在这篇文章中,我们展示了一个使用吗啉反义寡核苷酸的成年斑马鱼端脑心室肌细胞的基因表达的方法操纵。我们将此方法作为一个高效,快速的协议,该协议可用于在成年脊椎动物脑的功能性研究。
操纵基因表达的组织需要进行功能研究。在本文中,我们证明脑室微量注射(CVMI)的技术作为一种手段来调节基因表达的成年斑马鱼脑。物质通过使用CVMI,可以施用到脑室流体和彻底分布沿rostrocaudal的轴的大脑。我们尤其侧重于使用的吗啉代反义寡核苷酸,是强有力的工具,撞倒体内基因表达。在我们的方法中,当应用,吗啉分子采取了由内壁细胞的心室面。这些细胞的放射状胶质细胞,神经源性祖细胞作为。因此,撞倒放射状胶质细胞的基因表达是最重要的分析斑马鱼的的广泛神经发生反应,也将提供洞察脊椎动物如何维持成人neurogen的ESIS响应。这样的理解,也将有助于在人类神经退行性疾病的临床应用和中枢神经系统的再生的努力。因此,我们提出了一种快速而有效的方式来改变基因的表达在成年斑马鱼的前脑和神经反应的脑室微量注射的方法。我们还提供故障排除提示和其他有用的信息,如何开展的CVMI程序。
成年神经发生的脊椎动物是一个共同的特点,但其患病率和效率程度不同与系统发育1,2,3,4,5,6。例如,成年哺乳动物的大脑中含有干细胞区域,很大程度上制约了前脑7,8,而硬骨鱼斑马鱼含有16个不同的干细胞领域和相关的神经源性区在其整个大脑4,5,9,10。这种变化可能反映了哺乳动物和斑马鱼之间的差距在维持干细胞和神经源性祖细胞的能力的机制。斑马鱼大脑中的神经元的终身能力也可以对斑马鱼脑的分子机制可能被利用为治疗中的应用,以解决人类神经退行性疾病的临床后果。
几种干细胞区的成年斑马鱼的大脑已经加以分析,它已被证明这些地区的心室面衬细胞作为祖细胞9,11-20。在斑马鱼端脑的详细分析,例如,确定了径向神经胶质细胞,划定该脑区域的心室表面神经源性祖细胞19,20。这也是如此,对其他地区,如小脑和视顶盖,心室位于神经上皮细胞神经源性输入16,21。为此,了解成年斑马鱼脑广泛神经源性能力的分子机制,需要操纵中的祖细胞的基因表达。
以前各种方法调节基因的功能在斑马鱼。这些措施包括生成条件的转基因株系,表达一个单一的蛋白质,质粒注射焦点耦合电或化学治疗所需的变种。我们之前设计了一个管理各种物质,包括吗啉代寡核苷酸或蛋白作为一种快速而有效的方式调节基因的功能在心室肌细胞的成年斑马鱼的前脑22使用脑室的显微注射到成年斑马鱼脑的方法。在我们的研究中,体内吗啉代被使用,因为他们的化学涉及吗啉分子共价连接到精氨酸丰富交纳的肽,从而可以有效的传递到感兴趣的细胞,而不需要额外的通透性,如电穿孔23。这将使一个彻底的定位所需的组织注射后,就像我们所观察到的成年斑马鱼端脑22。的体内吗啉使用,因此优于已有的方法,如电或局部注射DNA分子组织靶向。
在这里,我们直观地显示出我们如何执行此操作,并提供了一步一步的协议。我们先从解释准备注射液和鱼被注入,进行示范如何注射装置设置。我们提供描述脑室注射的方法,它涉及产生切口的吗啉代,用微量注射器在颅骨和注射。我们也阐述一个关键点需要通过优化或故障排除指南,说明他们在整个过程中要谨慎。
我们在这里描述的方法允许进入成年斑马鱼脑的吗啉的容易和快速的管理。我们已经证明,我们的注射方法有效地阻断基因的表达在心室肌细胞在神经元响应的功能性后果和结果。
有一些重要的点是持谨慎态度,同时执行脑室微量注射。例如,吗啉代分子的效果取决于所使用的浓度。这个浓度将由最终用户。我们建议开始与股票溶液(500微米),并进行系列稀释,最好预先测试注入胚胎,胚胎注射使用标准协议28-30。以前,我们获得了不同级别的拦截效率吗啉浓度的范围从50微米到500微米22。其次,节流孔的玻璃毛细管不应该被LARGe作为这将导致广泛的液体注射后涌入大脑。同样,开放必须不能过于狭窄,因为这将防止足够的注塑。人能够确定最佳的节流孔的压力的组合,通过空气泵入与水的陪替氏培养皿。所产生的气泡,应该是在一个单一的行,而不是在多个行。在视频中,我们证明这一点。第三,培育麻醉药的鱼是至关重要的。鱼不应存放时间超过2分钟,在麻醉药。这会妨碍注射后的回收率。第四,切口的位置是关键彻底分散注入的液体。在视顶盖心室区域中线以上大横向越走越窄。因此,实验者应该产生在颅骨缝接近中线,只是尾椎端脑区的颅骨内板覆盖。
脑室注射液的优点之一N(CVMI)方法是其快速性。 CVMI是一种快速的方法,用于测定基因的功能。此功能是重要和有益的,相比一代转基因株系的功能研究,一般需要几个月的时间。此外,CVMI导致注射的液体均匀分布的,因此提供了一个比较彻底的联络注射或电相比,操纵基因的活性。多个基因与CVMI,可以撞倒同时准备注射液混合含有多吗啉代寡核苷酸。 CVMI可用于一个给定的吗啉代寡核苷酸注入不同浓度的,因此可用于亚效等位基因表型分析。最后,这种注射范例不引起毒性或危及动物的生存。
其他类型的研究,如注射的调节肽,药物,质粒DNA或RNA的调节莫可能扩大的CVMI技术,lecules或其他物质有可能影响细胞生理状态的。测定分子组合和表演剂量反应分析是可能使用我们的方法,使学习低表现量的表型。凭借这些特性,CVMI被证明是一个快速简便的检测成年斑马鱼大脑中的表达研究,并开辟了快速筛选和功能分析。
组成的成年斑马鱼的大脑可以产生新的神经元沿整个rostrocaudal轴和外伤后还可以再生。这是哺乳动物的大脑,神经和有限,而如果在所有的再生能力差,形成了鲜明的对比。如此广泛的干细胞活性和休养的能力,使一个有用的模式生物斑马鱼了解分子程序所需的中枢神经系统的再生,这是目前很大程度上是未知的。因此,调查性向泽再生的分子基础brafish大脑是一个有趣的研究领域,这或许可以解释的根本区别,鱼类和哺乳动物的大脑是如何受伤后的反应,同时也赋予再生医学疗法在人类的途径。为了了解脊椎动物大脑的可塑性和再生的分子基础设施作为一个重要的研究领域,神经胶质细胞,因为它们是神经源性祖细胞3,8,20。因此,使用CVMI技术改变基因的斑马鱼大脑中的放射状胶质细胞的功能是在阐明如何鱼脑情侣祖活动高效的成年神经发生和再生反应。我们最近表明在成年斑马鱼脑24,26,27再生的神经发生响应的几个因素和信号通路的参与和要求,这些研究未能由使用CVMI方法。总体而言,从斑马鱼大脑中获得的知识,我们可以利用征收REGENErative哺乳动物的神经胶质细胞受伤的反应,从而帮助设计对人类神经系统疾病的临床治疗和急性伤害的能力。
The authors have nothing to disclose.
支持这项工作是由德意志研究联合会(SFB 655)和欧盟(ZF健康)。
Reagent/Material | |||
CellTracker Red CMTPX | Life Technologies, Invitrogen | C34552 | Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy |
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing the fish |
Petri dishes | Sarstedt | 821,472 | For handling the fish during injection and imaging |
Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | As sterile dilution medium |
Vivo morpholinos | Gene Tools Inc. | Customized | More info on vivo morpholinos: www.gene-tools.com |
Equipment | |||
Barbed-end needle | Becton-Dickinson | 305178 | To generate the incision in the skull |
Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | To snap off the tip of the glass capillary |
Fluorescence camera | Zeiss, Nikon, Leica | Varies with the manufacturer | To visualize the fluorescence after injection |
Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | To hold the fish in position |
Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | For microinjection |
PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjection |
Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjection |
Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | For illuminating the specimen |