Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon

doi: 10.3791/50415 Published: May 23, 2013

Summary

Bu yazıda, morfolino antisens oligonükleotidler kullanılarak yetişkin zebrabalıkları telencephalon ventriküler hücrelerde gen ifadesinin manipülasyonu için bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz, yetişkin omurgalı beynin fonksiyonel çalışmalar için kullanılan bir hızlı ve verimli protokolü olarak bu yöntem sunuyoruz.

Abstract

Dokularda gen manipülasyonu fonksiyonel çalışmalar gerçekleştirmek için gereklidir. Bu yazıda, biz yetişkin zebrafish beyinde gen ekspresyon modüle için bir araç olarak cerebroventricular mikroenjeksiyon (CVMI) tekniği göstermektedir. CVMI kullanarak, maddeler cerebroventricular sıvısı içine tatbik edilebilir ve iyice beyin rostro ekseni boyunca dağıtılabilir. Biz özellikle in vivo gen aşağı vurma için güçlü araçlardır antisens morfolino oligonükleotidler, kullanımı üzerine odaklanır. Bizim yöntemde, uygulandığında, morfolino molekülleri ventriküler yüzeyi kaplayan hücreler tarafından alınır. Bu hücreler, nörojenik progenitörlerin olarak hareket radyal glial hücreler bulunmaktadır. Bu nedenle, radyal glial hücreler gen ifadesinin aşağı vurma zebrafish yaygın nöron yanıt analiz etmek büyük önem taşımaktadır ve aynı zamanda omurgalı yetişkin neurogen sürdürmek nasıl fikir sağlayacakyovasküler yanıt. Böyle bir anlayış, insan nörodejeneratif hastalıklar ve merkezi sinir sisteminde rejenerasyon klinik uygulamalar için çabalarını yardımcı olacaktır. Böylece, gen ifadesi ve yetişkin zebrafish ön beyin nöron yanıt değiştirmek için hızlı ve verimli bir şekilde olarak cerebroventricular mikroenjeksiyon yöntemi mevcut. Ayrıca CVMI işlemi yürütmek için nasıl sorun giderme ipuçları ve diğer yararlı bilgiler sağlar.

Introduction

Yetişkin nöron omurgalı için ortak bir özelliktir, ancak sıklığı ve verimlilik derecesi filogeni 1,2,3,4,5,6 göre değişir. Teleost Zebra balığı, tüm beyin 4,5,9,10 on altı farklı kök hücre etki ve ilişkili nörojenik bölümü içeren iken Örneğin, yetişkin memeli beyin büyük ölçüde ön beyin 7,8, sınırlı kök hücre bölgeleri içerir. Memeliler ve Zebra balığı arasındaki bu farklılık kök hücre bakım ve progenitör hücrelerin nörojenik kapasitesinin mekanizmalarında bir eşitsizlik yansıtıyor olabilir. Zebra balığı beyin tarafından kullanılan moleküler mekanizmaları insanlarda nörodejeneratif hastalıkların üstesinden gelmek için tedavi uygulamaları için harnessed olabilir gibi beyindeki nöronlar üretmek için Zebra balığı yaşam boyu yetki de klinik etkileri oluşturabilir.

Yetişkin Zebra beynin birçok kök hücreleri bölgeleri analiz edilmiş ve gösterilmiş olduğuBu bölgelerin ventriküler yüzeyi astar hücreleri progenitör hücrelerin 9,11-20 olarak hizmet vermektedir. Zebrabalıkları telencephalon Detaylı analizler, örneğin, nörojenik ataları 19, 20 olması için bu beyin bölgesi içinde, ventriküler yüzey tasvir radyal glial hücreler, tespit edilmiştir. Bu, beyincik ve nöroepitelyal hücrelerin nörojenik giriş 16,21 sağlamak ventricularly-bulunan optik tectum, diğer bölgeler için de geçerlidir. Bu amaçla, yetişkin zebrafish beyinde yaygın nörojenik yetkinlik düzenleyen moleküler mekanizmaları anlamak progenitör hücrelerin gen ifadesinin manipülasyonu gerektirir.

Çeşitli yöntemler, daha önce zebrabalıkları modüle gen fonksiyonu için tarif edilmiştir. Bunlar, elektroporasyon veya kimyasal muamele ile birleştirilmiş tek bir protein, plazmid bazlı odak enjeksiyon arzu edilen varyantlar ifade koşullu transjenik nesil içerir. Daha önce, bir dizaynyetişkin zebrafish ön beyin 22 ventriküler hücrelerinde modüle gen fonksiyonu hızlı ve etkili bir yol olarak cerebroventricular mikroenjeksiyon kullanarak yetişkin zebrafish beyin içine morfolino oligonükleotidler veya protein gibi çeşitli maddeler yönetmek için yöntem. Çalışmalarda, in vivo morpholinos çünkü kovalent gibi elektroporasyon 23 gibi ekstra permeabilization için gerek kalmadan ilgi hücreleri etkin dağıtım sağlayan zengin teslim peptidler, arginine bağlantılı morfolino molekül içeren kendi kimya kullanılmıştır. Bu enjeksiyondan sonra istenilen doku tam hedefleme, sadece biz yetişkin zebrafish telencephalon 22 gözlenen ne gibi olanak sağlayacak. In vivo morpholinos kullanımı bu yüzden, elektroporasyon veya DNA moleküllerinin odak enjeksiyon olarak hedef doku arasında zaten var olan yöntemler daha üstündür.

Burada, biz bu işlemi gerçekleştirmek ve bir sağlamak nasıl görsel olarak göstermekadım adım protokolü. Biz enjeksiyon karışımı ve enjekte ve enjeksiyon cihazı kurmak nasıl göstererek devam edilecek balık hazırlanması açıklayan ile başlar. Biz mikroenjektör kullanarak morpholinos bir kafatası ve enjeksiyon bir kesi üreten içerir cerebroventricular enjeksiyon yöntemi, bir açıklama sağlar. Ayrıca kritik noktaları optimizasyonu veya sorun giderme olarak belirterek tüm prosedürü sırasında dikkatli olması gerekir, ayrıntılı.

Protocol

1. Enjeksiyon Karışım hazırlanması

  1. Hücreleri daha etkin, normal morfolino molekülleri daha onları içselleştirmek gibi in vivo morpholinos kullanın. Ayrıntılar için üreticinin bilgi (: Reaktifler ve Malzeme Tablo 1) Bkz.
  2. Enjeksiyon doğruluğu görselleştirmek için bir floresan boya izleme (örneğin CellTracker Kırmızı CMTPX, Invitrogen) kullanın. Bu boya, hücre metabolize olur ve yalnızca alımından sonra hücre içinde floresan olur. Bu nedenle, bu adım, verimli bir şekilde cerebroventricular mikroenjeksiyon tarafından hedeflenen hücrelerin belirlenmesi için çok önemlidir.
  3. Hazırlama fosfat-tamponlu salin (PBS) (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) ile seyreltilmesi için morfolino. Morfolino çözeltinin bir seyreltme gerekli ise, her PBS kullanın.
  4. Morfolino çözeltisi 9 ul ve th 1 ul ekleyerek enjeksiyon karışımı 10 ul hazırlanmasıE hücre izci boya (seyreltilmiş veya sulandırılmamış morfolino çözüm stok konsantrasyonu 500 mcM olan 22 morfolino birkaç farklı dozlarda göstermektedir Daha önceki sonuçları -.. 50 mcM 500 mcM kadar - etkin gelen demonte farklı düzeylerde sonuç hypomorphic fenotipleri için demonte). Çözeltinin 1 ul bir zebrabalıkları beyin içine enjeksiyon için yeterlidir.
  5. İyice karıştırın ve enjeksiyon kadar oda sıcaklığında saklayın.

2. Enjeksiyon Aparatı hazırlanması

  1. Bir iğne çektirmenin kullanarak cam enjeksiyon kılcal hazırlayın. Isıtma döngüsü Değeri: 463, döngü değeri çekme: 230, hız: 1.5 sn, saat: 75 msn aşağıdaki parametreleri kullanın.
  2. Basınç kaynağı açın ve 50 psi veya 3,5 bar basınç ayarları yapın.
  3. Aşağıdaki gibi mikroenjektör ayarlarını: basıncı 20 psi, çıkarma basıncı 10 psi, yolluk 2.5 ve 100 msn aralık döneminde değer tutun.
  4. Çevirmekhalka aydınlatıcı ve mikroskop sahne üzerinde halka bulun.
  5. Mikroskop yanında uygun bir konuma kılcal tutucu yerleştirin.
  6. Tutucu içine kılcal cam yerleştirin. 45 derece için enjeksiyon açısını ayarlayın.
  7. Ince uç forseps kullanarak kılcal cam ucu koparmak ve orifis gelen basınç çıkışı kalibre. Bu balık suyu içine iğne ucu çeker ve sürekli bir basınç darbesi verilerek test edilmelidir. Ortaya çıkan hava kabarcıkları optimum basınç / delik boyutlu bir göstergesidir sadece bir satır, olmalıdır. Bu kalibrasyon gösterilmesi için video bakın.
  8. Hava kabarcıkları yakalama olmadan enjeksiyon çözüm kılcal cam yükleyin.
  9. Kılcal cam ve yüklü enjeksiyon çözüm ucu arasındaki hava kaldırmak için basınç uygulayın.

3. Anestezi

  1. Etil-- anestezik stok solüsyonu (% 0.1 MESAB hazırlayınm-aminobenzoat metansülfonat).
  2. Su yeterli miktarda plastik fare kafesleri veya diğer taşıma kabı içine tanklarından balık istediğiniz numarayı çıkarın.
  3. Anestezik stok çözeltisi, 5 ml balık 200 ml su içinde karıştırılarak küçük bir plastik kutu içinde anestezi çözeltisi hazırlayın. Anestezik nihai konsantrasyon: 0.0025% (v / v).
  4. Anestezik bir plastik Petri kabı Yarım doldurun. Enjeksiyonlar için bu çanak kullanın.
  5. Balık Subdues kadar anestetik balık inkübe edin.

4. Kesi ve Cerebroventricular Mikroenjeksiyon

  1. Bir balık net kullanarak kutusundan balık çıkarın ve Petri kabı içine yerleştirin.
  2. Yavaşça biraz aşağı tenteli bir şekilde forseps ve yönlendirmek kafa ile balık tutun. Bu kesi kolaylaştıracaktır.
  3. 30 göstergesi dikenli sonu iğne kullanılarak kafatası küçük bir yarık oluşturun. Iğne sadece uç kullanımı ve daha fazla nüfuz etmezyeterince bu gibi beyin içine beyin dokusunda hasara neden ve kanama olarak tezahür edecek olacaktır.
  4. Balık tutma tutmak ve camın ucu kesi sitesi üzerinden kılcal yerleştirin.
  5. Orient cam ucu telencephalon doğru kılcal. Bu doku hasarı oluşturur ve aynı zamanda enjekte çözeltisinin dispersiyon engeller gibi beyin dokusu dokunmaktan kaçının.
  6. Çözüm enjekte edilir. Sıvı ilaç uygulandıktan hemen sonra dağılır.

5. Kurtarma ve Enjeksiyon Doğruluk Analizi

  1. Taze balık su ile bir plastik kutu içine enjeksiyon kurulum ve yerden balık çıkarın.
  2. Kurtarma sağlar.
  3. Kısa bir süre 0.0025% MESAB ile balık tekrar uyuşturan ve floresan mikroskop altında balık kontrol edin. Kırmızı floresans esaslı bir dağılım sıvısı enjekte yaygın dağılımının bir göstergesidir.
  4. Plastik kutu geri balık koyun.
  5. T plastik kutu bağlayındaha uzun süreler için oksijen balık ve korumak için o dolaşım sistemi.
  6. Bu türden davranış analizi gibi arzu edilen amaçlar için kullanımı balık ya da daha fazla analiz (histolojik boyamalar, immünositokimya, vb) için doku örneklerinin hazırlanması için enjeksiyondan sonra istenilen zaman noktalarında, hayvanlar kurban. 9,11,17-20,24-27: Aşağıdaki referanslar yetişkin zebrafish beyin analiz nasıl örnekler vermek. (% 50'den fazla demonte) etkin bir demonte gözlemlemek için en hızlı zaman bizim çalışmalarda 22, 12 saat oldu.

6. Önerilen Bilimsel Kontrolleri

  1. Bir negatif kontrol olarak herhangi bir fenotip neden gerekiyordu olmayan bir uyumsuzluk morfolino molekül kullanın. Ilgi her gen için ya bir standart morfolino molekül ya da özellikle tasarım morfolino denetimlerini kullanın. Buna ek olarak, mism arasında spesifik olmayan etkileri ya da toksisiteyi değerlendirmek üzere bir başka negatif kontrol olarak (bu durumda, PBS içinde) çözücü maddelermorfolino enjeksiyon / kontrol atch.
  2. PCNA morpholinos pozitif kontroller daha önce 22 açıklanan kullanın. Bu morfolino yetişkin zebrafish beyin (enjeksiyon 1 gün içinde 75-95% demonte verimlilik) 22 etkili demonte neden olur.

Representative Results

Cerebroventricular mikroenjeksiyon enjekte çözüm yaygın dağıtım yol açar

Şekil 1'de tasvir cerebroventricular mikroenjeksiyon iş akışı ve teknik düzeni kullanarak, yetişkin zebrafish beyin içine morfolino oligonükleotidler uygulandı. Doğru bir enjeksiyon protokol ventriküler yüzey (Şekil 2A) yakın hücre hedefleme beyin ve verimli boyunca enjekte edilen sıvının dağılmasına yol açar. Kılcal cam beyin dokusu delip iğneleri, enjeksiyon noktasında (Şekil 2B) de yoğun bir floresan sinyali olacaktır. Enjeksiyon miktarı yeterli değilse, zayıf floresan sinyali (Şekil 2C) gözlenecektir.

Cerebroventricular mikroenjeksiyon yetişkin zebrabalıkları beynin ventriküler bölgede gen ekspresyonu devrilmesi için kullanılabilir

Biz th göstermiştirin vivo morpholinos da ventriküler iç yüzeyine bir kaç hücre çapları nüfuz edebilir ve bu nedenle etkin ventriküler hücreleri (Şekil 3A, 3B), hedef olabilir. Morfolino enjekte edilmesi, bu da protein (Şekil 3C, 3D 'de gösterildiği gibi bir örnek olan PCNA) üretimini azaltmak gibi portatif gen ekspresyonu olabilir. Biz daha önce bu tekniği kullanarak genleri aşağı vurma yetişkin nöron (Şekil 3E, 3F) veya rejenerasyon yanıt (Şekil 3G, 3H) sırasında fonksiyonel sonuçlara yol açtığını göstermiştir. Biz verimli demonte aralığı (% 50'den fazla demonte) morpholinos 22 enjeksiyonundan sonra yaklaşık 12 saat elde edilir olduğunu göstermiştir. Ayrıca verimli demonte süresi yaklaşık 5 gün PCNA protein 22 için enjeksiyon sonrasına kadar olduğu görülmektedir. % 70'den fazla demonte 3 gün enjeksiyon 22 sonrasına kadar görüldü. Demonte eğrileri bağımlı o vardırn endojen proteinler ve morfolino moleküllerin verimliliği ifade seviyesini ve deneyi tarafından her gen için belirlenmelidir. Çalışmalarda, biz morfolino moleküllerin yönetimi yerel ve sistemik toksisite neden olmaz muhtemelen CVMI işlem, hayvanın hayatta kalma ödün görmedim.

Şekil 1
Şekil 1. Cerebroventricular enjeksiyon tekniği şematik. (A), enjeksiyon optik tectum seviyesini (OT, 2), yetişkin zebra balığı (1) ait olan dorsal gerçekleştirilir. Bir kesi bir 30-gauge iğne (3) ile optik tectal kafatası plaka üzerinde yapılır. Cam kılcal kullanarak, morfolino molekülleri ventriküler sıvısı (4) içine enjekte edilir. Kapsamlı bir dispersiyonu olan bir(5) hemen chieved. (B), kanül ve dikenli uç yüksek büyütmede gösterilmiştir. (C) insizyon iğne yönlendirilmesi. (D) kesi daire ve kesik çizgilerle gösterilmiştir. (E) gösterilen ve enjeksiyonu yapılır olarak kılcal enjeksiyon yer alır. Tüm paneller ref adapte edildi. 22. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. Enjeksiyon verimlilik ve doğruluk ile karşılaştırılması. (A) iyi bir enjeksiyon ventriküler yüzeyine yakın hücrelerin hedef yol açar. Kılcal cam beyin dokusu içine takılırsa (B), bu merkezi bir floresan sinyal üretecektir. (C

Şekil 3,
Şekil 3,. . GFP pozitif çekirdekler gösteren transgenik hattı: morfolino penetrasyon, gen hakemin ve fonksiyonel sonuçları verimliliği (A) GFP kontrol telencephalic kesitleri Tg (GFP H2A) morfolino-enjekte üzerinde immün. GFP pozitif çekirdekler gösteren transgenik hattı: (B) GFP Tg (GFP H2A) morfolino-enjekte GFP antisens en telencephalic kesitleri üzerinde immün. Ventriküler bölgede GFP sinyali arasındaki farkı dikkat edin. v: ventrikül. (C) PCNA kontrolü morfolino enjeksiyonlu PCNA pozitif hücrelerin yaygın dağılımını gösteren beyinleri üzerinde immün. ( PCNA antisens morfolino enjeksiyonlu beyinleri üzerinde immün. (E) BrdU ve HUC / D kumanda üzerindeki immün morfolino-enjekte beyinleri 22 önce açıklanan bir BrdU darbe-kovalamaca deney sonra yeni doğan nöronlar belirlemek için. (F) BrdU ve HUC / D 22 önce açıklanan bir BrdU darbe-kovalamaca deney sonra yeni doğan nöronlar belirlemek için PCNA antisens morfolino-enjekte beyinleri üzerinde immün. (G) Knocking aşağıya PCNA CVMI fonksiyonel sonuçlar doğuran demonte endojen gen için kullanılabileceğini gösteren, yeni doğan nöron üretimi önemli bir azalmaya yol açar. Tüm paneller ref adapte edildi. 22 büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Biz burada açıklamak yöntem yetişkin zebrafish beyin içine morpholinos kolay ve hızlı yönetim sağlar. Biz enjeksiyon yöntemi verimli ventriküler hücreleri ve nöron yanıt olarak fonksiyonel önemi ile sonuçlanır gen ekspresyonu bloke olduğunu göstermiştir.

Cerebroventricular mikroenjeksiyon yürütülürken hakkında dikkatli olmak önemli nokta vardır. Örneğin, morfolino moleküllerin etkisi kullanılan konsantrasyona bağlıdır. Bu konsantrasyon, son kullanıcı tarafından belirlenmelidir. Biz standart embriyo enjeksiyon protokolleri 28-30 kullanarak embriyo içine enjeksiyon ile ön test için ideal stok solüsyonu ile başlayan (500 mcM) ve seri dilüsyonları performans tavsiye ve. Daha önce, 50 uM ila 500 uM arasında değişen 22 konsantrasyonda morpholinos demonte verimliliği farklı seviyelerde elde edilmiştir. İkinci olarak, kılcal cam menfez larg olmamalıdırBu e enjeksiyondan sonra beyin içine kapsamlı sıvı akını yol açacaktır. Bu yeterli enjeksiyon önleyecek şekilde Benzer şekilde, açılış çok dar olmamalıdır. Bir su ile bir Petri kabı içine hava pompalayarak en uygun orifis basınç kombinasyonu belirleyebilirsiniz. Ortaya çıkan kabarcıklar ancak birden çok satır tek bir satır olmalıdır. Bu video bu göstermektedir. Üçüncü olarak, anestetik balık kuluçka kritiktir. Balık anestetik 2 dakika daha uzun bir süre tutulması gerekir. Bu enjeksiyondan sonra iyileşme oranı engel olacaktır. Dördüncü olarak, kesi yerini iyice enjekte sıvı dağıtma için önemlidir. Optik tectum üzerinde ventriküler bölge orta hat üzerinde büyük ve yanal dar alır. Bu nedenle, deneyci orta hatta kafatası yakın yarık oluşturmak gerekir ve telencephalic bölgeyi kapsayan kafatası plaka sadece kaudal.

Cerebroventricular injectio avantajlarından biri,n (CVMI) yöntemi, sürat olduğunu. CVMI gen fonksiyonu tahlil için hızlı bir yöntemdir. Genellikle birkaç ay sürebilir fonksiyonel çalışmalar için, transjenik nesil ile karşılaştırıldığında bu özellik önemlidir ve yararlıdır. Buna ek olarak, CVMI enjekte sıvının homojen dağılımına yol açar ve bu nedenle fokal enjeksiyon ya da elektroporasyon ile karşılaştırıldığında gen aktivitesinin nispeten daha ayrıntılı bir düzenleme sağlar. CVMI ile, birden fazla gen enjeksiyon hazırlama birden morpholinos oligonükleotid içeren karışımları aynı anda nakavt olabilir. CVMI belirli bir morfolino oligonükleotid farklı konsantrasyonda enjekte etmek ve bu nedenle hypomorphic fenotipleri analiz etmek için de kullanılabilir kullanılabilir. Son olarak, bu enjeksiyon paradigma toksisite neden ya da hayvanların hayatta kalma ödün vermez.

CVMI teknik, düzenleyici peptidler, uyuşturucu, plazmid DNA veya RNA düzenleyici mo enjeksiyon gibi çalışmaların diğer tip için genişletilmiş olabilirhücre fizyolojisi etkileyebilecek lecules ya da diğer maddeler. Moleküllerin kombinasyonu Assaying ve doz cevap analizleri yapmak mümkün hypomorphic fenotipleri eğitim sağlayan, bizim yöntem kullanıyor. Bu özellikleri ile, CVMI yetişkin zebrafish beyinde ifade çalışmalar için hızlı ve kolay bir test olduğunu kanıtlıyor, ve hızlı tarama ve fonksiyonel analiz açılır.

Yetişkin Zebra balığı Beyin yapısal olarak tüm rostro ekseni boyunca yeni nöronlar üretebilir ve aynı zamanda travmatik yaralanmalar sonra yeniden oluşturabilirsiniz. Bu sınırlı nöron ve hiç değilse, oldukça kötü rejeneratif kapasiteli memeli beyinlerine tezat olduğunu. Bu yaygın kök hücre aktivitesi ve iyileşme yeteneği şu anda büyük ölçüde bilinmemektedir merkezi sinir sistemi rejenerasyon için gerekli olan moleküler programları, anlamak için yararlı bir model organizma Zebra balığı yapar. Bu nedenle, ze olan rejeneratif yetenek moleküler temeli soruşturmabrafish beyin balık ve memeli beyin bir yaralanma sonrası tepki, hem de insanlarda rejeneratif tıp tedavileri için yollar bağışlamak nasıl temel bir fark açıklayabilir araştırma ilginç bir alemdir. Onlar nörojenik ataları 3,8,20 gibi omurgalı beyin plastisite ve yenilenme moleküler altyapı anlamak için, glial hücreler önemli bir araştırma alanı olarak hizmet vermektedir. Böylece, Zebra balığı beynin radyal glial hücrelerde gen fonksiyonu değiştirmek için CVMI tekniği kullanarak açıklık vesile ne kadar balık beyin verimli yetişkin nöron ve rejeneratif yanıt çift progenitör aktivite yapabilirsiniz. Biz son zamanlarda yetişkin zebrafish beyin 24,26,27 ve rejeneratif nöron yanıt olarak çeşitli faktörler ve sinyal yolları katılımı ve ihtiyaç göstermiştir ve bu çalışmaların CVMI yöntemi kullanılarak mümkün yapılmıştır. Genel olarak, biz Zebra balığı beyin kazanç bilgi regene dayatmaya harnessed olabiliryaralanma tepki ve dolayısıyla insan nörolojik bozukluklar ve akut yaralanmalar için klinik tedavi tasarımı yardımcı olacaktır memeli glial hücreler için rative yeteneği.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) ve Avrupa Birliği (ZF-Sağlık) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
CellTracker Red CMTPX Life Technologies, Invitrogen C34552 Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing the fish
Petri dishes Sarstedt 821,472 For handling the fish during injection and imaging
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056 As sterile dilution medium
Vivo morpholinos Gene Tools Inc. Customized More info on vivo morpholinos: www.gene-tools.com
Equipment
Barbed-end needle Becton-Dickinson 305178 To generate the incision in the skull
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer Part of the whole injection setup
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985 To snap off the tip of the glass capillary
Fluorescence camera Zeiss, Nikon, Leica Varies with the manufacturer To visualize the fluorescence after injection
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265 To hold the fish in position
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10 For microinjection
PicoNozzle kit (microinjector holder) World Precision Instruments 5430-12 For microinjection
Pneumatic PicoPump (microinjector) World Precision Instruments SYS-PV820 For microinjection
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG For illuminating the specimen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stocum, D. Regenerative Biology and Medicine. Academic Press. London. (2006).
  2. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat. Rev. Genet. 11, (10), 710-722 (2010).
  3. Doetsch, F., Scharff, C. Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals. Brain Behav. Evol. 58, (5), 306-322 (2001).
  4. Kaslin, J., et al. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363, (1489), 101-122 (2008).
  5. Kizil, C., et al. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev. Neurobiol. 72, (3), 429-461 (2012).
  6. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev. Genes Evol. In Press (2013).
  7. Kempermann, G. Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain. 2nd Edition, Oxford University Press. Oxford. (2010).
  8. Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Cells in the astroglial lineage are neural stem cells. Cell Tissue Res. 331, (1), 179-191 (2008).
  9. Grandel, H., et al. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell. 295, (1), 263-277 (2006).
  10. Chapouton, P., et al. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29, (8), 745-757 (2007).
  11. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295, (1), 278-293 (2006).
  12. Byrd, C. A., Brunjes, P. C. Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish. Neuroscience. 105, (4), 793-801 (2001).
  13. Pellegrini, E., et al. Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish. J. Comp. Neurol. 501, (1), 150-167 (2007).
  14. Lam, C. S., et al. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish. 238, (2), 475-486 (2009).
  15. Wang, X., et al. Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus. Zebrafish. 6, (1), 49-58 (2009).
  16. Kaslin, J., et al. Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche. J. Neurosci. 29, (19), 6142-6153 (2009).
  17. Ganz, J., et al. Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon. Glia. 58, (11), 1345-1363 (2010).
  18. März, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, (7), 870-888 (2010).
  19. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138, (8), 1459-1469 (2011).
  20. Kroehne, V., et al. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138, (22), 4831-4841 (2011).
  21. Ito, Y., et al. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Dev. Biol. 342, (1), 26-38 (2010).
  22. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6, (11), e27395 (2011).
  23. Morcos, P. A., et al. Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues. Biotechniques. 45, (6), 613-614 (2008).
  24. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
  25. Chapouton, P., et al. her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain. Development. 133, (21), 4293-4303 (2006).
  26. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Developmental Cell. 23, (6), 1230-1237 (2012).
  27. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338, (6112), 1353-1356 (2012).
  28. Rosen, J. N., et al. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  29. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  30. Rikin, A., et al. A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis. J. Vis. Exp. (42), e2020 (2010).
Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (75), e50415, doi:10.3791/50415 (2013).More

Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (75), e50415, doi:10.3791/50415 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter