Summary
신생아 인간의 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV) 감염은 정신 지체의 중요한 원인을 나타내는, 아직 바이러스에 의한 발병으로 이어지는 분자 이벤트가 여전히 제대로 이해하고 있습니다. 뇌 감염의 역학을 조사하기 위해, 우리는 전체 - 동물의 적응
Abstract
인간 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV 또는 HHV-5) 면역 손상 개인의 생명을 위협하는 병원체이다. 선천성 또는 신생아 감염되면, 바이러스는 감염 및 청각 장애, 정신 지체 등 심각한 신경 손상을 야기 할 수 두뇌 개발에 복제합니다. 증상의 잠재적 인 심각성에도 불구하고, 치료 옵션이 백신은 특정 바이러스 치료의 부재의 가용성에 의해 제한됩니다. 관찰은 주로 감염된 아이의 부검에서 파생 있기 때문에 또한, 중추 신경계 (CNS)의 감염 중에 발생하는 분자 사건의 정확한 설명은 아직 부족하다. 같은 붉은 털 원숭이 짧은 꼬리 원숭이 CMV 등 여러 동물 모델, CNS에서 CMV의 병인으로 발전하고 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 그러나 인간과 진화의 근접에도 불구하고,이 모델은 동물과 단점을 감염하는 데 사용되는 두개 접종 절차에 의해 제한되었다istently CNS 감염을 유도. 또한, 윤리적 마우스 사이토 메갈로 바이러스 (MCMV) 신생아 생쥐의 신생아 감염이 최근 크게 발전하게되었다 그중, 다른 모델의 개발을 추진하고있다. 예를 들어, 그것은 글루 Balb / C 신생아에 MCMV의 복강 내 주입은 뇌의 특정 영역에있는 뉴런과 glial 세포의 감염에 이르게 것을보고 하였다. 이러한 연구 결과는 생쥐의 실험 접종은 어린이 HCMV 감염에 의해 유발 적자를 요점을 되풀이 할 수 있다고 제안했다. 그럼에도 불구하고, 신생아의 MCMV 감염의 동적 분석은 고전적인 방법은 바이러스 성 부담 및 / 또는 면역 관련 매개 변수를 분석하는 서로 다른 시간 지점에서 동물의 상당수의 희생을 필요로하기 때문에 수행하기가 어렵습니다. 이 병목 현상을 회피하고 희귀 한 돌연변이 동물의 향후 조사를 가능하게하기 위해, 우리는 비라의 시간 코스 분석을 수행하기 위해 생체 내 이미징 기술 적용C57BL / 6 신생아에 루시 페라 제 표현하는 재조합 MCMV의 말초 주입시 뇌의 L 보급.
Introduction
인간 거대 세포 바이러스 (HCMV/HHV-5)는 β-헤르페스 가족의 구성원입니다. HCMV는 일반적으로 무증상 감염이 1로 초기 생활하는 동안 획득 매우 유행, 기회 병원균이다. 모든 헤르페스 바이러스와 마찬가지로, HCMV는 면역 체계를 단단히 바이러스 복제를 제어하는 호스트의 전체 수명 동안 지속됩니다. 바이러스 재 활성화의 에피소드는 대부분 같은 이식 거부 2을 방지하기 위해 약물을받는 이식 환자와 같은 면역 개인에서 발생합니다. 성인, HCMV는 교종 3에 연결되어 있습니다. 또한, HCMV는 미성숙 한 면역 4-6 신생아 눈에 띄는 병원체이다. 개발 태아 또는 신생아의 주 감염은 심각한 결과를 가질 수 있습니다. HCMV 감염은 선진국의 선천적 결함과 어린 시절 장애의 가장 흔한 감염 원인입니다. 그것은 신생아 HCMV 감염의 빈도는 0.5 % O에 영향을 미치는 것으로 추정된다F ~ 10 %가 같은 소두증 또는 소뇌 형성 부전 등의 심각한 증상으로 고생되는 가운데 모든 출산. 또한, 무증상 바이러스 감염에 감염된 유아의 10 %는 나중에 손실, 시각적 결함이나 발작과 간질 7,8 청각, 정신 지체로 이어지는 sequellae을 개발합니다.
로 주입 9 다른 경로를 통해 마우스에 접종 할 수있는 등 단순 포진 1 (HSV-1/HHV-1)와 같은 다른 인간 헤르페스 바이러스에 반대, 사이토 메갈로 바이러스 복제는 특정 종이다. 이 기능은 심각하게 다른 동물 모델에서 수행되는 HCMV의 발병의 조사를 방해 (마우스, 쥐, 기니피그, 붉은 털 원숭이)과 각각의 정품 호스트 관련 CMVs있다. 모든 CMVs 게놈의 크기 및 조직, 조직 친 화성 및 유전자 발현의 조절에 상당한 유사성을 나타냅니다. 또한 각각의 호스트에있는 유사한 병리를 유발. 에도 불구하고 게놈 다양성은 수사이 HCMV 및 마우스 사이토 메갈로 바이러스 (MCMV) (ORF를 50 % 쥐 CMV에서 확인 된 인간의 바이러스에 존재)는 마우스 모델은 최근 대부분의 돌연변이 변종이 바이러스를 통제 할 수있는 능력을 테스트 할 수 있기 때문에 유리한 것으로 판명되었습니다 생체 내에서 복제. 이것은이 바이러스 10 "resistome"를 구성하는 성인 무대에서 표현 마우스 유전자의 수의 추정을 가능하게 유전 화면되었다. 모두이는 MCMV에 감염된 생쥐는 성인의 호스트 바이러스 상호 작용의 연구를위한 매력적인 모델을 나타냅니다 나타냅니다. 인간과 생쥐 사이의 태반 층 조직의 차이가 생쥐의 바이러스 감염의 어머니에 태아 전송을 방해하기 때문에 선천성 CMV 감염의 탐험은 더 복잡합니다. 최근 임신 일 12.5에 태반 MCMV 직접 주입 장애 11 청각을 주도 쥐 신생아의 뇌 감염을 가능하게했다. 그러나 대부분의 전nvestigations 지금 잠재적으로 혈행 뇌 감염으로 이어지는 조직의 바이러스 전파, 두개 내 주사보다 더 관련이 모델을 제공하는 4-20 시간 된 신생아의 복강 내 주사를 사용합니다. 이 프로토콜은 CMV의 병인에 중요한 통찰력을 제공하고 특히, 그것은 대식 세포 12와 같은 단핵 세포에 침투하는 염증 병소에있는 신경 세포와 아교 세포에서 바이러스 복제 신생아 결과의 MCMV 감염을 증명 하였다. 이 보고서는 또한 감소 과립 신경 세포의 증식과 이동 및 여러 인터페론 - 자극 유전자의 유도와 함께 소뇌의 변경 형태 형성을 설명했다. 중추 신경계 MCMV의 컨트롤에 대한 CD8 + T 세포의 중요한 역할은 같은 그룹 (13)에 의해보고되었다. 미생물의 병적 인 효과를 분석 할 때 고려해야 할 중요한 측면은 감염의 역학이다이온. MCMV의 경우는 미래 신경 생물학적 손상의 정도를 이해하고 예측하기 위해 개발 뇌에 바이러스 전파의 진행을 탐구하고 정량화하는 것이 특히 중요합니다. 전통적으로, 감염의 진행의 정량화는 감염된 동물의 정기적 인 희생 액세스 할 수없는 두뇌와 같은 조직에 병원체, 역가 필요합니다. 프로토콜 유형은 지금 필요한 동물 복지의 향상과 3RS (교체, 수정, 감소) 원리 (14)에 의해 도전을하고 있습니다. 생체 내 이미징 기술을 사용하여 생체 내 감염 실험에 필요한 동물의 수의 급격한 감소를 허용 할 수 있습니다. 여기, 우리는보고와 마우스 신생아에 복강 MCMV 룩 주입시 뇌에 바이러스 전파의 시간 코스 분석을 설명합니다. 같은 동물을 사용하여, 우리는 강렬한 VI의 사이트를 추적하고 생체 모니터링2 주 기간 동안 RAL 복제.
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Protocol
1. 바이러스 현탁액의 준비
- 울리히 Koszninowski의 연구실에서 MCMV 표현 루시 페라 제의 스미스 변형 (MCMV 뤽 15)을 얻었다. 이 재조합에서 루시 페라 제 유전자 MCMV 게놈의 IE2 현장에 삽입됩니다.
- MCMV 뤽를 증폭하기 위해, 감염의 다른 다양성 (MOI 0.001 1로) 16시 MCMV와 쥐 골수 기질 세포 라인 (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) 감염. 이를 위해, 37 혈청 배지에서 배양 세포에 바이러스를 추가 ° C. 일시간 후, 상층 액을 제거하고 DMEM이 10 % 소 태아 혈청 (FCS)로 보충로 교체합니다. 5 일 후, 추가로 사용할 때까지 -80에서 배지 및 저장 분주 ° C를 수확.
- 상패 분석에 의해 바이러스 현탁액의 적정.
- DMEM 40,000 세포에서 24 잘 판에 3T3 세포 (ATCC # CRL-1658) 스플릿 / 잘 1 ML 페니실린 (200 IU / ml)에 steptomycin을 (200 MG / ML 포함 10 % FCS와 보충) 37시 24 시간을 품어 ° C.
- DMEM에 MCMV 현탁액의 나누어지는 일련 희석 (10 -1 ~ 10 -8)를 준비하고 세포 배양액을 제거한 후 희석 200 μL을 대상으로 세포 (3T3) 감염. 37 1 시간을 품어 ° C. 주요 매체의 1 ML (DMEM 3 % FCS, 2 % (v / v)의 젠타 마이신, 200 IU / ML 페니실린, 200 MG / ML 스트렙토 마이신, 8g / L 카르복시 메틸 셀룰로오스)를 추가하고 37 오일을 품어 ° C.
- 각 well에 200 μL 10 %의 포름 알데히드 (물과 포름 알데히드의 희석 독성 들숨을 피하기 위해 화학 후드에서 수행되어야한다) 추가하고 실온에서 6 시간을 배양하여 세포를 고정합니다. 밖으로 pipetting하여 배양 배지 + 고정 기는를 제거하고 200 μl의 세포 염색 용액 (20 % 에탄올 1 % 크리스탈 바이올렛 (W / V))를 추가합니다. 사용하기 전에, 9 부품 밀리 Q 물과 1 부분을 희석. 상온에서 2 분 알을 품다, 물에 담가 3 배 접시를 씻어 쌍안경과 플라크의 수를 건조하고 계산하자.
<리> 50 μl의 50 PFUs를 얻고 더 사용할 때까지 얼음에 떠날 DMEM에서 MCMV 룩을 희석. 신생아는 생후 2-3 주에 도달하기 전에 높은 바이러스 접종를 사용하여 치사를 유도합니다. 우리의 경험에서, 500 PFUs는 주사 후 모든 신생아 5-7일에서 치사를 유도.
2. 신생아의 주입
- 신생아 (4 ~ 20 시간짜리 마우스)를 사용할 수있는 경우, 어머니의 스트레스와 새끼의 거부를 유도 할 "외국인"냄새와 오염을 방지하기 위해 조심스럽게 새끼를 취급하기 전에 쓰레기와 장갑 케이지의 배설물을 조작 .
- 그림 1A와 같이 인슐린 주사기 (29 G)를 사용하여 복강 주사를 수행합니다. 지느러미 피부에 신생아를 잡습니다. 복부 쪽이 위로, 앞다리에서 바늘을 소개하고 부드럽게 복막 캐비티 (배꼽 아래 작은) 달성하기 위해 피하 주사를 누릅니다. 우리는 현재 DPBS에 희석 1 % 메틸렌 블루를 주입 P에 생존을 모니터링바이러스 감염을 수행하기 전에 ractice 기술. 메틸렌 블루 주사 과정에서 명확하게 볼 수 있기 때문에, 우리는 복강 내 구멍에 바이러스 서스펜션의 적절한 전달을 보장하기 위해 먼저이 "교육"분사를 수행하는 것이 좋습니다.
- 발생 및 신생아 다시 케이지에 배치 할 수있는 작은 혈액 방울을 제거합니다.
3. 생체 내 이미징
- 7 일째에 동일하게 앞서 언급했듯이주의와 신생아를 처리합니다. 복강에게 마취제 (4 MG / ML 케타민, 0.8 MG / ML xylazine)와 각 동물에 μL 50 루시페린 (0.15 ㎎ / g 체중)의 혼합물을 주입. 동물의 평균 체중 1-2 g와 마취제 당 동물의 복용량입니다 : 루시페린이 방출의 최대에 도달 할 때까지 케타민을 40 μg, xylazine 8 μg 12-15 분을 기다립니다. 이 사전에 결정되어야하며 루시페린 공급자 및 사용 이미징 시스템에 따라 달라집니다.
- 새끼는 anestheti 있지만데이빗 미래의 식별을 태그와 돌연변이 동물을 사용하는 경우, 향후 유전자형에 사용할 수있는 조직의 작은 조각을 수확.
- 영상 시스템의 새끼를 놓고 몸 전체에서 나오는 빛의 인수를 수행합니다. 감염 후 7 일, 바이러스는 대상과 같은 간 등의 장기, 신장, 폐, 타액선 수많은 복사본으로 복제 한하므로, 노출 기간은 짧아야한다. 우리의 경우, 우리는 10 ~ 20 초 (그림 1B)에 대한 인수를 수행합니다. 이미징 장치의 취득 챔버 플랫폼은 마취 동물의 체온의 과도한 냉각을 방지하기 위해 가열해야합니다. 또한, 획득 한 라운드에서 여러 동물의 낮은 해상도의 이미지를 얻을 후, 해부에 따라 특정 동물이나 고립 된 기관의 한 부분에 집중하기 위해 플랫폼 가까이 카메라 렌즈까지 이동하는 도움이됩니다. 이 소프트웨어는 급속한 변화를 사용하도록 설정해야합니다관심과 스냅 샷 이미지의 향후 수출 정의 된 영역의 매개 변수 (노출 시간, 거리 / 샘플 렌즈, 감도), 정량.
- 단지 머리에서 빛 신호를 얻기 위해, 높은 바이러스 성 복제가 발생 기관의 수준 (간, 폐, 타액선)에서 방출되는 광자를 마스킹 수행 두껍고 어두운 종이로 옆으로 누워 신생아의 몸을 커버 5 ~ 10 분 (그림 1C)에 대한 인수. 동일한 조건에서 동물의 반대 측의 인수를 수행합니다.
- 케이지에 새끼를 재 도입하고 마취 신생아의 과도한 냉각을 방지하기 위해 상단에 가열 램프를 배치합니다. 정기적으로 사후 마취 복구를 모니터링 할 수 있습니다. 표시된 용량과 마취는 현재 30 분 동안 지속됩니다.
- 일 9, 11 및 14에서 동일한 절차를 반복합니다. 일 11 14, 마취제 (6 밀리그램 / ML 케타민, 1.2 MG / ML xylazine)의 용량을 변경합니다.
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Representative Results
대표적인 실험은 그림 1에 설명되어 있습니다. MCMV 룩의 50 PFUs (패널 A는 바늘의 피하 경로를 시각화하기 위해 메틸렌 블루로 수행 유사한 주사를 보여줍니다)를 복강 내 주사시 신생아는 마취와 동시에 루시 페라 제 기판 (루시페린, 캘리퍼스)의 0.3 MG를 받았다. 15 분 후, 동물은 IVIS (50)의 수집 챔버 (생체 내 이미징 시스템에서, 캘리퍼스)에서 복부 측면을 배치되었고, 모든 동물에 의해 방출되는 빛은 10 초 노출 동안 촬영했다. 패널 B는 분석을위한 전용 소프트웨어 (이미지 3.2, 캘리퍼스 생활)와 함께 일 7, 9, 11, 14에서 찍은 스냅 샷 이미지를 보여줍니다. 이미지는 동일한 설정으로 보정했다 : 최대 방출 10 칠초 당 광자 (P / 초) 10 6 P / 초에서 분으로 설정됩니다. 이 그림에서, 전체 동물의 전반적인 바이러스 역가가 시간이 지남에 따라 감소 나타납니다. 정량 동일한 소프트웨어로 수행 발광이 관측 (미도시)를 확인합니다. 다음으로, 우리는 폐, 간, 신장 및 디지털 카메라에 의해 감지되는 침샘과 같은 기관에 의해 방출되는 광자를 방지 두꺼운 어두운 종이 동물, 머리를 제외하고 몸 전체에 덮여있다. 이 긴 노출 (우리의 경우 5 분) 수와 그 강도 일 7 일 14 일 (패널 C) 사이에 증가 왼쪽 귀에 수준에서 개별 지점을 보여준다. 신호는 또한 동물의 아래턱과 코에 나타납니다. 이미지는 100 P / 초 2,000 P / 초와 최소에서 최대로 설정 하였다. 일 0 일 14 사이에 동일한 동물에서 수행이 실험은, 바이러스 감염의 진화를 기록하고이 기술을 정량화하고 뇌에 MCMV의 보급이 동적으로 생체 내에서 관찰 할 수있는 할 수 있음을 나타냅니다.
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그림 1. 실험적으로 신생아에서 발광 사이토 메갈로. A. 복강 메틸렌 블루 주사 감염 대표적인 마우스 신생아 시간 코스 분석. 확대 사진 (오른쪽) 가슴에 주입 피하 경로를 보여줍니다. 하루 7 일부터 같은 신생아의 생체 내 이미징 B. MCMV 룩 주입 한 후 14 일이되는 날에. 전체 마취 동물의 발광은 루시페린 주입 10 초 노출시 시각이다. 14 일 7 같은 동물의 머리 (왼쪽)에 의해 방출 C.의 발광. 어두운 종이로 신체의 나머지 부분에서 담금질 광자는 더 이상 노출 (5 분) 할 수 있습니다.
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Discussion
마우스 신생아 MCMV 룩 보급을 모니터링하는 생체 이미징 기술을 사용하여, 우리는 야생형에 반대 돌연변이 동물의 뇌에 바이러스 확산을 관찰 할 수 있었다. 뇌의 동물과 생체 이미징의 추가 해부 중추 신경계의 발광 바이러스의 존재를 확인했다. 또한, 우리는 또한 MCMV E1 초기 단백질에 대한 특정 항체를 뇌의 얇은 부분에 (미도시) 면역 조직 화학 염색을 시행하고 실제로 MCMV가 발광가 감지되는 것과 동일한 영역에 존재하는 것을 관찰, 따라서의 거시적 인 시각화를 나타내는 전체, 라이브 마취 동물에 의해 방출 된 빛은 실제로 생체 내에서 발생하는 바이러스 감염의 특성을 반영합니다.
이러한 분석은 널리 발광 세포의 이식에 종양의 성장을 모니터링하는 예를 들어, 성인 동물을 위해 사용되었습니다. 우리의 경우, 문제는 neona를 사용하는 것이 었습니다수집 챔버 내부의 동물로 전달 isoflurane을 가진 기체 마취 기술적 인 이유로 불가능했다하는 TES. 따라서, 우리는 xylazine / 케타민 주사를 사용하도록 강요하고 우리는 신생아의 작은 크기로 용량을 적용 하였다. 우리는 또한 자신의 어머니에 의해 거절의 위험을 피하기 위해 조심스럽게 새끼 취급. 다음으로 추천 용량은 여기에 설명하고, 생체 내 이미징에서 수행하는 데 필요한 부동의 오랜 기간을 가능하게 대체 가능한 옵션이되고 새끼의 안전한 조작과 결과, 신생아 마취 중요 한.
발광 수준이 적절한 소프트웨어를 정량화 할 수 있기 때문에 또한, 우리는 2 주 기간 동안 감염의 진행을 감소 바이러스 성 복강 장기 하중 (간, 비장, 신장)과 폐에 의해 특징입니다 것을 보여 뇌의 바이러스 확산을 점진적으로 입증 할 수있는 동안. 목돌연변이 동물이 아닌 컨트롤에서 발견 할 수있는 관찰, 자세한 내용과 변이 유전자의 특성도 논의 될 준비 원고 통계 분석을 문서화 될 것입니다. 그럼에도 불구하고, 우리의 이미징 방법은 다른에서 준비 균질 바이러스 역가를 측정하기 위해 시간과 자원이 소요되는 방법 (상패 분석 또는 정량 PCR) 다음 각 시점에 대한 몇 가지 동물의 안락사를 요구하는 고전적인 기법에 비해 상당한 개선을 구성 절개시 기관. 이 통계적으로 유의 도달하기에 충분한 숫자를 최소화하기 위해 지속적인 노력을 필요로 동물 실험에 적용되는 윤리 원칙과 일치에 있습니다. 마지막으로, 실험의 전체 기간 동안 동일한 동물 (일 7시 태그)에 따라 또 다른 장점은 개인간 차이를 줄이는 것입니다. 그 결과로, 정량화 각 시점 (일 7, 9, 11, 14) 반환 한에서 수행6 신생아의 그룹에 ormed 크게는 결과 (데이터가 표시되지 않음)의 통계적 유의성을 향상시킵니다.
우리는 현재 돌연변이 동물의 뇌에 바이러스 확산을 증강 준비 보고서에서 현재 MCMV의 보급 및 원고에 마우스의 돌연변이의 영향을 분석하기 위해이 방법을 사용합니다. 우리의 경험은 제어 신생아의 해당 그룹에 5-6 돌연변이의 그룹을 비교하면 높은 품질과 중요한 데이터를 제공하는 것을 나타냅니다. 그러나 우리는 무작위 돌연변이 프로그램에 의해 생성 된 phenodeviants의 선별이 방법이 적합 고려하지 않는다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재무 적 이해 관계를 선언합니다.
윤리 문
동물 문화원 디부 Immunologie 등 디 Hématologie의 동물 보호 시설에서 무균 조건 하에서 유지 하였다. 쥐 실험 절차의 처리는 실험 동물의 보호를위한 프랑스 법에 따라 실시 하였다. 절차는 인증 번호 A-67-345에서 서비스 véterinaire 드 라 경시청 뒤 바랭 (프랑스)에 의해 승인되었다.
Acknowledgments
우리는 바이러스학 연구소의 동물 시설을 사용할 수있는 권한을 증폭 및 MCMV - 루크와 토마스 Baumert (INSERM U748, 스트라스부르) 적정에 대한 리 Tuddenham (IBMC, 스트라스부르) 감사합니다. INSERM, Université 드 스트라스부르과 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR-08-풍채 005 01)로부터 재정 지원을 인정 받고 있습니다. 자신의 마스터 프로젝트 기간 동안 소니아 Beroud 및 Laetitia Lelieur의 초기 참여도 인정 받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylen blue | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulin needles | VWR | 613-4897 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15070 | |
| carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer | ||
References
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