Summary
Human cytomegalovirus (HCMV) infeksjon av nyfødte er en viktig årsak til mental retardasjon, men de molekylære hendelser som fører til virus-indusert patogenesen er fortsatt dårlig forstått. For å undersøke dynamikken i hjernen infeksjon, tilpasset vi hele dyr
Abstract
Human cytomegalovirus (HCMV eller HHV-5) er en livstruende patogen i immun-kompromittert personer. Ved medfødt eller neonatal infeksjon, kan viruset infisere og gjenskape i utviklingen av hjernen, som kan gi alvorlige nevrologiske skader, inkludert døvhet og mental retardasjon. Til tross for de potensielle alvorlighetsgraden av symptomene, er de terapeutiske muligheter begrenset av utilgjengelighet av en vaksine, og fraværet av en spesifikk antiviral terapi. Videre er en nøyaktig beskrivelse av de molekylære hendelser som skjer i løpet av infeksjon av sentralnervesystemet (CNS) fortsatt mangler siden observasjoner for det meste stammer fra den obduksjon av infiserte barn. Flere dyremodeller, for eksempel rhesus macaque CMV, har blitt utviklet og gitt viktig innsikt i CMV patogenesen i CNS. Imidlertid, til tross for sin evolusjonære nærhet med mennesker, ble denne modellen er begrenset av det intrakraniale inokuleringen prosedyren brukt for å infisere dyrene og ulemperistently indusere CNS infeksjon. Videre har etiske hensyn fremmet utviklingen av alternative modeller, blant annet neonatal infeksjon av nyfødte mus med mus cytomegalovirus (mCMV) har nylig ført til betydelige fremskritt. For eksempel, ble det rapportert at intraperitoneal injeksjon av mCMV til Balb / c nyfødte fører til infeksjon av neuroner og glialceller i bestemte områder av hjernen. Disse funnene antydet at eksperimentell inokulering av mus kan rekapitulere underskudd indusert av HCMV infeksjon hos barn. Ikke desto mindre er en dynamisk analyse av mCMV infeksjon av nyfødte vanskelig å utføre fordi den klassiske metode krever at man ofrer en betydelig antall dyr ved forskjellige tidspunkt for å analysere den virale belastning og / eller immun-relaterte parametere. For å omgå denne flaskehalsen og for å muliggjøre fremtidige undersøkelser av sjeldne muterte dyr, søkte vi in vivo avbildning teknologi for å utføre en tid-retters analyse av viral formidling i hjernen ved perifer injeksjon av en rekombinant mCMV uttrykke luciferase til C57BL / 6 nyfødte.
Introduction
Humant cytomegalovirus (HCMV/HHV-5) er et medlem av herpes-virus β-familien. HCMV er en svært utbredt, opportunistisk patogen som vanligvis ervervet tidlig i livet som en asymptomatisk infeksjon en. Som alle herpesvirus, vedvarer HCMV gjennom hele levetiden av verten som immunsystem tett styrer virusreplikasjon. Episoder med viral reaktivering meste skjer hos immunsupprimerte individer som transplanterte pasienter som får medisiner for å forebygge pode avvisning to. Hos voksne, har HCMV også vært knyttet til glioblastomas tre. I tillegg er HCMV en fremtredende patogen for nyfødte med umoden immunitet 4-6. Primær infeksjon i fosteret eller det nyfødte barnet kan ha alvorlige konsekvenser. HCMV infeksjon er den vanligste smittsomme årsak til medfødte misdannelser og barndommen lidelser i utviklede land. Det er anslått at forekomsten av neonatal HCMV infeksjon påvirker 0,5-1% of alle levendefødte hvorav 5-10% vil lide av alvorlige symptomer som microcephaly eller lillehjernen hypoplasia. I tillegg vil 10% av de infiserte spedbarn med subklinisk virusinfeksjon senere utvikle sequellae fører til mental retardasjon, hørselstap, visuelle defekter eller beslag og epilepsi 7,8.
I motsetning til andre humant herpes slik som herpes simplex 1 (HSV-1/HHV-1) som kan inokulert til mus via forskjellige ruter for injeksjon 9, er cytomegalovirus replikasjon arts-spesifikk. Denne funksjonen har sterkt hemmet undersøkelser av HCMV patogenesen som er utført i ulike dyremodeller (mus, rotte, marsvin, rhesus ape) og deres respektive ekte vertsspesifikke CMVs. Alle CMVs vise betydelige likheter i genomet størrelse og organisering, vev tropismeanalyse og regulering av genuttrykk. De har også indusere lignende patologi i sine respektive vert. Til tross for genomisk diversitet væretween HCMV og mus cytomegalovirus (mCMV) (50% av ORF'er som er tilstede i human virus er identifisert i det murine CMV), har musemodell nylig vist seg å være fordelaktig, hovedsakelig fordi mutantstammer kan bli testet for deres evne til å kontrollere viral replikasjon in vivo. Dette har ført til en genetisk skjerm som gjorde en estimering av antall mus gener uttrykt i det voksne stadiet som utgjer "resistome" til dette viruset ti. Samlet tilsier dette at mCMV-infiserte mus representerer en attraktiv modell for studiet av host-virus interaksjoner hos voksne. Utforskning av medfødt CMV-infeksjon er mer komplisert fordi forskjeller i placenta lag organiseringen mellom menneske og mus svekke mor til foster overføring av viral infeksjon i mus. Nylig har direkte innsprøyting av mCMV i morkaken på dag 12.5 av svangerskapet aktivert hjerne infeksjon av mus nyfødte som førte til nedsatt hørsel 11. Men de fleste jegnvestigations nå bruke intraperitoneal injeksjon av 4-20 timer gamle nyfødte for å gi systemiske viral spredning kan føre til hematogenous hjerne infeksjon, en modell som er mer relevant enn for en intrakranial injeksjon. Denne protokollen gitt viktig innsikt inn i CMV-patogenese og mer spesielt, ble det vist at mCMV infeksjon hos nyfødte resulterer i viral replikasjon i neuronale og glial celler lokalisert i inflammatoriske foci som er infiltrert med mononukleære celler som makrofager 12. Denne rapporten også beskrevet endret morphogenesis av lillehjernen akkompagnert med redusert kornet nervecellen spredning og migrasjon og induksjon av flere interferon-stimulert gener. Den viktige rolle av CD8 + T-celler for kontroll av mCMV i sentralnervesystemet ble også rapportert av samme gruppe 13.. Et viktig aspekt å vurdere når analysere den patologiske effekten av en mikrobe er dynamikken i infisereion. I tilfelle av mCMV, er det spesielt viktig å utforske og kvantifisere progresjon av viral spredning inn i utviklingen av hjernen for å forstå og forutse omfanget av de fremtidige synaptisk skader. Tradisjonelt krever kvantifisering av progresjonen av en infeksjon det faste ofring av infiserte dyr til titeren patogenet i vev, for eksempel hjerne, som ellers er utilgjengelige. Denne typen protokollen er nå utfordret av nødvendig forbedring av dyrevelferd og 3R (Reduser, begrensning, Erstatt) prinsipper 14. Ved hjelp av in vivo avbildning teknologiene kan medføre at en drastisk reduksjon av det antall dyr som er nødvendig i in vivo infeksjon eksperimenter. Her rapporterer vi og beskrive en tid-retters analyse av viral spredning inn i hjernen ved intraperitoneal mCMV-Luc injeksjon til mus nyfødte. Ved hjelp av de samme dyrene, sporet vi og overvåkes in vivo områder med intens viral replikasjon i løpet av en to-ukers periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av Viral Suspension
- Skaff Smith stamme av mCMV uttrykke Luciferase (mCMV-Luc 15) fra Ulrich Koszninowski laboratorium. I denne rekombinant, er luciferase-genet insatt i IE2-lokuset av mCMV genomet.
- Å forsterke mCMV-Luc, infisere en murine benmarg stromal cellelinje (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) med mCMV på ulike mangfold av infeksjon (MOI 0,001 mot 1) 16. For dette, tilsett viruset til dyrkede celler i serum-fritt medium ved 37 ° C. Etter en time, fjern supernatanten og erstatte den med DMEM supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS). Fem dager senere høste kulturmediet og lagre aliquoter ved -80 ° C inntil videre bruk.
- Titrering av den virale suspensjon av plakk-analyse.
- Split 3T3-celler (ATCC # CRL-1658) i en 24 brønn plate med 40000 celler / brønn i 1 ml DMEM supplert med 10% FCS inneholdende penicillin (200 IU / ml) og steptomycin (200 mg / ml) Og inkuberes 24 timer ved 37 ° C.
- Forbered seriefortynninger (10 -1 til 10 -8) av en alikvot av mCMV suspensjon i DMEM og infisere målceller (3T3) med 200 ul av fortynningen etter fjerning cellekulturmedium. Inkuber 1 time ved 37 ° C. Tilsett 1 ml av Top Medium (DMEM 3% FCS, 2% (v / v) gentamycin, 200 IU / ml penicillin, 200 mg / ml streptomycin, 8 g / l karboksymetylcellulose) og inkuber 5 dager ved 37 ° C.
- Fikser cellene ved tilsetning av 200 mL 10% formaldehyd (fortynning av formaldehyd med vann bør gjøres i en kjemisk hette for å unngå toksiske inhalasjoner) til hver brønn, og inkubering 6 t ved romtemperatur. Fjern kulturmedium + fixator ved pipettering ut og tilsett 200 ul cellefarging-løsning (1% krystall fiolett (vekt / volum) i 20% etanol). Før bruk, fortynne en del med 9 deler milli-Q vann. Inkuber 2 min ved romtemperatur, vaske platen 3-4x ved å dyppe den i vann, la tørke og telle antall plaketter med en kikkert.
<li> Tynn mCMV-Luc i DMEM å få 50 PFUs i 50 ul og la på is inntil videre bruk. Bruk av høyere viral Inokulant induserer dødelighet før de nyfødte nå 2-3 ukers alder. I vår erfaring, 500 PFUs indusere dødelighet i hvert nyfødte 5 til 7 dager etter injeksjon.
2. Injeksjon av Nyfødte
- Når nyfødte (4 til 20 timer gamle mus) er tilgjengelige, manipulere søppel og avføring i buret med hansker før nøye håndtering valpene for å unngå forurensning med "fremmed" lukt som ville understreke mor og indusere avvisning av valpene .
- Utfør en intraperitoneal injeksjon ved hjelp av en insulin sprøyte (29 g) som vist i Figur 1A. Hold nyfødte med dorsal huden. Med ventral siden opp, innføre nålen under forben og skyv den forsiktig subkutant å oppnå bukhulen (litt under navlen). Vi har for tiden injisere 1% Metylenblått fortynnet i DPBS og overvåke overlevelse til practice teknikken før du utfører virusinfeksjoner. Siden Metylenblått er godt synlig under injeksjonen prosessen, anbefaler vi å utføre denne "treningen" injeksjon først for å sikre riktig levering av viral suspensjon i intraperitoneal hulrom.
- Eliminere de små blod dråper som kan oppstå og plassere den nyfødte tilbake i buret.
3.. In vivo avbildning
- På dag 7, håndtere nyfødte med samme forsiktighetsregler som tidligere nevnt. Injiser intraperitonealt en blanding av anestetika (4 mg / ml ketamin, 0,8 mg / ml xylazin) og luciferin (0,15 mg / g kroppsvekt) i 50 pl i hvert dyr. Gjennomsnittlig kroppsvekt av dyrene er 1-2 g og dosen av bedøvelse per dyr er: ketamin 40 mg, xylazin 8 ug Vent i 12-15 min før luciferin når sin maksimalt utslipp. Dette må bestemmes på forhånd og er avhengig av luciferin leverandøren og avbildningssystem benyttes.
- Mens valpene er anesthetized, merke dem for senere identifikasjon og høste et lite stykke vev som så kan brukes for fremtidig genotyping hvis muterte dyr blir anvendt.
- Plasser valpene i imaging system og utfører oppkjøpet av lys slippes ut av hele kroppen. Syv dager etter smitte, har viruset kopiert inn i mange eksemplarer i målet organer som lever, nyrer, lunger og spyttkjertler, og derfor bør varigheten av eksponeringen være kort. I vårt tilfelle, utfører vi kjøpet for 10 til 20 sek (figur 1B). Plattformen kjøpet i kammeret til bildebehandlingsenheten trenger å bli oppvarmet for å unngå overdreven avkjøling av kroppstemperatur på bedøvede dyr. I tillegg, er det nyttig å oppnå bilder med lav oppløsning fra flere dyr innen en runde i anskaffelse og deretter komme seg opp i plattformen nærmere kameralinsen for å fokusere på en del av et bestemt dyr eller et isolert organ etter disseksjon. Programvaren må aktivere raske endringerav parametrene (eksponeringstid, avstand sample / objektiv, sensitivitet), kvantifisering av definerte regioner av interesse og fremtidig eksport av snapshot bilder.
- For å skaffe lyssignal fra hodet bare, dekke kroppen av de nyfødte som ligger lateralt med et tykt, mørkt papir som vil maskere fotoner på nivået av organene hvor høy viral replikasjon finner sted (lever, lunge, spyttkjertler) og utføre oppkjøp for 5 til 10 min (figur 1C). Utfør kjøpet av de motstående side av dyret i de samme forhold.
- Gjeninnføre valpene inn i buret og plassere en varmelampe på toppen for å unngå overdreven kjøling av bedøvet nyfødte. Regelmessig overvåke post-bedøvelse utvinning. Med den angitte dose, varer anestesi for tiden 30 min.
- Gjenta samme prosedyre på dager 9, 11 og 14. På dager 11 og 14, endre dosen av anestetika (6 mg / ml ketamin, 1,2 mg / ml xylazin).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et representativt eksperiment er vist i figur 1.. Ved intraperitoneal injeksjon av 50 PFUs av mCMV-Luc (Panel A viser en lignende injeksjon utføres med Metylenblått å visualisere subkutant av nålen), var nyfødte bedøvet og fikk samtidig 0,3 mg av luciferase substrat (Luciferin, Caliper). Femten minutter senere, ble dyrene plassert ventral siden opp i oppkjøpet kammer av IVIS 50 (In Vivo Imaging System, Caliper) og lyset slippes ut av hele dyret ble fanget under en 10 sek eksponering. Panel B viser snapshot bilder tatt på dager 7, 9, 11 og 14 med programvaren (Leve 3.2 Image, Caliper) dedikert for analysen. Bildene ble kalibrert med samme innstillinger: Max utslipp er satt til 10 syv fotoner per sekund (p / sek) og min ved 10 6 p / sek. Fra disse bildene, ser det ut til at den samlede viral titer på hele dyret avtar over tid. Kvantifisering av den luminescens utført med den samme programvare bekrefter denne observasjon (ikke vist). Deretter vi dekket hele kroppen, med unntak av hodet, til dyret med et tykt, mørkt papir som hindrer de fotoner som sendes ut av organer som lunger, lever, nyrer og spyttkjertler å kunne detekteres med det digitale kameraet. Dette muliggjør lengre eksponering (5 min i vårt tilfelle) og avdekker en diskret sted på nivået av det venstre øret hvis intensiteten øker mellom dag 7 og dag 14 (panel C). Et signal vises også ved den nedre kjeve og nese på dyret. Bilder ble satt med en Max på 2000 p / sek og Min på 100 p / sek. Dette eksperiment, utført på samme dyr mellom dag 0 og dag 14, viser at utviklingen av virusinfeksjonen kan bli registrert og kvantifisert med denne teknologien, og at spredningen av mCMV til hjernen kan dynamisk observeres in vivo.
1.jpg "/>
Figur 1. Tid-retters analyse av et representativt mus neonate eksperimentelt infisert med en selvlysende cytomegalovirus. A. Intraperitoneal metylenblått injeksjon hos nyfødte. Det forstørrede bildet (høyre) viser den subkutane banen til injeksjon på brystkassen. B. In vivo avbildning av samme neonate fra dag 7 til dag 14 etter mCMV-Luc injeksjon. Luminescence fra hele dyret er bedøvet visualisert ved luciferin injeksjon og 10 sek eksponering. C. Luminescence slippes ut av hodet (venstre side) av samme dyr på dagene 7-14. Bråkjøling av fotoner fra resten av legemet med et mørkt papir muliggjør lengre eksponering (5 min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av in vivo imaging teknologi for å overvåke mCMV-Luc formidling i mus nyfødte, kunne vi observere viral spredning til hjernen av muterte dyr, i motsetning til vill-type. Ytterligere disseksjon av dyret og ex vivo avbildning av hjernen bekreftet tilstedeværelsen av luminescerende virus i det sentrale nervesystemet. I tillegg har vi også utført immunhistokjemi (ikke vist) på hjernen tynne snitt med et antistoff spesifikt for mCMV E1 tidlig protein og observerte at faktisk er mCMV stede i de samme områdene som de hvor luminescens ble oppdaget, noe som indikerer at makroskopiske visualisering av lyset slippes ut av hele, levende bedøvet dyr gjenspeiler faktisk karakteristikk av viral infeksjon som oppstår in vivo.
En slik analyse har vært mye brukt for voksne dyr, for eksempel til å overvåke tumorvekst ved implantasjon av selvlysende celler. I vårt tilfelle, var utfordringen å bruke neonates til hvilken den gassformige anestesi med isofluran levert til dyret inne ervervet kammer ikke var mulig av tekniske årsaker. Derfor ble vi tvunget til å bruke ketamin / xylazin injeksjon og vi tilpasset dosen til den lille størrelsen på nyfødte. Vi har også håndtert valpene nøye for å unngå risiko for avvisning av sin mor. Ved å følge anbefalingene og doser som er beskrevet her, og som er avgjørende for en trygg manipulasjon og utfallet av valpene, anestesi av nyfødte blir et alternativ levedyktig alternativ som gjør at lange perioder med immobilitet som kreves for å utføre in vivo imaging.
Videre, fordi luminescens nivå kan kvantifiseres med passende programvare, demonstrerte vi at progresjon av infeksjonen i løpet av en to-ukers periode er kjennetegnet ved en redusert virusmengde i peritonealhulen organer (lever, milt, nyrer) og lungene mens viruset spres i hjernen kan gradvis bli dokumentert. Ther observasjon, som kan bli lagt merke til i muterte dyr og ikke i kontrollene, vil bli dokumentert med flere detaljer og en statistisk analyse i et manuskript i forberedelsene der naturen av det muterte genet vil også bli diskutert. Likevel utgjør vår bildebehandling metoden en betydelig forbedring i forhold til de klassiske teknikker som krever aktiv dødshjelp av flere dyr for hvert tidspunkt, etterfulgt av tid-og ressurskrevende metoder (plakk analysen eller kvantitativ PCR) for å måle viral titere i homogenates forberedt fra ulike organer ved disseksjon. Dette er også i tråd med de etiske prinsippene dyreforsøk som krever konstant innsats for å redusere tallene tilstrekkelige for å nå statistisk signifikans. Endelig er en annen fordel ved å følge samme dyr (merket ved dag 7) under hele varigheten av forsøket for å redusere inter-individuelle variasjoner. Som et resultat gjøres kvantifisering ved hvert tidspunkt (dagene 7, 9, 11 og 14) performed på en gruppe av seks nyfødte forbedrer statistisk signifikans av resultatene (data ikke vist).
For tiden bruker vi denne metoden for å analysere effekten av mutasjoner i mus på formidling av mCMV og et manuskript for tiden i forberedelse rapporter utvidet viral spredning i hjernen av muterte dyr. Vår erfaring tilsier at å sammenligne en gruppe på 5-6 mutanter med en tilsvarende gruppe av kontroll nyfødte gir høy kvalitet og betydelige data. Vi vet ikke, men anser denne metoden egnet for screening av phenodeviants generert av en tilfeldig mutagenese program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse.
Etikk uttalelse
Dyr ble vedlikeholdt under patogen-frie forhold i dyr omsorg innretningen av Institut d'Immunologie et d'Hématologie. Håndtering av mus og eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til fransk lov for beskyttelse av forsøksdyr. Prosedyren ble godkjent av tjenesten Veterinaire de la Préfecture du Bas-Rhin (Frankrike) under autorisasjonsnummer A-67-345.
Acknowledgments
Vi takker Lee Tuddenham (IBMC, Strasbourg) for å forsterke og titrering mCMV-Luc og Thomas Baumert (INSERM U748, Strasbourg) om tillatelse til å bruke Dyreavdelingen ved Institutt for virologi. Økonomisk støtte fra INSERM, Université de Strasbourg og Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) er bekreftet. Den første deltakelse av Sonia Beroud og Laetitia LELIEUR under Master prosjekt er også anerkjent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylen blue | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulin needles | VWR | 613-4897 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15070 | |
| carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer | ||
References
- Loewendorf, A., Benedict, C. A. Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything. J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).
- Lischka, P., Zimmermann, H. Antiviral strategies to combat cytomegalovirus infections in transplant recipients. Curr. Opin. Pharmacol. 8, 541-548 (2008).
- Johnsen, J. I., Baryawno, N., Soderberg-Naucler, C. Is human cytomegalovirus a target in cancer therapy? Oncotarget. 2, 1329-1338 (2011).
- Morein, B., Abusugra, I., Blomqvist, G.
- Zaghouani, H., Hoeman, C. M., Adkins, B. Neonatal immunity: faulty T-helpers and the shortcomings of dendritic cells. Trends Immunol. 30, 585-591 (2009).
- Morein, B., Blomqvist, G., Hu, K.
- Cheeran, M. C., Lokensgard, J. R., Schleiss, M. R. Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention. Clin. Microbiol. Rev. 22, 99-126 (2009).
- Tsutsui, Y. Effects of cytomegalovirus infection on embryogenesis and brain development. Congenit. Anom. (Kyoto). 49, 47-55 (2009).
- Sancho-Shimizu, V., et al. Genetic susceptibility to herpes simplex virus 1 encephalitis in mice and humans. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 7, 495-505 (2007).
- Crozat, K., et al. Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis. Mamm. Genome. 17, 398-406 (2006).
- Juanjuan, C., et al. Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment. Virol. J. 8, 70 (2011).
- Koontz, T., et al. Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system. J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).
- Bantug, G. R., et al. CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals. J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).
- Sacher, T., et al. The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo. Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).
- Lutarewych, M. A., et al. Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4). J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).
