Summary
Human cytomegalovirus (HCMV) infektion i nyfødte udgør en vigtig årsag til mental retardering, men de molekylære begivenheder, der førte til virus-induceret patogenese stadig dårligt forstået. For at undersøge dynamikken i hjernen infektion, vi tilpasset hel-dyr
Abstract
Human cytomegalovirus (HCMV eller HHV-5) er en livstruende patogen immunsvækkede individer. Ved medfødt eller neonatal infektion, kan en virus inficere og formere sig i hjernens udvikling, hvilket kan fremkalde alvorlige neurologiske skader, herunder døvhed og mental retardering. Trods den potentielle sværhedsgraden af symptomerne, er de terapeutiske muligheder begrænsede af utilgængelighed af en vaccine og fraværet af en specifik antiviral behandling. Desuden er en præcis beskrivelse af de molekylære begivenheder under infektion af det centrale nervesystem (CNS) mangler stadig, da observationer meste stammer fra obduktionen af smittede børn. Adskillige dyremodeller, såsom rhesus makak CMV, er blevet udviklet og leveret et vigtigt indblik i CMV patogenese i CNS. Men på trods af sin evolutionære nærhed med mennesker, blev denne model begrænset af intrakranial inokulation procedure anvendt til at inficere dyr og ulemperistently fremkalde CNS infektion. Desuden har etiske overvejelser fremmet udviklingen af alternative modeller, blandt hvilke neonatal infektion i nyfødte mus med mus cytomegalovirus (MCMV) har for nylig ført til betydelige fremskridt. For eksempel blev det rapporteret, at intraperitoneal injektion af MCMV til Balb / c nyfødte fører til infektion af neuroner og gliaceller i bestemte områder af hjernen. Disse resultater antydede, at eksperimentel podning af mus måtte rekapitulere de underskud, fremkaldt af HCMV infektion hos børn. Ikke desto mindre er en dynamisk analyse af MCMV infektion i nyfødte er vanskelig at udføre, fordi klassiske metode kræver ofring af et betydeligt antal dyr på forskellige tidspunkter til at analysere den virale byrde og / eller immun-relaterede parametre. For at omgå denne flaskehals, og at muliggøre fremtidige undersøgelser af sjældne mutant dyr, vi anvendte in vivo imaging-teknologi til at udføre en tid-kursus analyse af viral udbredelse i hjernen ved perifer injektion af en rekombinant MCMV udtrykker luciferase til C57BI / 6 nyfødte.
Introduction
Human cytomegalovirus (HCMV/HHV-5) er et medlem af β-herpesvirus familie. HCMV er en meget udbredt, opportunistisk patogen, der normalt erhverves i den tidlige liv som en asymptomatisk infektion 1.. Ligesom alle herpesvirus, fortsætter HCMV hele levetid vært, hvis immunsystem stramt styrer viral replikation. Episoder med viral reaktivering oftest forekomme i immunkompromitterede personer såsom transplanterede patienter, der får medicin for at forebygge afstødning af transplantatet 2.. Hos voksne er HCMV også været forbundet med glioblastomer 3.. Desuden er HCMV en fremtrædende patogen til nyfødte med umodne immunitet 4-6. Primær infektion i det udviklende foster eller nyfødte kan få alvorlige konsekvenser. HCMV infektion er den mest almindelige infektiøse årsag til medfødte misdannelser og barndommen lidelser i de udviklede lande. Det anslås, at forekomsten af neonatal HCMV infektion påvirker 0,5-1% of alle levendefødte blandt hvilke 5-10% vil lider af alvorlige symptomer såsom microcephalus eller cerebellare hypoplasi. Desuden vil 10% af de smittede spædbørn med subklinisk virusinfektion senere udvikle følgesygdomme fører til mental retardering, høretab, visuelle defekter eller beslaglæggelse og epilepsi 7,8.
I modsætning til andre humane herpesvirus såsom Herpes Simplex 1 (HSV-1/HHV-1), som kan podet til mus via forskellige ruter af injektion 9, cytomegalovirus replikering er artsspecifik. Denne funktion er alvorligt hæmmet undersøgelser af HCMV patogenese som udføres i forskellige dyremodeller (mus, rotte, marsvin, rhesus aber), og deres respektive ægte værtsspecifikke CMVs. Alle CMVs udviser betydelige ligheder i genom størrelse og organisering, vævs tropisme og regulering af genekspression. De inducerer også lignende patologier i deres respektive vært. Trods genomisk mangfoldighed væremellem HCMV og mus cytomegalovirus (MCMV) (50% af de ORF'er stede i human virus identificeres i den murine CMV) har musemodel nylig vist sig at være fordelagtigt, hovedsagelig fordi mutantstammer kan testes for deres evne til at styre viral replikation in vivo. Dette har ført til en genetisk skærm som gjorde det muligt et skøn over antallet af musegener udtryk på voksne stadium, som udgør de "resistome" til denne virus 10.. Tilsammen indikerer dette, at MCMV-inficerede mus repræsenterer en attraktiv model til undersøgelse af vært-virus interaktioner i voksne. Udforskningen af medfødt CMV-infektion er mere kompleks, fordi forskellene i placenta lag organisation mellem menneske og mus forringe mor-til-foster fremsendelse af virusinfektion i mus. For nylig har direkte injektion af MCMV i moderkagen på dag 12.5 i drægtighedsperioden aktiveret hjerne infektion i mus nyfødte, som førte til nedsat hørelse 11.. Men de fleste investigations nu bruge intraperitoneal injektion af 4-20 hr gamle nyfødte at give systemisk viral spredning potentielt kan føre til hæmatogene hjernebetændelse, en model, der er mere relevant end en intrakraniel injektion. Denne protokol gav vigtige indblik i CMV patogenese og især blev det påvist, at MCMV infektion af nyfødte resulterer i viral replikation i neuronale og gliaceller placeret i inflammatoriske foci, er infiltreret med mononukleære celler som makrofager 12. Denne rapport beskrives også ændret morfogenese af lillehjernen ledsaget med formindsket kornet neuron proliferation og migration og fremkaldelse af flere interferon-stimulerede gener. Den væsentlige rolle, CD8 + T-celler til bekæmpelse af MCMV i centralnervesystemet blev også rapporteret af samme gruppe 13. Et vigtigt aspekt at overveje, når man analyserer den patologiske effekt af en mikrobe er dynamikken i inficereion. I tilfælde af MCMV, er det særlig vigtigt at udforske og kvantificere udviklingen af viral spredning i hjernens udvikling med henblik på at forstå og forudse omfanget af de fremtidige neurobiologiske skader. Traditionelt kvantificering af progression af en infektion kræver regelmæssig ofring af inficerede dyr at titrere patogen væv, såsom hjernen, som ellers er utilgængelige. Denne type protokol er nu udfordret af nødvendig forbedring af dyrevelfærd og 3R (Reducer, indsnævring, Erstat) principper 14.. Brug in vivo imaging teknologier kan tillade en drastisk reduktion af antallet af dyr, som er nødvendige i in vivo infektion eksperimenter. Her rapporterer vi og beskrive en tids-kursus analyse af viral spredning i hjernen på intraperitoneal MCMV-Luc injektion mus nyfødte. Brug de samme dyr, vi spores og overvåget in vivo de steder intense viral replikation under en 2-ugers periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Fremstilling af virussuspension
- Opnå Smith stammen af MCMV udtrykke Luciferase (MCMV-Luc 15) fra Ulrich Koszninowski laboratorium. I dette rekombinante er luciferasegenet indsat i IE2 locus MCMV genomet.
- At forstærke MCMV-Luc, inficere en murin knoglemarv stromale cellelinie (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) med MCMV ved forskellige multiplicitet af infektion (MOI, 0,001-1) 16. Til dette tilsættes virus til dyrkede celler i serumfrit medium ved 37 ° C. Efter en time, supernatanten fjernes, og erstatte det med DMEM suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS). Fem dage senere, høste dyrkningsmediet og gemme alikvoter ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.
- Titrering af virussuspension ved plaque-assay.
- Split 3T3-celler (ATCC # CRL-1658) i en 24-brønds plade ved 40.000 celler / brønd i 1 ml DMEM suppleret med 10% FCS indeholdende penicillin (200 IU / ml) og steptomycin (200 mg / ml) Og inkuber 24 timer ved 37 ° C.
- Forbered seriefortyndinger (10 -1 til 10 -8) i en portion af MCMV suspension i DMEM og inficere målceller (3T3) med 200 pi fortynding efter fjernelse celledyrkningsmedium. Inkuber 1 time ved 37 ° C. Tilsæt 1 ml Top medium (DMEM 3% FCS, 2% (v / v) gentamycin, 200 IE / ml penicillin, 200 mg / ml streptomycin, 8 g / L Carboxymethylcellulose) og inkuber 5 dage ved 37 ° C.
- Fikseres cellerne ved tilsætning af 200 pi 10% formaldehyd (fortynding af formaldehyd med vand bør ske i en kemisk hætte for at undgå giftige inhalationer) til hver brønd, og inkubering 6 timer ved stuetemperatur. Fjern dyrkningsmedium + fikseringsorgan ved pipettering ud og der tilsættes 200 pi cellefarvning opløsning (1% krystalviolet (w / v) i 20% ethanol). Før brugen fortyndes 1 del med 9 dele milli-Q vand. Inkuber 2 minutter ved stuetemperatur vaskes pladen 3-4x ved opblødning i vand, lad tørre og tælle antallet af plaques med en kikkert.
<li> Fortynd MCMV-Luc i DMEM at opnå 50 PFU'er i 50 pi og efterlade på is indtil videre anvendelse. Anvendelse af højere virale podninger inducerer letalitet før de nyfødte nå 2-3 ugers alderen. Det er vores erfaring, at fremkalde 500 PFU'er dødelighed i hvert neonatale 5 til 7 dage efter injektion.
2.. Injektion af Nyfødte
- Når nyfødte (4 til 20 timer gamle mus) er til rådighed, manipulere strøelse og afføring fra buret med handsker, før forsigtigt håndtering af hvalpene at undgå kontaminering med "fremmede" lugt, som ville understrege moderen og inducere afvisningen af hvalpene .
- Udfør en intraperitoneal injektion med en insulinsprøjte (29 g) som vist i figur 1A. Hold den nyfødte med den dorsale hud. Med ventrale side op, indføre nålen under forbenet og forsigtigt skubbe det subkutant at nå bughulen (lidt under navlen). Vi har i øjeblikket injiceres 1% Methylenblåt fortyndet i DPBS og overvåge overlevelse practice teknikken, før du udfører virusinfektioner. Da Methylenblåt er klart synlig under injektionen processen, anbefaler vi, at udføre denne "træning" indsprøjtning første til at sikre effektiv levering af den virale suspension i intraperitoneal hulrum.
- Eliminer de små blod dråber, der måtte opstå, og placer den nyfødte tilbage i buret.
3.. In vivo Imaging
- På dag 7, håndtere nyfødte med samme advarsler som tidligere nævnt. Injicer intraperitonealt en blanding af anæstetika (4 mg / ml ketamin, 0,8 mg / ml xylazin) og luciferin (0,15 mg / g kropsvægt) i 50 pi i hvert dyr. Gennemsnitlig kropsvægt af dyrene er 1-2 g og dosis af bedøvelsesmidler per dyr er: ketamin 40 mg, xylazin 8 ug Vent 12-15 min, indtil luciferin når sit maksimum emission. Dette skal bestemmes på forhånd og afhænger af luciferin udbyder og billedbehandling anvendte system.
- Mens hvalpene er anesthetized, tagge dem til fremtidig identifikation og høste en lille stykke væv, som derefter kan anvendes til fremtidig genotypebestemmelse hvis mutant dyr anvendes.
- Placer hvalpene i billedbehandlingssystem og udføre overtagelse af lys udsendt af hele kroppen. Syv dage efter infektion, har virussen replikeret i talrige eksemplarer i målorganer såsom lever, nyrer, lunger og spytkirtler, og derfor bør varigheden af eksponeringen være kort. I vores tilfælde, udfører vi købet i 10 til 20 sek (figur 1B). Platformen i erhvervelsen kammer imaging enhed skal opvarmes for at undgå overdreven køling af kropstemperaturen hos bedøvede dyr. Desuden er det nyttigt at opnå lav opløsning billeder af flere dyr inden for en runde af opkøb og derefter bevæge sig op på platformen tættere på kameralinsen for at fokusere på den ene del af et bestemt dyr eller en isoleret organer efter dissektion. Den software skal aktivere hurtige ændringeraf de parametre (eksponering tid, distance prøve / linse, følsomhed), kvantificering af definerede områder af interesse og fremtidige eksport af snapshot billeder.
- At erhverve lyssignal fra hovedet alene dækker kroppen af nyfødte ligger sideværts med en tyk, mørk papir, der maskere fotoner udsendt på niveauet af de organer, hvor høj viral replikation sker (lever, lunger, spytkirtler), og udfør anskaffelse i 5 til 10 minutter (figur 1C). Udfør erhvervelse af den modstående side af dyret under de samme betingelser.
- Genindføre hvalpene ind i buret og placere en varmelampe på toppen for at undgå overdreven køling af bedøvede nyfødte. Løbende overvåge postanæstesisk opsving. Med den angivne dosis, der i øjeblikket anæstesi varer 30 min.
- Gentag den samme procedure på dag 9, 11 og 14. På dag 11 og 14, ændre dosis af anæstetika (6 mg / ml ketamin, 1,2 mg / ml xylazin).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En repræsentativ eksperiment er illustreret i figur 1.. Efter intraperitoneal injektion af 50 PFU af MCMV-Luc (Panel A viser en lignende injektion udført med methylenblåt for at visualisere subkutan nålen), var nyfødte bedøvet og modtaget samtidigt 0,3 mg af luciferasesubstrat (Luciferin, Caliper). Femten minutter senere blev dyrene anbragt ventrale side op i erhvervelsen kammer IVIS 50 (In Vivo Imaging System, Caliper), og lyset fra hele dyret blev fanget under en 10 sek eksponering. Panel B viser snapshot billeder taget på dag 7, 9, 11 og 14 med den software (Living Billede 3.2 Caliper) dedikeret til analyse. Billederne blev kalibreret med de samme indstillinger: Max emission er fastsat til 10 7 fotoner per sekund (p / sek) og min ved 10 6 p / sek. Fra billederne, fremgår det, at den samlede virustiter i hele dyret falder med tiden. Kvantificering af luminescensen udført med den samme software bekræfter denne observation (ikke vist). Næste, vi dækket hele kroppen, undtagen hovedet af dyret med en tyk, mørk papir, som forhindrer fotoner udsendt af organer såsom lunger, lever, nyrer og spytkirtler, der skal registreres af det digitale kamera. Dette muliggør længere eksponering (5 min i vores tilfælde) og afslører et diskret sted på niveau med det venstre øre, hvis intensitet stiger mellem dag 7 og dag 14 (panel C). Et signal vises også underkæben og næse af dyret. Billeder blev sat med en Max ved 2.000 p / sek og min ved 100 p / sek. Dette eksperiment, udført på det samme dyr mellem dag 0 og dag 14, viser, at udviklingen i den virusinfektion kan registreres og kvantificeres med denne teknologi, og at udbredelsen af MCMV til hjernen kan dynamisk observeres in vivo.
1.jpg "/>
Figur 1. Time-kursus analyse af en repræsentativ mus nyfødte eksperimentelt inficeret med en selvlysende cytomegalovirus. A. Intraperitoneal methylenblåt injektion hos nyfødte. Den forstørrede billede (højre) viser den subkutane vej injektionen på brystkassen. B. In vivo billeddannelse af samme nyfødte fra dag 7 til dag 14 efter MCMV-Luc injektion. Luminescens fra hele bedøvede dyr er visualiseret ved luciferin injektion og 10 sek eksponering. C. Luminescens udsendes af hovedet (venstre side) af det samme dyr på dag 7 til 14. Quenching fotonerne fra resten af kroppen med en mørk papir muliggør længere eksponering (5 min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brug in vivo imaging-teknologi til at overvåge MCMV-Luc udbredelse i mus nyfødte, var vi i stand til at observere viral spredning til hjernen af mutant dyr, i modsætning til vildtype. Yderligere dissektion af dyret og ex vivo-billeddannelse af hjernen bekræftede tilstedeværelsen af luminescerende virus i det centrale nervesystem. Desuden udførte vi immunhistokemi (ikke vist) på hjernen tynde sektioner med et antistof specifikt for MCMV E1 tidlig protein og bemærkede, at faktisk MCMV er til stede i de samme områder som dem, hvori luminescens blev registreret, hvilket viser, at makroskopisk visualisering af lyset fra hele, levende bedøvede dyr, der faktisk afspejler de særlige kendetegn ved viral infektion, der opstår in vivo.
Sådanne analyser har været meget anvendt til voksne dyr, for eksempel for at overvåge tumorvækst ved implantation af selvlysende celler. I vores tilfælde, var udfordringen at bruge neonates for hvilke gasformige anæstesi med isofluran leveret til dyret inde købet kammeret var ikke teknisk muligt. Derfor blev vi tvunget til at bruge ketamin / xylazin indsprøjtning og vi tilpasset dosis til den lille størrelse af nyfødte. Vi har også håndteret ungerne forsigtigt for at undgå risikoen for afstødning af deres mor. Ved at følge anbefalingerne og doser er beskrevet her, og som er afgørende for sikker manipulation og resultatet af hvalpene, anæstesi af nyfødte bliver en alternativ farbar, som giver lange perioder med immobilitet, der kræves for at udføre in vivo billeddannelse.
Endvidere fordi luminescens niveau kan kvantificeres med relevant software, vi påvist, at progression af infektion under en 2-ugers periode er karakteriseret ved en nedsat virusmængden i de peritoneale organer (lever, milt, nyrer) og lungerne, mens virus spredes i hjernen gradvist kan dokumenteres. Ther observation, som kunne blive bemærket i muterede dyr og ikke i kontrol, vil blive dokumenteret med flere detaljer og en statistisk analyse i et manuskript under udarbejdelse, hvor karakteren af det muterede gen vil også blive drøftet. Alligevel vores billeddannelse metode udgør en betydelig forbedring i forhold til de klassiske teknikker, som kræver aflivning af flere dyr for hvert tidspunkt, efterfulgt af tid-og ressourcekrævende metoder (plak-assay eller kvantitativ PCR) til måling virale titere i homogenater fremstillet ud fra forskellige organer, dissektion. Dette er også i tråd med de etiske principper, der gælder dyreforsøg, som kræver konstant indsats for at minimere de numre, der er tilstrækkelige til at nå statistisk signifikans. Endelig en anden fordel ved at følge den samme dyr (mærket på dag 7) under hele forsøgets varighed er at reducere inter-individuelle variationer. Som følge heraf gjorde kvantificering på hvert tidspunkt (7, 9, 11 og 14) performed på en gruppe af 6 nyfødte forbedrer den statistiske signifikans af resultaterne (data ikke vist).
Vi har i øjeblikket bruger denne metode til at analysere konsekvenserne af mutationer i mus på formidling af MCMV og et manuskript under udarbejdelse rapporter augmented viral spredning i hjernen hos mutant dyr. Vores erfaring viser, at sammenligne en gruppe på 5-6 mutanter til en tilsvarende gruppe af kontrol nyfødte giver høj kvalitet og væsentlige data. Vi har imidlertid ikke overveje denne metode egnet til screening af phenodeviants genereret af en tilfældig mutagenese program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen konkurrerende finansielle interesser.
Etik erklæring
Dyrene blev holdt under patogenfrie forhold i dyret og fritidsordning fra Institut d'Immunologie et d'hématologie. Håndtering af mus og eksperimentelle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med den franske lov om beskyttelse af forsøgsdyr. Proceduren blev godkendt af den service Vétérinaire de la Préfecture du Bas-Rhin (Frankrig) under godkendelsesnummeret A-67-345.
Acknowledgments
Vi takker Lee Tuddenham (IBMC, Strasbourg) til forstærkning og titrering MCMV-Luc og Thomas Baumert (INSERM U748, Strasbourg) om tilladelse til at anvende dyret facilitet for Institut for Virologi. Finansiel støtte fra INSERM, Université de Strasbourg og Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-mien-005-01) er anerkendt. Den indledende deltagelse Sonia Beroud og Laetitia Lelieur under deres Mester projekt er også anerkendt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylen blue | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulin needles | VWR | 613-4897 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15070 | |
| carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer | ||
References
- Loewendorf, A., Benedict, C. A. Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything. J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).
- Lischka, P., Zimmermann, H. Antiviral strategies to combat cytomegalovirus infections in transplant recipients. Curr. Opin. Pharmacol. 8, 541-548 (2008).
- Johnsen, J. I., Baryawno, N., Soderberg-Naucler, C. Is human cytomegalovirus a target in cancer therapy? Oncotarget. 2, 1329-1338 (2011).
- Morein, B., Abusugra, I., Blomqvist, G.
- Zaghouani, H., Hoeman, C. M., Adkins, B. Neonatal immunity: faulty T-helpers and the shortcomings of dendritic cells. Trends Immunol. 30, 585-591 (2009).
- Morein, B., Blomqvist, G., Hu, K.
- Cheeran, M. C., Lokensgard, J. R., Schleiss, M. R. Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention. Clin. Microbiol. Rev. 22, 99-126 (2009).
- Tsutsui, Y. Effects of cytomegalovirus infection on embryogenesis and brain development. Congenit. Anom. (Kyoto). 49, 47-55 (2009).
- Sancho-Shimizu, V., et al. Genetic susceptibility to herpes simplex virus 1 encephalitis in mice and humans. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 7, 495-505 (2007).
- Crozat, K., et al. Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis. Mamm. Genome. 17, 398-406 (2006).
- Juanjuan, C., et al. Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment. Virol. J. 8, 70 (2011).
- Koontz, T., et al. Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system. J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).
- Bantug, G. R., et al. CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals. J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).
- Sacher, T., et al. The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo. Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).
- Lutarewych, M. A., et al. Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4). J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).
