Imagerie du développement vasculaire cérébral chez le poisson zèbre larvaire est décrite. Techniques pour faciliter l'imagerie 3D et modifier le développement vasculaire cérébral en utilisant des traitements chimiques sont également fournis.
Poisson zèbre constituent un outil puissant pour étudier la biologie du développement et de la pathologie in vivo. La petite taille et de la transparence relative des embryons de poisson zèbre les rendent particulièrement utiles pour l'examen visuel des procédés tels que le cœur et le développement vasculaire. Dans plusieurs études récentes Poisson-zèbre transgénique qui exprime l'EGFP dans les cellules endothéliales vasculaires ont été utilisés pour analyser l'image et des réseaux vasculaires complexes dans le cerveau et de la rétine, en utilisant la microscopie confocale. Les descriptions sont fournies à préparer, traiter et l'image embryons de poisson zèbre qui expriment la protéine fluorescente verte (EGFP), puis de générer des rendus 3D complets du système vasculaire cérébral. Protocoles comprennent le traitement des embryons, l'imagerie confocale, et les protocoles de fixation qui préservent la fluorescence de l'EGFP. En outre, des conseils utiles sur l'obtention d'images de haute qualité des structures vasculaires cérébraux, tels que l'élimination de l'œil sans endommager les tissus nerveux à proximité sont fournies. Les pièges à éviteravec l'imagerie confocale sont discutés, ainsi que les mesures nécessaires pour générer des reconstructions 3D à partir de piles d'images confocale en utilisant librement les logiciels open source.
Poisson zèbre fournir un système puissant pour étudier la biologie du développement, et la relative transparence de leurs embryons se prête à des études fondées sur l'imagerie 1. Le poisson zèbre a été utilisé comme un modèle pour le développement des vertébrés pendant des décennies. Téléostéens, y compris le poisson-zèbre, ont un système vasculaire vertébré simplifiée qui n'a pas homologue raisonnable chez les invertébrés. Le sang est pompé à partir de la chambre antérieure d'un coeur à deux chambres par des branchies, où il est oxygéné. Le sang des branchies converge à l'aorte dorsale et passe à travers les artères qui se ramifient en vaisseaux plus petits et plus petits, éventuellement capillaires profonds dans des tissus d'organes. De capillaires oxygène est libéré et le dioxyde de carbone est absorbé. Du côté veineux de capillaires flux sanguin dans les veines plus en plus grandes et est finalement aspiré dans la chambre postérieure du cœur, où le cycle se répète.
Un poisson zèbre adulte peut pondre plus de 200 œufs à la fois, et once fécondé, ils développent rapidement 2. Après une journée de l'axe du corps est bien développé, y compris les muscles ce contrat et se déplacent à l'intérieur de l'embryon la membrane chorionique. De 2-7 jours après la fécondation (DPF) la plupart des systèmes de l'organisme à développer, y compris les yeux et un système nerveux central qui peuvent coordonner nageant vers la nourriture ou à l'écart de la lumière vive. Jusqu'à sept embryons de dpf sont suffisamment petites pour permettre la visualisation par microscopie. Les lignées transgéniques qui expriment des protéines fluorescentes peuvent être imagées par microscopie confocale ou fluorescence. Imagerie confocale peut être couplé avec un logiciel open-source 3 pour créer des rendus 3D de structures vasculaires complets dans embryons de poissons zèbres qui offrent un point de vue des systèmes de biologie du développement vasculaire. Études concernés par des changements dans la complexité vasculaire et cérébro-vasculaire bénéficieront de ce protocole, car elle permet une analyse au niveau des systèmes de réseaux vasculaires 4,5. Une compilation des méthodes et des ressources sont de fournird pour permettre l'adoption simple et de ces techniques pour les études qui nécessitent l'imagerie des structures vasculaires chez le poisson zèbre embryonnaire. Le rapport coût-efficacité de poisson zèbre comme modèle animal est de combiner les technologies émergentes d'imagerie pour fournir de nouvelles plates-formes permettant d'évaluer les effets angiogéniques de voies moléculaires dans le développement des vertébrés et de l'homéostasie.
Les méthodes décrites ici constituent une base pour les études visuelles du système vasculaire dans le développement du poisson zèbre. Spécimens vivants peuvent être utilisés pour évaluer les paramètres physiologiques tels que la fréquence cardiaque et du volume systolique cardiaque, tandis que les échantillons fixes peuvent être utilisés pour l'imagerie confocale à haute résolution. Drosophile et C. elegans pour permettre l'imagerie du corps entier, mais le poisson zèbre sont des vertébrés et de fournir un modèle utile pour les tissus de vertébrés, y compris un système vasculaire endothelial cell-doublé. Ces études peuvent intégrer lignées transgéniques d'importantes ressources génomiques et de la communauté de recherche du poisson zèbre. Reconstruction 3D et le rendu des images confocales de poisson zèbre embryonnaire, tel que décrit ici, permettre une approche de biologie des systèmes à ramification vasculaire et la densité des vaisseaux sanguins qui n'est pas possible avec des modèles animaux plus grands tels que les rats et les souris. En outre, comme le poisson-zèbre amniotes développer dans un environnement modifiables (tampon E3), où l'on peut facilement ajouter cHIMIE qui inhibent les enzymes spécifiques ou d'autres processus qui affectent le développement vasculaire. La concentration et le calendrier de livraison des produits chimiques peuvent être modifiés, permettant le chercheur de conditions de traitement pour affiner.
1. Modifications et dépannage
Toute modification de ce système peuvent intégrer des lignées transgéniques de poisson zèbre qui expriment des protéines fluorescentes EGFP ou autres dans une variété de modèles spécifiques de 10 tissus, organes ou région. En outre, l'analyse des changements néovasculaire de la rétine de poisson zèbre a été récemment publié 5. Problèmes avec la pigmentation dans les embryons de poisson zèbre âgés et les adultes peuvent être compensées par croisement avec des lignées transgéniques qui ne produisent pas de pigments à l'échelle ou pigmentaire rétinien. Problèmes avec la fluorescence diminuée entraînent généralement des conditions de fixation inappropriés. Paraformaldéhyde (4%) pour un jour est optimale, mais fixateurs forts, tels que le glutaraldéhyde, tétroxyde d'osmium ou de l'alcool, peutdétruire la fluorescence de l'EGFP. Après fixation, les embryons doivent être conservés dans du PBS à 4 ° C et toujours protégés des rayons du soleil.
2. Limites de cette technique
La qualité et la résolution de rendus 3D produites avec ce protocole dépendent de la qualité des images générées. Pénétration de la lumière à travers ces embryons est limitée par rapport au plan sagittal médian à l'aide d'un microscope confocal standard. Cet aspect de l'imagerie limite la profondeur de l'imagerie dans les embryons âgés et les adultes, mais les systèmes de microscopie multi-photons les plus avancées pour l'imagerie permet à de plus grandes profondeurs.
3. Importance par rapport aux méthodes existantes
Ce protocole prévoit une approche de l'analyse des réseaux de vaisseaux sanguins au niveau des systèmes qui peuvent intégrer un animal entier. Représentations antérieures de ces données sont souvent appuyés sur des séries d'images disposées ensemble, mais le rendu 3D offre une meilleure résolution de la relation spatialetionships impliqués.
4. Applications futures
Nouveaux développements dans l'imagerie et le traitement des tissus fourniront de nombreuses nouvelles applications pour ces méthodes qui peuvent inclure faire embryons plus âgés ou adultes transparent 11-14. Transparence accrue permettra d'accroître considérablement la pénétration des tissus par des lasers confocale et multi-photons. En outre, comme la vitesse de caméras et des tubes photomultiplicateurs à augmenter rapidement, il peut être possible de produire des rendus 3D de poissons, en temps réel, fournissant une 4 ème dimension de l'analyse.
5. Étapes critiques
Une étape cruciale dans ce protocole est la préparation pour l'imagerie, qui comprend la fixation correcte. L'imagerie doit être fait dès que possible après la fixation des objectifs de haute qualité qui ont les meilleures ouvertures numériques disponibles. Résolution dépend du système d'imagerie utilisé, les systèmes afin de haute qualité sont généralement mieux. Génération des rendus 3D beaucoup de mémoirepour les nouveaux, de sorte que les ordinateurs haut de gamme avec une grande quantité de mémoire et de bons processeurs graphiques sont recommandées.
Le système de la biologie visuelle décrite ici a été optimisé pour le poisson-zèbre transgénique qui exprime l'EGFP dans les cellules endothéliales vasculaires, bien que ces procédés peuvent être adaptés à des embryons transgéniques qui expriment la GFP, ou d'autres protéines fluorescentes, dans des populations de neurones, les muscles, les glandes ou un nombre quelconque de d'autres cellules. Le principal avantage de travailler avec ce système est la possibilité d'étudier ce qui se passe dans tout l'embryon à tout moment pendant cette période de développement, chez les animaux fixes et / ou en direct.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient les membres passés et présents de nos laboratoires qui ont aidé à développer ces techniques. Un financement partiel prévu pour DE par une subvention de l'Institut de la Californie pour la médecine régénérative / CIRM (RN1-00538).
N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC | |
E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipets | |
Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |