I denne artikkelen viser vi en metode for manipulering av genuttrykk i ventrikulære celler av den voksne sebrafisk telencephalon hjelp antisensforbindelser morfolino oligonukleotidene. Vi presenterer denne fremgangsmåte som en effektiv og rask protokoll som kan brukes for funksjonelle studier av den voksne hjernen hos virveldyr.
Manipulering av genekspresjon i vev er nødvendig for å utføre funksjonelle studier. I denne artikkelen viser vi den cerebroventricular mikroinjeksjon (CVMI) teknikken som et middel til å modulere genuttrykk i den voksne sebrafisk hjernen. Ved å bruke CVMI, kan stoffene administreres inn i det cerebroventricular væske og bli grundig fordelt langs rostrocaudal aksen av hjernen. Vi spesielt fokus på bruk av antisens oligonukleotider morfolino, som er kraftige verktøy for å slå ned genekspresjon in vivo. I vår metode, når den brukes, er morfolino molekyler tas opp av cellene lining ventrikkel overflate. Disse celler inkluderer de radiale glial-celler, som fungerer som nevrogene stamceller. Derfor slå ned genuttrykk i de radiale gliaceller er av største betydning for å analysere den utbredte neurogenesis respons i sebrafisk, og også vil gi innsikt i hvordan virveldyr kunne opprettholde voksen neurogenESIS respons. En slik forståelse vil også bidra til arbeidet for kliniske applikasjoner i humane nevrodegenerative lidelser og sentralnervesystemet regenerering. Dermed vil vi presentere cerebroventricular mikroinjeksjon metoden som en rask og effektiv måte å endre genuttrykk og neurogenesis respons i den voksne sebrafisk forhjerne. Vi tilbyr også feilsøkingstips og annen nyttig informasjon om hvordan du kan utføre CVMI prosedyren.
Voksen neurogenesis er et fellestrekk for virveldyr, men dens grad av utbredelse og effektivitet varierer med fylogeni 1,2,3,4,5,6. For eksempel, voksne pattedyr hjerner inneholder stamceller regioner i stor grad begrenset til 7,8 forhjernen, mens teleost sebrafisk inneholder seksten forskjellige stamcelle domener og tilhørende neurogene soner i hele hjernen 4,5,9,10. Denne variasjonen mellom pattedyr og sebrafisk kan gjenspeile et misforhold i mekanismene for stamcelleforskningen vedlikehold og nevrogen kapasiteten til stamceller. Livslang kompetanse sebrafisk til å produsere nerveceller i hjernen kan også utgjøre kliniske konsekvenser som de molekylære mekanismene ansatt av sebrafisk hjernen kan bli brukt til terapeutiske programmer for å takle de nevrodegenerative lidelser hos mennesker.
Flere stamceller soner av den voksne hjernen zebrafisk har blitt analysert, og det har vist seg at denceller lining ventrikkel overflaten av disse regionene tjene som stamceller 9,11-20. Detaljerte analyser i zebrafisk telencephalon, for eksempel, identifisert de radiale glial-celler, som avgrense ventrikulære overflate av denne hjerne regionen for å være nevrogen progenitorer 19, 20. Dette gjelder for andre regioner som lillehjernen og den optiske Tectum, hvor ventricularly plassert neuroepithelial celler gir nevrogen inngang 16,21. For dette formål, å forstå de molekylære mekanismene som styrer den utbredte nevrogen kompetanse i voksen sebrafisk hjerne krever manipulering av genuttrykk i stamceller.
Ulike metoder ble tidligere beskrevet for modulerende gen-funksjon hos sebrafisk. Disse inkluderer generasjon av betingede transgene linjer uttrykker ønskede varianter av et enkelt protein, plasmid-baserte fokale injeksjoner koblet til electroporation eller kjemiske behandlinger. Vi har tidligere utviklet enmetode for å administrere ulike stoffer, inkludert morfolino oligonukleotidene eller proteiner i den voksne sebrafisk hjernen ved hjelp cerebroventricular mikroinjeksjon som en rask og effektiv måte å modulere gen-funksjon i ventrikulære celler av den voksne sebrafisk forhjernen 22. I våre undersøkelser ble vivo Morpholinos brukt på grunn av deres kjemi som involverer morpholino molekyl kovalent bundet til arginin rike levering peptider, som muliggjør effektiv levering til cellene av interesse, uten behov for ekstra permeabilization eksempel elektroporering 23.. Dette vil gi en grundig målretting av ønsket vev etter injeksjon, akkurat som det vi observerte i voksen sebrafisk telencephalon 22. Bruk av vivo Morpholinos er derfor bedre enn allerede eksisterende metoder for vev målgruppe som elektroporering eller fokale injeksjon av DNA-molekyler.
Her viser vi visuelt hvordan vi utfører denne operasjonen og gi ensteg-for-steg-protokollen. Vi begynner med å forklare fremstillingen av injeksjonen blandingen og fisken som skal injiseres, og fortsetter ved å demonstrere hvordan injeksjonsapparatet er satt opp. Vi gir en beskrivelse av cerebroventricular injeksjon metode, som innebærer generering av et snitt i skallen, og injeksjon av de Morpholinos hjelp microinjector. Vi har også utdype de kritiske punkter man må være forsiktige på under hele prosedyren ved å erklære dem som optimalisering eller feilsøking guider.
Metoden vi beskriver her gir enkel og rask administrasjon av Morpholinos inn i voksen sebrafisk hjernen. Vi har vist at vår injeksjon metode effektivt blokkerer genekspresjon i de ventrikulære celler, og resulterer i funksjonelle konsekvenser i nevrogenesen respons.
Det er viktige punkter å være forsiktige under behandlingen av cerebroventricular mikroinjeksjon. For eksempel, avhengig av effekten av molekyler på morfolino ved konsentrasjonen anvendt. Denne konsentrasjon skal bestemmes av slutt-brukeren. Vi anbefaler at du starter med stamløsning (500 mm) og utføre seriefortynning, og ideelt å pre-test ved injeksjon i embryoer ved hjelp av standard embryo injeksjon protokoller 28-30. Tidligere fikk vi ulike nivåer av knockdown effektivitet med konsentrasjoner av Morpholinos fra 50 mikrometer til 500 mikrometer 22. Andre bør åpningen av glasskapillær ikke være store fee, da dette vil føre til omfattende væske tilstrømning inn i hjernen etter injeksjonen. Likeledes må åpningen ikke være for smal, da dette vil forhindre tilstrekkelig injeksjon. Man kan bestemme den optimale åpningsdefinerende trykk kombinasjon ved å pumpe luft inn i en petriskål med vann. Boblene som oppstår bør være i en enkelt rad, men ikke i flere rader. Vi viser dette i videoen. Tredje, inkubering av fisken i anestetika er kritisk. Fisken bør ikke holdes lenger enn 2 min i anestetika. Dette vil hemme utvinningsgraden etter injeksjonen. Fjerde, plasseringen av innsnitt kritisk for grundig dispergering av den injiserte væske. Den ventrikulære regionen over optisk Tectum er større over midtlinjen og får smalere lateralt. Derfor bør eksperimentator generere slit i skallen nær midtlinjen og bare kaudal til skallen plate dekker telencephalic regionen.
En av fordelene med cerebroventricular injection (CVMI)-metoden er dens rapidness. CVMI er en rask metode for bestemmelse genfunksjon. Denne funksjonen er viktig og nyttig i forhold til generering av transgene linjer for funksjonelle studier, som vanligvis tar flere måneder. I tillegg fører CVMI til jevn fordeling av den injiserte væske, og derfor gir et forholdsvis grundig manipulering av genet aktivitet, i forhold til fokal injeksjoner eller electroporation. Med CVMI, kan flere gener bli slått ned samtidig ved å forberede injeksjon blander inneholder flere Morpholinos oligonukleotid. CVMI kan brukes til å injisere forskjellige konsentrasjoner av en gitt morfolino oligonukleotider, og kan følgelig anvendes for å analysere hypomorphic fenotyper. Endelig, dette injeksjon paradigmet ikke forårsake toksisitet eller kompromiss overlevelsen av dyrene.
Den CVMI teknikken kan bli utvidet for andre typer studier som injeksjon av regulerende peptider, narkotika, plasmid DNA eller regulerende RNA molecules eller andre stoffer som kan påvirke fysiologi av cellene. Analysering kombinasjon av molekyler og utføre dose-respons analyser er mulig ved hjelp av vår metode, slik at å studere hypomorphic fenotyper. Med disse egenskapene, beviser CVMI å være en rask og enkel test for uttrykk studier i voksen sebrafisk hjernen, og åpner opp rask screening og funksjonelle analyser.
Den voksne sebrafisk hjernen kan constitutively produsere nye nerveceller langs hele rostrocaudal aksen og det kan også regenerere etter traumatiske skader. Dette står i sterk kontrast til mammalske hjerne med begrenset nevrogenesen og hvis i det hele tatt, heller dårlig evne til reproduksjon. Slike omfattende stamcelleforskningen aktivitet og rekreasjon muligheten gjør sebrafisk en nyttig modell organisme for å forstå de molekylære programmer som kreves for sentralnervesystemet gjenfødelse, som for tiden er i stor grad ukjent. Derfor undersøker det molekylære grunnlaget for den regenerative evner av zebrafish hjernen er en interessant verden av forskning som kan forklare den grunnleggende forskjellen hvordan fisk og pattedyr hjerner reagerer etter en skade, og også gi gave veier for regenerativ medisinske behandlingsformer hos mennesker. For å forstå den molekylære infrastruktur av virveldyr hjernens plastisitet og regenerering, gliaceller tjene som et viktig forskningsfelt som de er neurogene stamfedre 3,8,20. Dermed bruker CVMI teknikk for å endre gen-funksjon i de radiale gliaceller av sebrafisk hjerne er instrumental i å belyse hvordan fisk hjernen kan par stamfar aktivitet til effektiv voksen neurogenesis og regenerativ respons. Vi har nylig vist engasjement og kravet av flere faktorer og signalveier i regenerativ neurogenesis respons av den voksne sebrafisk hjerne 24,26,27, og disse studiene ble gjort mulig ved bruk av CVMI metoden. Samlet kan den kunnskapen vi får fra sebrafisk hjernen bli brukt til å pålegge regenerative evne til pattedyr gliacellene som reagerer på skader og vil dermed bidra til å utforme kliniske terapi for menneskelige nevrologiske lidelser og akutte skader.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) og Den europeiske union (Zf-Health).
Reagent/Material | |||
CellTracker Red CMTPX | Life Technologies, Invitrogen | C34552 | Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy |
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing the fish |
Petri dishes | Sarstedt | 821,472 | For handling the fish during injection and imaging |
Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | As sterile dilution medium |
Vivo morpholinos | Gene Tools Inc. | Customized | More info on vivo morpholinos: www.gene-tools.com |
Equipment | |||
Barbed-end needle | Becton-Dickinson | 305178 | To generate the incision in the skull |
Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | To snap off the tip of the glass capillary |
Fluorescence camera | Zeiss, Nikon, Leica | Varies with the manufacturer | To visualize the fluorescence after injection |
Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | To hold the fish in position |
Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | For microinjection |
PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjection |
Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjection |
Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | For illuminating the specimen |