I denna artikel, visar vi en metod för manipulering av genuttryck i ventrikulära celler av vuxna zebrafisk telencefalon med antisens morfolinogrupper oligonukleotider. Vi presenterar denna metod som ett effektivt och snabbt protokoll som kan användas för funktionella studier i vuxen ryggradsdjur hjärnan.
Manipulering av genuttryck i vävnader krävs för att utföra funktionella studier. I denna uppsats visar vi cerebroventricular mikroinjektion (CVMI) teknik som ett sätt att modulera genuttryck i den vuxna zebrafisk hjärnan. Genom att använda CVMI kan substanser administreras in i cerebroventricular vätskan och noggrant fördelade längs rostrocaudal axel av hjärnan. Vi fokuserar särskilt på användningen av antisens morfolinogrupper oligonukleotider, som är potenta verktyg för att knacka ner genuttryck in vivo. I vår metod, när den tillämpas, är morfolinogrupper molekyler tas upp av celler som kantar ventrikulära ytan. Dessa celler innefattar de radiella gliaceller, som fungerar som neurogena progenitorer. Därför, knacka ner genuttryck i de radiella gliaceller är av yttersta vikt att analysera den utbredda neurogenesen respons i zebrafisk, och skulle också ge insikt i hur ryggradsdjur kunde tåla vuxen NeurogenESIS svar. En sådan förståelse skulle också hjälpa de insatser för kliniska tillämpningar inom mänskliga neurodegenerativa sjukdomar och centrala nervsystemet förnyelse. Därför presenterar vi cerebroventricular mikroinjektion metoden som ett snabbt och effektivt sätt att förändra genuttryck och neurogenes svar i den vuxna zebrafisk framhjärnan. Vi erbjuder även felsökningstips och annan användbar information om hur man kan genomföra det CVMI förfarandet.
Adult neurogenes är ett gemensamt drag för ryggradsdjur, men graden av förekomst och effektivitet varierar med fylogeni 1,2,3,4,5,6. Till exempel, vuxna däggdjur hjärnor innehåller regioner stamceller i stort sett begränsad till framhjärnan 7,8, medan teleost zebrafisk innehåller sexton olika domäner stamceller och tillhörande neurogena zoner i hela hjärnan 4,5,9,10. Denna variation mellan däggdjur och zebrafisk kan spegla en skillnad i mekanismerna för stamceller underhåll och den neurogena kapacitet stamceller. Den livslånga kompetens zebrafisk att producera nervceller i hjärnan kan också innebära kliniska följder som de molekylära mekanismer som zebrafisk hjärnan skulle kunna utnyttjas för terapeutiska tillämpningar för att ta itu med de neurodegenerativa sjukdomar hos människor.
Flera stamceller zoner av den vuxna zebrafisk hjärnan har analyserats och det har visats attceller som kantar ventrikulära ytan av dessa regioner fungerar som stamceller 9,11-20. Detaljerade analyser i zebrafisk telencefalon, till exempel, identifieras de radiella gliaceller, som avgränsar den ventrikulära ytan av denna hjärnregion att vara neurogena progenitorer 19, 20. Detta gäller för andra regioner såsom lillhjärnan och optiken tectum, där ventricularly-läge neuroepitelceller ger neurogen ingång 16,21. För detta ändamål, att förstå de molekylära mekanismer som styr den utbredda neurogen kompetens i vuxen zebrafisk hjärnan kräver manipulation av genuttryck i stamceller.
Olika metoder har tidigare beskrivits för att modulera geners funktion i zebrafisk. Dessa inkluderar generering av villkorade transgena linjer som uttrycker önskade varianter av ett enda protein, plasmid-baserade fokala injektioner kopplade till elektroporation eller kemiska behandlingar. Vi konstruerade tidigare ettmetod för administrering av olika substanser inklusive morfolino oligonukleotider eller proteiner i den vuxna zebrafisk hjärnan med cerebroventricular mikroinjektion som ett snabbt och effektivt sätt att modulera genfunktion i ventrikulära cellerna hos vuxna zebrafisk framhjärnan 22. I våra studier, var vivo morpholinos användas på grund av deras kemi som involverar morpholino-molekylen kovalent bunden till arginin rika leverans peptider, vilka möjliggör effektiv leverans till cellerna av intresse utan behov av extra permeabilization såsom elektroporation 23. Detta skulle möjliggöra en noggrann inriktning av den önskade vävnaden efter injektionen, precis vad vi observerade i vuxen zebrafisk telencephalon 22. Användning av vivo morpholinos är därför överlägsna redan existerande metoder för vävnad riktar såsom elektroporation eller fokal injektion av DNA-molekyler.
Här visar vi visuellt hur vi utför denna operation och ge ensteg-för-steg-protokoll. Vi börjar med att förklara beredning av injektion blandning och fisken som ska injiceras, och fortsätt genom att påvisa hur injektionen apparaturen sätts upp. Vi tillhandahåller en beskrivning av cerebroventricular injektion metod, som innebär generering av ett snitt i skallen och injektion av morpholinos använder microinjector. Vi utarbetar också på de kritiska punkter man måste vara försiktig med under hela proceduren genom att ange dem som optimering eller felsökning guider.
Den metod som vi beskriver här tillåter enkel och snabb administrering av morpholinos i den vuxna zebrafisk hjärnan. Vi har visat att vårt injektion metod effektivt blockerar genuttryck i ventrikulära celler och resulterar i funktionella konsekvenser i neurogenesisen svar.
Det finns viktiga punkter att vara försiktig när du exekverar cerebroventricular mikroinjektion. Exempelvis beror verkan av morfolino molekyler på den använda koncentrationen. Denna koncentration måste bestämmas av slutanvändaren. Vi rekommenderar att du börjar med stamlösning (500 M) och utföra spädningar, och helst till förtest genom injektion i embryon med hjälp av standard embryo injektion protokoll 28-30. Tidigare fick vi olika nivåer av knockdown effektivitet med koncentrationer av morpholinos från 50 um till 500 iM 22. Andra bör mynningen hos glaskapillär inte large eftersom detta kommer att leda till omfattande flytande inflöde in i hjärnan efter injektionen. På liknande sätt måste öppningen inte vara för snäv eftersom detta kommer att förhindra tillräcklig injektion. Man kan bestämma den optimala öppningen-tryck kombination genom att pumpa in luft i en Petri-skål med vatten. Bubblorna som uppstår bör vara i en enda rad, men inte i flera rader. Vi visar detta i videon. Tredje, inkubering av fisk i anestetika är kritisk. Fisken ska inte sparas längre än 2 min i bedövningsmedel. Detta kommer att hämma återhämtningen hastigheten efter injektionen. Fjärde, är platsen för snittet avgörande för grundligt dispergera den injicerade vätskan. Den ventrikulära regionen under den optiska tectum är större ovanför mittlinjen och blir smalare i sidled. Därför bör försöksledaren generera slitsen i skallen nära mittlinjen och bara kaudalt om skallen plattan täcker telencephalic regionen.
En av fördelarna med det cerebroventricular injection (CVMI)-metoden är dess rapidness. CVMI är en snabb metod för att analysera geners funktion. Den här funktionen är viktig och användbar vid jämförelse med generering av transgena linjer för funktionella studier, som i allmänhet tar flera månader. Dessutom leder CVMI till likformig fördelning av den injicerade vätskan och därför ger en relativt noggrann manipulation av genaktivitet, vid jämförelse med fokala injektioner eller elektroporering. Med CVMI, kan flera gener slås ned samtidigt genom att förbereda injektionen blandar innehåller flera morpholinos oligonukleotid. CVMI kan användas för att injicera olika koncentrationer av en given morfolino oligonukleotider, och kan därför användas för att analysera hypomorphic fenotyper. Slutligen orsakar denna injektion paradigm inte toxicitet eller äventyra överlevnaden hos djuren.
Den CVMI Tekniken kan utvidgas till andra typer av studier såsom injektion av modulatoriska peptider, droger, plasmid-DNA eller modulerande RNA molecules eller andra ämnen som kan påverka fysiologin av cellerna. Testmetoder kombination av molekyler och utföra analyser dos-respons är möjligt med vår metod, vilket studerar hypomorphic fenotyper. Med dessa egenskaper, visar CVMI att vara en snabb och enkel analys för uttryck studier i den vuxna zebrafisk hjärnan, och öppnar upp snabb screening och funktionella analyser.
Den vuxna zebrafisk hjärnan kan konstitutivt producera nya neuroner längs hela rostrocaudal axeln och det kan också regenerera efter traumatiska skador. Detta står i skarp kontrast till däggdjurshjärnor med begränsad neurogenesisen och om alls, ganska dålig regenerativ förmåga. Sådan utbredd stamceller aktivitet och återhämtning förmåga gör zebrafisk en användbar modell organism för att förstå de molekylära program som krävs för centrala nervsystemet regenerering, som för närvarande till stor del okända. Därför undersöker molekylära grunden för regenerativ lämplighet zebrafish hjärnan är en intressant värld av forskning som skulle kunna förklara den grundläggande skillnaden hur fisk och däggdjur hjärnor reagerar efter en skada, och även förse vägar för regenerativa medicinska behandlingar hos människor. För att förstå den molekylära infrastruktur av ryggradsdjur hjärnans plasticitet och regeneration, gliaceller fungerar som ett viktigt forskningsområde, eftersom de är de neurogena stamfäder 3,8,20. Således, med hjälp CVMI teknik för att förändra geners funktion i de radiella gliaceller i zebrafisk hjärnan är avgörande för att belysa hur fiskar hjärnan kan par stamfader aktivitet till effektiv vuxen neurogenes och regenerativ respons. Vi har nyligen visat att involvera och kravet på flera faktorer och signalvägar i den regenerativa neurogenes svaret hos vuxna zebrafisk hjärnan 24,26,27, och dessa studier har möjliggjorts genom användning av CVMI metod. Sammantaget kan den kunskap vi får från zebrafisk hjärnan utnyttjas för att införa regenerative förmåga att däggdjurs gliaceller som reagerar på skador och kommer därmed att hjälpa designa kliniska terapier för mänskliga neurologiska sjukdomar och akuta skador.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) och Europeiska unionen (Zf-hälsa).
Reagent/Material | |||
CellTracker Red CMTPX | Life Technologies, Invitrogen | C34552 | Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy |
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing the fish |
Petri dishes | Sarstedt | 821,472 | For handling the fish during injection and imaging |
Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | As sterile dilution medium |
Vivo morpholinos | Gene Tools Inc. | Customized | More info on vivo morpholinos: www.gene-tools.com |
Equipment | |||
Barbed-end needle | Becton-Dickinson | 305178 | To generate the incision in the skull |
Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | To snap off the tip of the glass capillary |
Fluorescence camera | Zeiss, Nikon, Leica | Varies with the manufacturer | To visualize the fluorescence after injection |
Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | To hold the fish in position |
Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | For microinjection |
PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjection |
Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjection |
Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | For illuminating the specimen |