cellule après Ficoll-Paque | 206 M | 309 M |
| Nombre de cellules après la séparation MACS | 22 M | 16,5 M |
| Total Nombre Événements (MoFlo XDP) | 30,57 M | 19,97 M |
| Viabilité (%) | 98,00 | 98,00 |
| Les cellules de la Porte des lymphocytes (%) 17,00 | 50,00 | |
| CD19 + / CD34 + | ||
| Nombre total de cellules | 10959 | 48316 |
| % Du Total des événements | 0,04 | 0,24 |
| Efficacité | 88% | 88% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 faible | ||
| Nombre total de cellules | 16619 | 26941 |
| % Du Total des événements | 0,05 | 0,13 |
| Efficacité | 89% | 87% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 med | ||
| Nombre total de cellules | 469745 | 507540 |
| % Du Total des événements | 1,54 | 2,54 |
| Efficacité | 89% | 89% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 haute | ||
| Nombre total de cellules | 1896062 | 2047142 |
| % Du Total des événements | 6,2 | 10,25 |
| Efficacité | 91% | 90% |
Tableau 1. Représentant les statistiques de tri cellulaire. Lignes 1-5 sont chiffres fournis par l'installation de sang de cordon. Les autres lignes sont données recueillies dans notre laboratoire. Le tri pauvres contenaient des niveaux élevés de débris et un faible pourcentage de cellules dans la grille des lymphocytes.
Figure 1. Diagramme de la procédure. Sang de cordon ombilical sont traitées et les cellules mononucléées sont isolées à l'aide de Ficoll-Paque Plus. Une étape de lavage supplémentaire est incluse pour éliminer les plaquettes contaminantes. Les cellules B sont isolés à partir de cellules mononucléaires en utilisant le kit MACS humain isolement des cellules B (LLC-B). Cette étape utilise la biotine conjugué anticorps monoclonaux (CD2, CD4, CD36, CD11b, anti-IgE et CD235a) afin d'éliminer toutes les cellules non-B. Les lymphocytes B récupérés sont marqués avec CD19-APC, CD34 et CD45-PE-FITC puis triés à l'aide du cytomètre de flux MoFlo XDP pour récupérer précurseurs de cellules B des sous-ensembles: CD19 + / CD34 +, CD19 + / CD34 - / CD45 faible , CD19 + / CD34 - / CD45 med, et CD19 + / CD34 - / CD45 élevé.
Figure 2. Stratégie de déclenchement pour l'identification et le tri populations. flèches rouges indiquent la porte qui est appliqué à tracer ultérieure. Portes R4, R5, R6 et R7 indiquent que les populations triées. A) Avant vs nuage de points de côté montrant enrichi population de lymphocytes. R1, porte lymphocytes. B) Hauteur par rapport largeur du diagramme de dispersion vers l'avant pour identifier les cellules individuelles par rapport aux doublets. R2, porte cellule unique. C) CD19-APC cellules positives tombe dans les populations CD34-PE négatifs et positifs. R3, CD19 + / CD34 - porte; R4, CD19 + / CD34 + porte population indiquant tri souhaité d) CD19 + / CD34 - les cellules se divisent en trois quelque peu distinctes CD45-FITC populations.. R5 et R6, CD19 + / CD34 - / CD45 + CD19 faibles et / CD34 - / CD45 populations med, respectivement. R7, en raison du nombre élevé de cellules CD19 + dans la / CD34 - / CD45 élevée de la population, cette porte de tri englobe uniquementune partie de la population. Toutes les cellules de cette population n'ont pas besoin d'être collectées pour des analyses en aval.
Figure 3. A) Les faibles niveaux de contamination des débris après l'enrichissement de la colonne. R1, porte lymphocytes. B) Des niveaux élevés de contamination des débris après l'enrichissement de la colonne.
Figure 4. L'enrichissement de l'ADN méthylé de sous-ensembles de cellules B précurseurs. Un ADN) isolé à partir de précurseurs soniqué cellules B des sous-ensembles est de haute qualité. Pour l'ADN construction de la bibliothèque est soniquée à une moyenne de 200-600 pb. Piste 1: Promega 100 pb échelle (catalogue n ° G2101), Lane 2: L'ADN total isolé à partir de cellules CD19 + / CD34 +; Voie 3: L'ADN total isolé à partir de cellules CD19 + - / CD45 des cellules faibles; Voie 4: 100 ng d'ADN isolé à partir de cellules CD19 + / CD34 - / CD45 des cellules med; Voie 5: 100 ng d'ADN isolé à partir de cellules CD19 + / CD34 - CD45 / cellules élevées. L'ADN a été soniquée à l'aide de la Bioruptor Diagenode le haut pour un total de 9 min (30 sec ON, 30 sec OFF). ADN a été purifié sur colonne et visualisés sur un gel d'agarose 1% par SYBR green gel colorant d'acide nucléique. B) Après MIRA utilisant le kit Ultra ActivMotif MethylCollector, PCR avec SLC25A37 (1-6) et APC1 (7-12) est effectuée pour confirmer l'enrichissement de l'ADN méthylé. 1 & 7: ADN génomique traité par ultrasons (pas MIRA); 2 & 8: MIRA-CD19 + / CD34 + ADN; 3 & 9: MIRA-CD19 + / CD34 - ADN / CD45 faible, 4 & 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 med ADN; 5 & 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 ADN de haut, 6 et 12: maîtrise de l'eau. Supérieur amplification de SLC25A37 confirme l'enrichissement de l'ADN méthylédans les sous-ensembles de cellules B précurseurs.
Discussion
Le facteur ayant le plus d'impact sur le succès de ce protocole est la présence de contamination des débris. Si vous demandez le sang d'une banque de sang de cordon, il est important d'avoir le sang expédiés plus tôt possible après le prélèvement. En outre, des échantillons qui sont classés comme lymphocytose contenir un plus grand nombre de lymphocytes, mais ces échantillons n'ont pas un nombre suffisant de précurseur de cellules B et ne doit pas être utilisé. Pour augmenter la probabilité d'obtenir un nombre suffisant de cellules pour chacune des sous-ensembles de précurseurs que nous recommandons à commencer par au moins 85 ml de sang de cordon.
Il est important de noter que, contrairement aux adultes séparations du sang périphérique, lorsque le fractionnement du sang de cordon ombilical de la couche mononucléaire est souvent contaminée par les globules rouges 12. Ce protocole comprend une étape de lavage supplémentaire pour éliminer les plaquettes contaminantes. Protocoles décrivant les séparations mononucléées du sang de cordon suggérons d'inclure une étape de lyse to supprimer les indésirables globules rouges. Nous ne recommandons pas cette étape, car elle produit des débris contaminant et a un impact négatif sur le succès de ce genre de cellules.
Afin de réduire le nombre de cellules qui doivent être distinguées par cytométrie de flux, il est nécessaire d'effectuer un enrichissement de cellules B avant le tri de cellules. Le protocole fourni par Miltenyi Biotec, qui accompagne le kit d'isolation à cellules B (LLC-B), a été optimisé pour le sang périphérique et recommande l'utilisation de 10 pl B-CLL cocktail d'anticorps biotine pour 10 millions de cellules. Cette étape utilise des anticorps contre CD2 (cellules T, cellules NK), les cellules CD4 (cellules T), CD11b (granulocytes monocytes, les macrophages;), CD16 (cellules NK, macrophages, mastocytes), CD36 (plaquettes), CD235a (cellules érythroïdes) d'épuiser les cellules non-B dans le sang du cordon ombilical. Il est important d'utiliser le kit décrit et non le B-cellule d'isolement kit II parce que le kit contient ancienne un anticorps dirigé contre CD43 qui est présent sur les cellules pro-B. Lors de notre optimisation de ce protocole, nous avons constaté qu'un total de 40 ul de la LLC-B cocktail d'anticorps biotine est suffisante pour produire un résultat positif cellule genre. En outre nous avons trouvé que l'utilisation d'aussi peu que 5 ul plus du cocktail B-CLL biotine a eu des effets néfastes sur le genre de cellule. Par conséquent, nous recommandons fortement d'utiliser 40 pl de la LLC-B cocktail d'anticorps biotine pour le total du nombre de cellules mononucléaires entre 175 à 250.000.000. Si en commençant par un nombre plus ou moins élevés de cellules, il peut être nécessaire de mettre à l'échelle les réactifs en conséquence.
Il existe de nombreuses publications contradictoires décrivant les marqueurs qui peuvent être utilisés pour distinguer les sous-populations de cellules B. La plupart de l'écart peut être expliqué par le fait que la différenciation est un processus continu et que la présence ou l'absence de marqueurs de surface cellulaire se produit de manière progressive au lieu d'une manière tout ou rien. Dans ce protocole CD34 - / CD19 + et le niveau d'intensité de CD45 + (faible, l'expression moyenne, haute) a été utilisé pour distinguer pré-BI, BII et pré-cellules B immatures avec une augmentation de l'expression de CD45 niveau correspondant à la progression de la différenciation 6. Cellules pro-B ont été décrits par certains comme CD19 + / CD34 + 13 tandis que d'autres ont montré que les cellules pro-B sont CD19 - / CD34 + et les cellules pré-BI sont CD19 + / CD34 + 9,10. Sur la base de ces différences, nous avons désigné les CD19 + / CD34 + en fin cellules pro-B / BI début des pré-cellules. Il est important de noter que cette stratégie a été élaborée afin d'isoler des sous-ensembles de précurseurs des cellules B qui correspondent aux cellules touchées par la maladie leucémie lymphoblastique aiguë. Cependant, il existe plusieurs stratégies de tri qui peuvent être employés selon le sous-type de cellules d'intérêt.
Anticorps fluorochromes combinaisons doivent être choisis en fonction des capacités du trieur de cellules disponibles. En tant que genresl Etat, la plus brillante fluorochrome dans votre panneau devrait être utilisé pour étiqueter l'antigène moins peuplé et vice-versa. En détectant double-tachées populations, en particulier les événements rares comme celles-ci, la discrimination doublet (figure 2B) est une partie essentielle de la stratégie de déclenchement. Ceci garantit que les événements de double positives sont des cellules uniques véritablement colorées avec les deux anticorps et non pas seulement deux cellules colorées unique adhèrent les uns aux autres.
À grande vitesse, tri cellulaire à 4 voies crée nécessairement un environnement contrôlé aérosol. Par conséquent, en direct de tri cellulaire humaine doit être effectuée avec le plus grand soin. Publié consignes de sécurité et de décontamination sont disponibles et devraient être revus et mis en œuvre avant que le tri 14. L'approbation des comités institutionnels sur la biosécurité ou leurs équivalents peuvent être nécessaires avant le tri. Pour décontamination après le tri, l'eau de Javel doit être ajouté au conteneur de déchets à une concentration finale de 10%. Similarly, tous les tubes échantillons ainsi que toutes les surfaces dans la région immédiate doit être minutieusement décontaminé avec une solution javellisée à 10% fraîchement préparé.
En résumé, ce protocole prévoit une stratégie d'obtention de populations rares de précurseur de cellules B et peuvent être modifiées à isoler une population rare présent dans le sang du cordon y compris les cellules souches hématopoïétiques et les cellules T immatures. Récemment, des cellules B immatures ont été identifiées dans le sang périphérique d'individus à un stade avancé du VIH 15. Par conséquent, l'utilité de cette méthode s'étend au-delà de l'étude des cancers du sang. Enfin, nous n'avons pas encore réalisé isolement d'ARN sur les cellules d'écoulement triés, mais cette méthode devrait être adaptable à la mise en garde que pendant tri cellulaire des cellules doivent être triés directement dans Trizol ou une solution d'ARN équivalent compatible, tel que RLT du kit RNeasy disponibles par le biais Qiagen.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NCI R00 CA132784) à l'AC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
- Song, F., et al. Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression. PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).
- Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells. Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).
- Brown, G., et al. The sequential determination model of hematopoiesis. Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).
- Clark, P., et al. Lymphocyte subsets in normal bone marrow. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).
- Loken, M. R., et al. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).
- Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. B-cell precursors in normal pediatric bone marrow. American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).
- Tucci, A., et al. Are cord blood B cells functionally mature? Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).
- Ghia, P., et al. Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci. J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).
- Noordzij, J. G., et al. Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children. Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).
- van Zelm, M. C., et al. Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression. J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).
- Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. The MIRA method for DNA methylation analysis. Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).
- Kanof, E. M., et al. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Suppl 19. 7.1.1-7.1.7 (1996).
- LeBien, T. W.
- Schmid, I., et al. International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells. Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).
- Malaspina, A., et al. Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7. PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).
