Anvendelse af<em> In vivo</em> Imaging til Monitor Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirusinfektion i Nyfødte

Summary

Human cytomegalovirus (HCMV) infektion i nyfødte udgør en vigtig årsag til mental retardering, men de molekylære begivenheder, der førte til virus-induceret patogenese stadig dårligt forstået. For at undersøge dynamikken i hjernen infektion, vi tilpasset hel-dyr<em> In vivo</em> Imaging at udføre tidsforløb analyse af nyfødte er smittet med en luciferase-rekombinant virus.

Abstract

Human cytomegalovirus (HCMV eller HHV-5) er en livstruende patogen immunsvækkede individer. Ved medfødt eller neonatal infektion, kan en virus inficere og formere sig i hjernens udvikling, hvilket kan fremkalde alvorlige neurologiske skader, herunder døvhed og mental retardering. Trods den potentielle sværhedsgraden af ​​symptomerne, er de terapeutiske muligheder begrænsede af utilgængelighed af en vaccine og fraværet af en specifik antiviral behandling. Desuden er en præcis beskrivelse af de molekylære begivenheder under infektion af det centrale nervesystem (CNS) mangler stadig, da observationer meste stammer fra obduktionen af ​​smittede børn. Adskillige dyremodeller, såsom rhesus makak CMV, er blevet udviklet og leveret et vigtigt indblik i CMV patogenese i CNS. Men på trods af sin evolutionære nærhed med mennesker, blev denne model begrænset af intrakranial inokulation procedure anvendt til at inficere dyr og ulemperistently fremkalde CNS infektion. Desuden har etiske overvejelser fremmet udviklingen af ​​alternative modeller, blandt hvilke neonatal infektion i nyfødte mus med mus cytomegalovirus (MCMV) har for nylig ført til betydelige fremskridt. For eksempel blev det rapporteret, at intraperitoneal injektion af MCMV til Balb / c nyfødte fører til infektion af neuroner og gliaceller i bestemte områder af hjernen. Disse resultater antydede, at eksperimentel podning af mus måtte rekapitulere de underskud, fremkaldt af HCMV infektion hos børn. Ikke desto mindre er en dynamisk analyse af MCMV infektion i nyfødte er vanskelig at udføre, fordi klassiske metode kræver ofring af et betydeligt antal dyr på forskellige tidspunkter til at analysere den virale byrde og / eller immun-relaterede parametre. For at omgå denne flaskehals, og at muliggøre fremtidige undersøgelser af sjældne mutant dyr, vi anvendte in vivo imaging-teknologi til at udføre en tid-kursus analyse af viral udbredelse i hjernen ved perifer injektion af en rekombinant MCMV udtrykker luciferase til C57BI / 6 nyfødte.

Introduction

Human cytomegalovirus (HCMV/HHV-5) er et medlem af β-herpesvirus familie. HCMV er en meget udbredt, opportunistisk patogen, der normalt erhverves i den tidlige liv som en asymptomatisk infektion ^1.. Ligesom alle herpesvirus, fortsætter HCMV hele levetid vært, hvis immunsystem stramt styrer viral replikation. Episoder med viral reaktivering oftest forekomme i immunkompromitterede personer såsom transplanterede patienter, der får medicin for at forebygge afstødning af transplantatet ^2.. Hos voksne er HCMV også været forbundet med glioblastomer ^3.. Desuden er HCMV en fremtrædende patogen til nyfødte med umodne immunitet ^4-6. Primær infektion i det udviklende foster eller nyfødte kan få alvorlige konsekvenser. HCMV infektion er den mest almindelige infektiøse årsag til medfødte misdannelser og barndommen lidelser i de udviklede lande. Det anslås, at forekomsten af ​​neonatal HCMV infektion påvirker 0,5-1% of alle levendefødte blandt hvilke 5-10% vil lider af alvorlige symptomer såsom microcephalus eller cerebellare hypoplasi. Desuden vil 10% af de smittede spædbørn med subklinisk virusinfektion senere udvikle følgesygdomme fører til mental retardering, høretab, visuelle defekter eller beslaglæggelse og epilepsi ^7,8.

I modsætning til andre humane herpesvirus såsom Herpes Simplex 1 (HSV-1/HHV-1), som kan podet til mus via forskellige ruter af injektion ^9, cytomegalovirus replikering er artsspecifik. Denne funktion er alvorligt hæmmet undersøgelser af HCMV patogenese som udføres i forskellige dyremodeller (mus, rotte, marsvin, rhesus aber), og deres respektive ægte værtsspecifikke CMVs. Alle CMVs udviser betydelige ligheder i genom størrelse og organisering, vævs tropisme og regulering af genekspression. De inducerer også lignende patologier i deres respektive vært. Trods genomisk mangfoldighed væremellem HCMV og mus cytomegalovirus (MCMV) (50% af de ORF'er stede i human virus identificeres i den murine CMV) har musemodel nylig vist sig at være fordelagtigt, hovedsagelig fordi mutantstammer kan testes for deres evne til at styre viral replikation in vivo. Dette har ført til en genetisk skærm som gjorde det muligt et skøn over antallet af musegener udtryk på voksne stadium, som udgør de "resistome" til denne virus ^10.. Tilsammen indikerer dette, at MCMV-inficerede mus repræsenterer en attraktiv model til undersøgelse af vært-virus interaktioner i voksne. Udforskningen af ​​medfødt CMV-infektion er mere kompleks, fordi forskellene i placenta lag organisation mellem menneske og mus forringe mor-til-foster fremsendelse af virusinfektion i mus. For nylig har direkte injektion af MCMV i moderkagen på dag 12.5 i drægtighedsperioden aktiveret hjerne infektion i mus nyfødte, som førte til nedsat hørelse ^11.. Men de fleste investigations nu bruge intraperitoneal injektion af 4-20 hr gamle nyfødte at give systemisk viral spredning potentielt kan føre til hæmatogene hjernebetændelse, en model, der er mere relevant end en intrakraniel injektion. Denne protokol gav vigtige indblik i CMV patogenese og især blev det påvist, at MCMV infektion af nyfødte resulterer i viral replikation i neuronale og gliaceller placeret i inflammatoriske foci, er infiltreret med mononukleære celler som makrofager ^12. Denne rapport beskrives også ændret morfogenese af lillehjernen ledsaget med formindsket kornet neuron proliferation og migration og fremkaldelse af flere interferon-stimulerede gener. Den væsentlige rolle, CD8 + T-celler til bekæmpelse af MCMV i centralnervesystemet blev også rapporteret af samme gruppe ^13. Et vigtigt aspekt at overveje, når man analyserer den patologiske effekt af en mikrobe er dynamikken i inficereion. I tilfælde af MCMV, er det særlig vigtigt at udforske og kvantificere udviklingen af ​​viral spredning i hjernens udvikling med henblik på at forstå og forudse omfanget af de fremtidige neurobiologiske skader. Traditionelt kvantificering af progression af en infektion kræver regelmæssig ofring af inficerede dyr at titrere patogen væv, såsom hjernen, som ellers er utilgængelige. Denne type protokol er nu udfordret af nødvendig forbedring af dyrevelfærd og 3R (Reducer, indsnævring, Erstat) principper ^14.. Brug in vivo imaging teknologier kan tillade en drastisk reduktion af antallet af dyr, som er nødvendige i in vivo infektion eksperimenter. Her rapporterer vi og beskrive en tids-kursus analyse af viral spredning i hjernen på intraperitoneal MCMV-Luc injektion mus nyfødte. Brug de samme dyr, vi spores og overvåget in vivo de steder intense viral replikation under en 2-ugers periode.

Protocol

1.. Fremstilling af virussuspension Opnå Smith stammen af MCMV udtrykke Luciferase (MCMV-Luc 15) fra Ulrich Koszninowski laboratorium. I dette rekombinante er luciferasegenet indsat i IE2 locus MCMV genomet. At forstærke MCMV-Luc, inficere en murin knoglemarv stromale cellelinie (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) med MCMV ved forskellige multiplicitet af infektion (MOI, 0,001-1) 16. Til dette tilsættes virus til dyrkede celler i serumfrit medium ved 37 ° C. Efter en time, …

Representative Results

En repræsentativ eksperiment er illustreret i figur 1.. Efter intraperitoneal injektion af 50 PFU af MCMV-Luc (Panel A viser en lignende injektion udført med methylenblåt for at visualisere subkutan nålen), var nyfødte bedøvet og modtaget samtidigt 0,3 mg af luciferasesubstrat (Luciferin, Caliper). Femten minutter senere blev dyrene anbragt ventrale side op i erhvervelsen kammer IVIS 50 (In Vivo Imaging System, Caliper), og lyset fra hele dyret blev fanget under en 10 sek eksponering. Panel B vise…

Discussion

Brug in vivo imaging-teknologi til at overvåge MCMV-Luc udbredelse i mus nyfødte, var vi i stand til at observere viral spredning til hjernen af mutant dyr, i modsætning til vildtype. Yderligere dissektion af dyret og ex vivo-billeddannelse af hjernen bekræftede tilstedeværelsen af luminescerende virus i det centrale nervesystem. Desuden udførte vi immunhistokemi (ikke vist) på hjernen tynde sektioner med et antistof specifikt for MCMV E1 tidlig protein og bemærkede, at faktisk MCMV er til sted…

Materials

			Reagent/Material
DMEM	Fisher Scientific	W3523A
Methylene blue	Sigma Aldrich	319112
Insulin needles	VWR	613-4897
Ketamine	CentraVet	Ket 201
Xylazine/Vetranal	Sigma Aldrich	46995
DPBS	DUTSCHER	P0436500
Luciferin	Caliper	760504
gentamycin	Sigma Aldrich	G1272
penicillin/streptomycin	Gibco	15070
carboxymethylcellulose	Sigma Aldrich	C4888
formaldehyde	Sigma Aldrich	F8775
crystal violet	Sigma Aldrich	C3886
			Equipment
IVIS 50	Caliper/Perkin Elmer