Summary
Her beskriver vi en protokoll for å isolere undergrupper av forløperen B-celler fra navlestrengsblod. En tilstrekkelig mengde og kvalitet av nukleinsyrer kan ekstraheres fra cellene og brukes i påfølgende analyser anvender DNA eller RNA.
Abstract
Navlestreng blod er høyanriket for blodkreft stamceller på ulike avstamning engasjement etapper. Vi har utviklet en protokoll for å isolere forløper B-celler ved fire forskjellige stadier av differensiering. Fordi genene uttrykkes og epigenetic modifikasjoner oppstå i en vev bestemt måte, er det viktig å diskriminere mellom vev og celletyper for å kunne identifisere endringer i genomet og epigenome som kan føre til utvikling av sykdommen. Denne metoden kan være tilpasset en hvilken som helst type celle er tilstede i navlestrengsblod på ethvert stadium av differensiering.
Denne metoden omfatter fire hovedtrinn. Først er mononukleære celler atskilt med tetthet sentrifugering. Sekund, er B-celler anriket hjelp biotin konjugerte antistoffer som gjenkjenner og fjerne uten B-celler fra de mononukleære cellene. Third B-cellene er fluorescensmerkede med celleoverflaten protein antistoffer spesifikke enkelte trinnav B-celle utvikling. Endelig er de fluorescensmerkede cellene sorteres og individuelle populasjoner blir gjenvunnet. De gjenvundne celler er av tilstrekkelig mengde og kvalitet for å bli benyttet i nedstrøms nukleinsyre analyser.
Introduction
For å identifisere avvik som er til stede i sykdom, er det viktig at vi bruker friskt vev eller celler som tilsvarer vev eller celletype rammet av sykdommen. En grunn til dette er at epigenetic variasjon blant vevstyper er ansvarlig for regulering av genuttrykk og er kritisk for cellulær differensiering under normal menneskelig utvikling 1,2. En annen grunn er at avvikende vev bestemt genregulering kan ha alvorlige konsekvenser for normal utvikling og er kjent for å bidra til et mangfold av sykdomstilstander, inkludert kreft. Derfor krever en bedre forståelse av en sykdom som innebærer hematopoetiske celler kjennskap friske hematopoetiske celler.
Utviklingen av hematopoetiske celler i benmargen går gjennom en systematisk rekkefølge av hendelser kjennetegnet ved endringer i ekspresjonen av celleoverflate markører 3. Studier med voksne deltakere harvist at benmarg vanligvis inneholder et lavt antall forløper B-celler 4,5, mens studier som involverer pediatriske deltakere har vist at andelen av forløperen B-celler er relativt høy i individer mindre enn 5 år 6. Navlestrengsblod blir brukt som en kilde av hematopoetiske stamceller i behandlingen av blod relaterte lidelser og maligniteter, er lett tilgjengelig via ledningen blod banker og er anriket for umodne B-og T-celler 7, som er målcellene av flere lidelser inkludert leukemi og lymfomer.
Forløper B-celler i benmargen har blitt omfattende phenotyped 8,9 og kan defineres ved nærværet av spesifikke celleoverflatereseptorer markører som kan brukes til å sortere disse cellene inn i forskjellige delsett. Normal B-celledifferensiering går gjennom en rekke stadier i benmargen begynner med de tidligste pro-B-celler og kulminerte i umodne eller naiv B-celler. Ifølgevan Zelm og kolleger 10, er pro-B-celler karakterisert ved tilstedeværelsen av CD34 og i overgangen til trinn 2 (Pre-BI) CD19 er ervervet. Stage 3 (Pre-BII) cellene ikke lenger uttrykkelig CD34 og begynne å uttrykke cytoplasmic IgM. Endelig er et særtrekk ved stadium 4 (umodne B-celler) ekspresjonen av overflaten IgM. Sortering strategi beskrevet i denne protokollen ble først beskrevet av Caldwell og kolleger 6 og inkluderer bruk av kun 3 celleoverflaten markører som reduserer kompleksiteten og kostnadene ved å utføre celle sortering eksperimenter. I sitt arbeid, ble et forhold mellom CD45 og stadier av B-celle-differensiering etablert. De observerte at B-celler i benmargen viser varierende nivå av ekspresjon av CD45. Spesifikt, celler som uttrykte høye nivåer av CD45 tilsvarte celler som uttrykte overflate IgM (umodne B-celler), tilsvarte de som uttrykte et middels nivå av CD45 til celler som uttrykte cytoplasmic IgM (pre-BII celler), og de som uttrykte lave nivåer av CD45 tilsvarte celler som uttrykte ikke cytoplasmisk IgM (pre-BI celler). Denne protokollen bruker strategien utviklet av Caldwell og kolleger 6 å isolere undergrupper av forløper B-celler fra navlestrengsblod (figur 1) som kan brukes i nedstrøms analyser krever høykvalitets nucleinsyrer som metylert-CpG øy utvinning assay (MIRA ) 11 og kvantitative Real Time PCR-analyser. Metoden benytter en innledende separasjon ved hjelp av magnetiske kuler til å utarme alle ikke-B-celler fra navlestrengsblod og krever flekker med bare 3 antistoffer (CD34, CD19 og CD45). Cellene som blir gjenvunnet representerer 4 etapper av B-celle-differensiering: 1) CD34 +; CD19 + (sen pro-B og tidlig pre-BI), 2) CD34 -; CD19 +; CD45 lav (sen pre-BI); 3) CD34 -; CD19 +; CD45 Med (pre-BII), og 4) CD34 -; CD19 +; CD45 høy (umodne B-celler).
Protocol
1. Isolering av mononukleære celler fra navlestrengsblod
- Forbered EDTA-PBS buffer-tilsett 5 ml bovint serum albumin (BSA) stamoppløsning til 95 ml skylling buffer (1:20 fortynning). Degas bufferen og holde buffer på isen. VIKTIG: Hvis du ikke Degas bufferen kan resultere i mindre enn optimale resultater når isolere CD19 + B-celler fordi bobler kan blokkere isolasjon kolonnen.
- Forbered 50 ml koniske rør for tetthetsgradient sentrifugering. Bestem antall rør som kreves for å behandle ledningen blod (1 rør kan behandle 8 ml blod) og tilsettes 15 ml Ficoll-Paque PLUS til hvert rør.
- Fortynn 8 ml ledningen blod med 24 ml DPBS (1X) og nøye lag den fortynnede ledningen blod blandingen på toppen av Ficoll-Paque PLUS i hvert av de 50 ml koniske rør. Ikke bland blodet og Ficoll-Paque PLUS VIKTIG:. Å unngå blanding av ledningen blod og Ficoll-Paque PLUS, holde røret i en 45 graders vinkel, oglag blodet blandingen sakte.
- Sentrifuger ved 400 xg i 40 min ved 20 ° C. Mononukleære celler (MNC) vil forbli på plasma-Ficoll-Paque PLUS grensesnitt mens granulocytter og erytrocytter sedimenter grunnet høyere tetthet ved det osmotiske trykk av Ficoll-Paque PLUS. Produsent syv 5 ml rundbunnet rør som skal brukes i del 3 med prøven ID, dato og følgende:
| Tube | Etiketten | Formål |
| 1 | Unstained | Unstained celler for normalisering i løpet flowcytometri |
| 2 | 7AAD | Å bestemme levedyktigheten under flowcytometri |
| 3 | + + + | Inneholder cellene som vil bli sortert |
| 4 | 34 + | Å samle CD34 + / CD19 +(Sent pro-B - tidlig pre-BI) celler |
| 5 | 45 lav | Å samle CD34 - / CD19 + / CD45 lav (pre-BI) celler |
| 6 | 45 med | Å samle CD34 - / CD19 + / CD45 MED (pre-BII) celler |
| 7 | 45 høy | Å samle CD34 - / CD19 + / CD45 høy (umodne B) celler |
Coat 4 rør, 5, 6, og 7 med 2% FBS og plassere alle rørene på is.
- Aspirer øvre plasma laget nøye og unngå kontakt med mononukleære cellelaget. Ved hjelp av en 10 ml glass pipette nøye overføre mononukleære cellelaget i nytt 50 ml konisk rør. Kombiner de mononukleære celler fra tre rør sammen i en enkelt 50 ml rør.
- Fyll røret med PBS, bland forsiktig og sentrifuger ved 300 xg i 10 minutter ved20 ° C. Nøye Aspirer supernatanten uten å forstyrre cellepellet. Gjenta 1x. Etter første vask, resuspender pellets og overføre til et enkelt 50 ml konisk rør.
- Forsiktig Resuspender cellepelleten i 200 ul PBS. Fjern en ul av cellesuspensjonen, legge det til 1 ml PBS i et 1,5 ml mikrosentrifugerør, og satt til side for å telle (telle celler etter å plassere 50 ml cellesuspensjon i sentrifugen). Fyll røret med PBS og sentrifuger ved 200 xg i 15 minutter for å fjerne blodplater. Supernatanten fjernes helt uten å forstyrre cellepellet.
2. Modifisert B-celle Isolasjon fra mononukleære celler bruker Mac Separasjon
- Resuspender pelleten fra trinn 1,7 med 160 pl kald (4 ° C) EDTA-PBS-buffer.
- Legg 40 pl B-KLL biotin antistoff cocktail. Pipetter å bland godt og inkuber i 10 min ved 4 ° C.
- Vask celler - tilsett 1 ml kald (4 ° C) EDTA-PBS buffer per 10 millioner celler (celle number bestemt i trinn 1.7) og sentrifuger ved 300 xg i 10 min. Aspirer supernatanten helt og Resuspender cellepelleten i 320 ul kald (4 ° C) EDTA-PBS-buffer.
- Legg 80 pl anti-biotin mikroperler, bland godt og inkuber i 15 min ved 4 ° C.
- Vask celler - tilsett 1 ml kald (4 ° C) EDTA-PBS buffer per 10 millioner celler og sentrifuger ved 300 xg i 10 min. Resuspender opptil 100 millioner celler i 500 ul kald (4 ° C) EDTA-PBS-buffer. Skala buffer volum i henhold til celle nummer.
- Forbered MACS Kolonner og MACS Avskillere under sentrifugering (trinn 2.5). Plassere en LS kolonne i det magnetiske feltet i MACS separatoren, tilsett 3 ml kald (4 ° C) EDTA-PBS buffer på kolonnen og la bufferen dryppe gjennom kolonnen. Bruk en beholder for å fange strømmen gjennom. Kast flyter gjennom.
- Plasser en 50 ml konisk rør nedenfor kolonnen og pipetteres cellesuspensjonen på kolonnen. La de umerkede cellene å dryppe through kolonnen og inn i 50 ml koniske rør. VIKTIG: Dette er de cellene som skal brukes for antistoff merking og celle sortering. Ikke kast flyten gjennom. Å gjenopprette alle cellene fra trinn 2.5, legge til en ekstra 1 ml kald (4 ° C) EDTA-PBS buffer til veggene av den koniske tube. Bland forsiktig og pipetteres gjenværende cellesuspensjon på kolonnen. Gjenta 1x. Fortsett til trinn 2,8 ved hjelp umerkede celler samlet i konisk tube etter passering gjennom kolonnen.
- Fyll konisk tube inneholdende umerkede celler med PBS og sentrifuger ved 300 xg i 10 min. Forsiktig fjerne supernatanten uten å forstyrre cellepellet. Tilsett 200 pl av EDTA-PBS-buffer og forsiktig resuspender cellene.
3. Antistoff Merking og klargjøring for Cell Sortering
- Aspirer 1 ul av cellesuspensjonen og fyll i røret merket "unstained" (Trinn 1.4). Tilsett 500 pl EDTA-PBS-buffer og lagre røret på is.
- Legge til 20ul av hver antistoff (CD19, CD34 og CD45) per million celler i gjenværende cellesuspensjonen. Bland godt og plasser røret i mørke i 30 min ved RT. CD antistoffer er lysfølsomme, komplett trinn 2-4 med lysene slått av.
- Etter 30 min inkubering med antistoffer, aspirer 40 pl av cellesuspensjonen og plasser den i røret merket "7AAD". Tilsett 1 ml PBS inn i røret og sentrifuger ved 500 xg i 2 min. Supernatanten fjernes og resuspender cellene i 100 pl bindingsbuffer. Legge 7 pl 7AAD (7-Aminoactinomycin D) og inkuber i mørke i 10 min ved RT. Under 10 min inkubasjon fullfører trinn 3.4.
- Legg PBS til toppen av røret som inneholder de gjenværende cellene merket med CD antistoffer. Sentrifuger røret ved 500 xg i 3 min. Supernatanten fjernes, tilsett 500 pl EDTA-PBS-buffer og resuspender cellepelleten. Overfør hele volumet av cellesuspensjonen i røret merket "+ + +". Å gjenopprette alle av cellesuspensjonen endd ytterligere 1 ml EDTA-PBS buffer til 50 ml koniske rør og overfør til røret merket "+ + +".
- Etter inkubering (trinn 3.3), tilsett 300 ul bindingsbuffer inn 7AAD tube. Den "unstained", "7AAD" og "+ + +" prøvene og "34 +", "45 low", "45 med" og "45 høy" rør er klar for flowcytometri.
4. Cell Sortering Bruke MoFlo XDP flowcytometeret
- Set-up MoFlo for sortering: Rett lasere; stabilisere dråpe stream, bestemme slipp forsinkelse.
- Forbered én farge kompensasjon kontroller ved hjelp Invitrogen ABC Mouse perle kit (eller lignende) i henhold til produsentens instruksjoner. Kjør én farge kontroller, justere spenninger av fluorescens kanaler for optimal separasjon av positive og negative populasjoner. Still kompensasjon koeffisienter og gjelder kompensert parameter til samlingen protokollen. Reetablere kompensasjon koeffisienter hver gang en ny rekke av antistoff oppnås.
- Opprett protokoll herunder plott som vist i figur 2.
- Kjør unstained prøve, satt spenning og gevinst for fremover og side scatter, og identifisere negative fluorescens populasjoner. Fordi DNA utvinning er målet for den slags, bør terskelen settes lavt (≤ 1%) slik at DNA-holdig avfall ikke forurense den gjenopprettede prøvene. * Sørg for at Aerosol evakueringssystem kjører til enhver tid som bor er humane celler blir kjørt på MoFlo.
- Kjøre en liten aliquot av + + + Prøve (~ 50.000 events) å angi gating strategi (figur 2). Fordi B-celle progenitors ikke spre identisk til modne B-celler, den backgate ungated CD19 + / CD34 + populasjonen på SSC vs FSC plott for å sikre den lymfocytt porten omfatter potensielle Pro-B-celler. Fra dette utvalget også sette negative fluorescens befolkningen for 7AAD.
- Kjør 7AAD prøven for å avgjøre prøven levedyktighet. Bare sortere celler fra en prøve med høy levedyktighet påbegynnelsen (≥ 95%) som døde celler vil farge ukritisk og kan forurense sorter populasjoner.
- Sett opp sorter beslutninger om å samle fire pasientgrupper: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 lav, CD19 + / CD34 - / CD45 med, og CD19 + / CD34 - / CD45 høy. Inkluder lymfocytt og doublet diskriminering porter i sorteringen beslutninger i alle befolkningsgrupper.
- For å unngå tilstopping i sortering spissen, filter + + + prøven gjennom en 40 mikrometer celle sil rett før sortering og re-filter hvis noen aggregering oppstår i prøven under slag.
- Sortere cellene inn samling rør (Trinn 1.4) belagt med 2% FBS i PBS i et avkjølt eller is-pakket rørholder.
- Umiddelbart etter sorter er fullført, trekke DNA.
Representative Results
Mellom prøven variasjon spiller en rolle i suksessen av cellen sort (tabell 1). Prøvene med god suksess priser har lave nivåer av forurensende avfall (figur 3A) og prøvene med dårlige suksess priser har høye nivåer av forurensende avfall (figur 3B). Mellom prøven variasjon kan noe styres hvis ledningen blodprøve ble tatt innen 24 timer av forsendelsen (O / N første prioritet).
Flyten sortert celler fra hver forløper B-celle undergruppe er av tilstrekkelig mengde og kvalitet til å utføre nukleinsyre isoleringer. DNA isolert er av høy kvalitet og kan brukes i nedstrøms analyser. Vi rutinemessig utnytte denne DNA i MIRA 11 å berike for denaturert DNA (figur 4).
| Cord Blood Facility data | Dårlig Sorter | |
| Arbeide blodvolum med Antikoagulerende (ml) | 110 | 104 |
| Hvite blodlegemer [10 3 / ul] | 8,68 | 11.19 |
| Lymfocytter [10 3 / ul] | 3,88 | 3,76 |
| Lymfocytt (%) | 44.70 | 33,6 |
| Røde blodlegemer [10 6 / ul] | 3,65 | 3,05 |
| In-house data | ||
| Cell Antall etter Ficoll-Paque | 206 M | 309 M |
| Cell Antall etter MACS Separasjon | 22 M | 16,5 M |
| Antall hendelser Count (MoFlo XDP) | 30.57 M | 19.97 M |
| Levedyktighet (%) | 98.00 | 98.00 |
| Celler i lymfocytt Gate (%) 17.00 | 50.00 | |
| CD19 + / CD34 + | ||
| Total Cell Number | 10959 | 48316 |
| % Av totalt hendelser | 0,04 | 0,24 |
| Effektivitet | 88% | 88% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 lav | ||
| Total Cell Number | 16619 | 26941 |
| % Av totalt hendelser | 0,05 | 0,13 |
| Effektivitet | 89% | 87% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 med | ||
| Total Cell Number | 469745 | 507540 |
| % Av totalt hendelser | 1,54 | 2,54 |
| Effektivitet | 89% | 89% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 høy | ||
| Total Cell Number | 1896062 | 2047142 |
| % Av totalt hendelser | 6.2 | 10.25 |
| Effektivitet | 91% | 90% |
Tabell 1. Representative celle sorter statistikk. Rader 1-5 er tellinger levert av ledningen blod anlegget. De resterende radene er data samlet inn i vårt laboratorium. De fattige sorter inneholdt høye nivåer av rusk og en lav prosentandel av celler i lymfocytt gate.
Figure en. Flytskjema over prosedyren. Navlestreng blod er behandlet og mononukleære celler isolert ved å bruke Ficoll-Paque pluss. En ekstra vasketrinn er inkludert for å fjerne kontaminerende blodplater. B-celler er isolert fra mononukleære celler ved hjelp MACS human B-celle isolasjon kit (B-CLL). Dette trinnet bruker biotin-konjugerte monoklonale antistoffer (CD2, CD4, CD11b, CD36, Anti-IgE og CD235a) for å fjerne alle ikke-B-celler. Den gjenopprettede B-celler er merket med CD19-APC, CD34-PE og CD45-FITC antistoffer deretter sortert ved hjelp av MoFlo XDP strømningscytometeret å gjenopprette forløperen B-celle undergrupper: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 lav , CD19 + / CD34 - / CD45 med, og CD19 + / CD34 - / CD45 høy.
Figur 2. Gating strategi for å identifisere og sortering popreguleringer. Røde piler indikerer gate som brukes på etterfølgende tomten. R4, R5, R6 og R7 porter indikerer sortert populasjoner. A) Forward vs side spredningsdiagram viser beriket lymfocytt befolkningen. R1, lymfocytt gate. B) Høyde vs bredde fremover spredningsdiagram for å identifisere enkeltceller versus dubletter. R2, enkelt celle gate. C) CD19-APC positive celler faller inn CD34-PE negative og positive populasjoner. R3, CD19 + / CD34 - gate, R4, CD19 + / CD34 + gate indikerer ønsket slags befolkning d) CD19 + / CD34 - celler faller inn i tre noe forskjellige CD45-FITC populasjoner.. R5 og R6, CD19 + / CD34 - / CD45 lav og CD19 + / CD34 - / CD45 MED populasjoner, henholdsvis. R7, på grunn av høye celle tall i CD19 + / CD34 - / CD45 høy befolkning, omfatter denne typen gate kunen del av befolkningen. Alle cellene i denne befolkningen ikke må hentes for nedstrøms analyser.
Figur 3. A) Lave nivåer av forurensende avfall etter kolonne berikelse. R1, lymfocytt gate. B) Høye nivåer av forurensende avfall etter kolonne berikelse.
Figur 4. Anrikning av denaturert DNA fra undergrupper av forløper B-celler. A) sonikert DNA isolert fra forløperen B-celle undergrupper er av høy kvalitet. For bibliotek konstruksjon DNA sonikert til et gjennomsnitt på 200-600 bp. Felt 1: Promega 100 bp stige (katalog # G2101), felt 2: Total DNA isolert fra CD19 + / CD34 + celler, Lane 3: Totalt DNA isolert fra CD19 + - / CD45 lavpris celler; Lane 4: 100 ng DNA isolert fra CD19 + / CD34 - / CD45 MED celler; Lane 5: 100 ng DNA isolert fra CD19 + / CD34 - / CD45 høye celler. DNA ble sonikert med Diagenode Bioruptor på Internett for totalt 9 min (30 sek PÅ; 30 sek AV). DNA var kolonnen renset og visualiseres på en 1% agarose-gel med SYBR grønn nukleinsyre gel flekken. B) Etter MIRA bruke ActivMotif MethylCollector Ultra kit, PCR med SLC25A37 (1-6) og APC1 (7-12) er utført for å bekrefte anrikning av denaturert DNA. 1 & 7: sonicated genomisk DNA (ingen MIRA), 2 og 8: MIRA-CD19 + / CD34 + DNA, 3 og 9: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 lav DNA, 4 & 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 med DNA, 5 & 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 høy DNA, 6 og 12: Vann kontroll. Høyere forsterkning av SLC25A37 bekrefter anriking av denaturert DNAi undergrupper av forløper B-celler.
Discussion
Faktoren med størst innvirkning på suksessen protokollen er tilstedeværelsen av forurensende avfall. Hvis be blod fra en ledningen blod bank er det viktig å ha blodet sendes så snart som mulig etter innsamling. I tillegg er prøvene som er klassifisert som lymfocytose inneholde høyere antall lymfocytter, men ikke disse prøvene ikke ha et tilstrekkelig antall forløper B-celler, og bør ikke brukes. Å øke sannsynligheten for å få et tilstrekkelig antall celler for hver av forløperen undergrupper vi anbefalt begynner med minst 85 ml navlestrengsblod.
Det er viktig å merke seg at i motsetning til voksen perifert blod separasjoner, når fraksjonering navlestrengsblod det mononukleære lag ofte forurenset med røde blodceller 12. Denne protokollen omfatter en ekstra vasketrinn for å fjerne kontaminerende blodplater. Protokoller som beskriver mononukleære separasjoner fra navlestrengsblod foreslår blant annet en lysis steg to fjerne uønskede røde celler. Vi anbefaler ikke dette trinnet fordi den produserer forurensende rusk og har en negativ innvirkning på suksessen av cellen slag.
For å redusere antall celler som må skilles ved strømningscytometri er det nødvendig å utføre en B-celle oppformering før celle-sortering. Protokollen levert av Miltenyi Biotec, som følger med B-Cell Isolation Kit (B-KLL), har blitt optimalisert for perifert blod og anbefaler å bruke 10 pl B-KLL biotin antistoff cocktail per 10 millioner celler. Dette trinnet bruker antistoffer mot CD2 (T-celler, NK-celler), CD4 (T-celler), CD11b (granulocytter, monocytter, makrofager), CD16 (NK-celler, makrofager, mastceller), CD36 (trombocytter), CD235a (erytroide celler) å utarme ikke-B-celler fra navlestrengsblod. Det er viktig å bruke settet beskrevet og ikke B-celleisolasjon kit II fordi tidligere pakke inneholder et antistoff mot CD43, som er til stede på pro-B-celler. Under op vårtimization av denne protokollen, fant vi ut at totalt 40 pl av B-KLL biotin antistoff cocktail er tilstrekkelig til å gi et positivt celle slags resultat. I tillegg har vi funnet at ved hjelp av så lite som 5 ul mer av B-CLL biotin antistoff cocktail hadde negative effekter på celle sorter. Derfor anbefaler vi å bruke 40 pl av B-KLL biotin antistoff cocktail for totalt mononukleære celle tall mellom 175-250 millioner. Om start med lavere eller høyere antall celler kan det være nødvendig å skalere reagensene tilsvarende.
Det er mange motstridende publikasjoner beskriver markører som kan brukes til å skille delpopulasjoner av B-celler. Mesteparten av avviket kan forklares med det faktum at differensiering er en kontinuerlig prosess, og at nærvær eller fravær av celleoverflaten markører forekommer i gradvis måte i stedet for i en alt eller ingenting måte. I denne protokollen CD34 - / CD19 + og intensiteten nivået på CD45 + (lav, middels, høy) uttrykk ble benyttet for å skille pre-BI, pre-BII og umodne B-celler med en økning i nivået av CD45 uttrykk tilsvarer utviklingen av differensiering 6. Pro-B-celler er blitt beskrevet av noen å være CD19 + / CD34 + 13 mens andre har vist at pro-B-celler er CD19 - / CD34 + og pre-BI celler er CD19 + / CD34 + 9,10. Basert på disse avvikene har vi utpekt de CD19 + / CD34 +-celler som sen pro-B-celler / tidlig pre-BI celler. Det er viktig å merke seg at denne strategien ble utviklet for å isolere undergrupper av forløper B-celler som tilsvarer cellene berørt av sykdommen akutt lymfatisk leukemi. Det er imidlertid flere sorterings strategier som kan anvendes avhengig av celle undertype av interesse.
Antistoff-fluorokrom kombinasjoner skal velges basert på egenskapene til den tilgjengelige celle sorter. Som en generasjonl regel den smarteste fluorokrom i panelet skal brukes til å merke minst folkerike antigen og vice versa. I å oppdage dobbel-farget populasjoner, spesielt sjeldne hendelser som disse, er dublett diskriminering (figur 2B) en svært viktig del av gating strategi. Dette sikrer at dobbel-positive hendelser er virkelig enkeltceller farget med både antistoffer og ikke bare to single-fargede celler festet til hverandre.
Høy hastighet, 4-veis celle sortering skaper nødvendigvis en kontrollert aerosol miljø. Derfor bør levende menneske celle sortering utføres med stor forsiktighet. Publisert sikkerhet og dekontaminering retningslinjer er tilgjengelig og bør gjennomgås og implementeres før den slags 14. Godkjenning fra institusjonelle biosikkerhet komiteer eller deres ekvivalenter kan være nødvendig før sortering. For riktig dekontaminering etter sortering, bør blekemiddel tilsettes avfallsbeholderen til en endelig konsentrasjon på 10%. Similarly, bør alle prøvene tubing samt alle overflater i nærområdet dekontamineres grundig med en nystekte gjort 10% blekemiddel.
Oppsummert gir denne protokollen en strategi for å oppnå sjeldne populasjoner av forløper B-celler og kan bli modifisert til å isolere sjeldne populasjon tilstede i ledningen blod inkludert hematopoetiske stamceller og umodne T-celler. Nylig, har umodne B-celler blitt identifisert i perifert blod av individer med fremskredet HIV 15. Derfor utvider nytten av denne metoden utover studiet av blod kreft. Endelig har vi ennå ikke utført RNA isoleringer på flyten sortert celler, men bør denne metoden kunne tilpasses med det forbeholdet at under celle sortering cellene skal sorteres direkte inn trizol eller tilsvarende RNA kompatibel løsning som RLT fra RNeasy kit tilgjengelig gjennom Qiagen.
Disclosures
Forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NCI R00 CA132784) til KT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
- Song, F., et al. Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression. PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).
- Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells. Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).
- Brown, G., et al. The sequential determination model of hematopoiesis. Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).
- Clark, P., et al. Lymphocyte subsets in normal bone marrow. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).
- Loken, M. R., et al. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).
- Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. B-cell precursors in normal pediatric bone marrow. American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).
- Tucci, A., et al. Are cord blood B cells functionally mature? Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).
- Ghia, P., et al. Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci. J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).
- Noordzij, J. G., et al. Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children. Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).
- van Zelm, M. C., et al. Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression. J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).
- Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. The MIRA method for DNA methylation analysis. Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).
- Kanof, E. M., et al. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Suppl 19. 7.1.1-7.1.7 (1996).
- LeBien, T. W. Fates of human B-cell precursors. Blood. 96 (1), 9-23 (2000).
- Schmid, I., et al. International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells. Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).
- Malaspina, A., et al. Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7. PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).
