يوصف التصوير التنمية الدماغية في الزرد اليرقات. كما يتم توفير التقنيات اللازمة لتسهيل 3D التصوير وتعديل وضع الدماغية باستخدام العلاجات الكيميائية.
الزرد هي أداة قوية لدراسة البيولوجيا التطورية وعلم الأمراض في الجسم الحي. حجم صغير والشفافية النسبية للأجنة الزرد جعلها مفيدة بشكل خاص لفحص البصري للعمليات مثل القلب والأوعية الدموية التنمية. في العديد من الدراسات الحديثة تم استخدام الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن EGFP في الخلايا البطانية في الأوعية الدموية لصورة وتحليل شبكات الأوعية الدموية المعقدة في الدماغ والشبكية، وذلك باستخدام متحد البؤر المجهري. وتقدم وصفا للتحضير، وعلاج الأجنة الزرد الصورة التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر المعززة (EGFP)، ومن ثم توليد الاداءات 3D شاملة للنظام الدماغية. وتشمل بروتوكولات علاج الأجنة، والتصوير متحد البؤر، وبروتوكولات التثبيت التي تحفظ EGFP مضان. علاوة على ذلك، يتم توفير النصائح المفيدة حول كيفية الحصول على صور عالية الجودة من الهياكل الدماغية، مثل إزالة العين دون تلف الأنسجة العصبية في مكان قريب. المزالق المحتملةمع التصوير متحد البؤر وتناقش، جنبا إلى جنب مع الخطوات اللازمة لتوليد اعادة البناء 3D من مداخن صورة متحد البؤر باستخدام متاحة بحرية البرمجيات مفتوحة المصدر.
الزرد توفير نظام قوي لدراسة البيولوجيا التطورية، والشفافية النسبية للأجنة التي هي قابلة للدراسات القائم على التصوير 1. وقد تم الآن استخدام الزرد كنموذج للتنمية الفقاريات على مدى عقود. Teleosts، بما في ذلك الزرد، لديها نظام الأوعية الدموية الفقارية مبسطة التي لا يوجد لديه homolog معقولة في اللافقاريات. يتم ضخ الدم من الغرفة الأمامية من حجرات القلب يومين من خلال الخياشيم، حيث يتم الاوكسيجين ذلك. الدم من الخياشيم يتقاطع في الشريان الأبهر الظهري ويمر عبر الشرايين التي تتفرع إلى سفن أصغر وأصغر، في نهاية المطاف التوصل إلى الشعيرات الدموية في أنسجة الجهاز. داخل الشعيرات الدموية الأكسجين يتم تحريرها ويتم امتصاص ثاني أكسيد الكربون. على الجانب الوريدي من الشعيرات الدموية تدفق الدم إلى الأوردة أكبر وأكبر ويوجه أخيرا في الغرفة الخلفية من القلب، حيث يكرر دورة.
والزرد الكبار يمكن أن تضع 200 بيضة أو أكثر في وقت واحد، وانسه المخصبة، فإنها تتطور بسرعة 2. خلال يوم واحد محور الجسم ومتطورة، بما في ذلك عضلات هذا العقد ونقل الجنين داخل الغشاء حول المشيمي. من 2-7 أيام بعد الإخصاب (DPF) معظم أجهزة الجسم تطوير، بما في ذلك العينين والجهاز العصبي المركزي التي يمكن أن تنسق السباحة نحو الطعام أو بعيدا عن الضوء الساطع. تصل إلى 7 أجنة DPF هي صغيرة بما يكفي للسماح التصور مع المجهري. خطوط المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية يمكن تصوير مع مبائر أو مضان المجهري. يمكن إقران التصوير متحد البؤر مع برمجيات المصدر المفتوح 3 لإنشاء الاداءات 3D هياكل الأوعية الدموية كاملة في الأجنة الزرد التي توفر منظور بيولوجيا الأنظمة من تطوير الأوعية الدموية. والدراسات المعنية مع التغيرات في تعقيد الأوعية الدموية والدماغية تستفيد من هذا البروتوكول لأنها تسمح لإجراء تحليل مستوى أنظمة شبكات الأوعية الدموية 4،5. تجميع للطرق وتوفير المواردد للسماح لسهولة اعتماد وهذه التقنيات للدراسات التي تتطلب التصوير هياكل الأوعية الدموية في الزرد الجنينية. كفاءة التكلفة من الزرد كنموذج للحيوانات يتم الجمع بين تقنيات التصوير الناشئة لتوفير منصات جديدة تستخدمها لتقييم آثار عائية من المسارات الجزيئية في التنمية الفقاريات والتوازن.
الأساليب المذكورة هنا توفير أساس للدراسات البصرية لنظام الأوعية الدموية في تطوير الزرد. عينات حية يمكن استخدامها لتقييم المعلمات الفسيولوجية، مثل معدل ضربات القلب والقلب حجم السكتة الدماغية، في حين عينات ثابتة يمكن استخدامها لعالية الدقة التصوير متحد البؤر. ذبابة الفاكهة وC. ايليجانس تسمح للتصوير الجسم كله، ولكن الزرد هي الفقاريات وتقدم نموذجا مفيدا للأنسجة الفقاريات، بما في ذلك نظام الأوعية الدموية مبطنة الخلايا البطانية. ويمكن لهذه الدراسات تتضمن خطوط المعدلة وراثيا كبيرا والموارد الجيني من مجتمع البحوث الزرد. إعادة الإعمار 3D وجعل من الصور متحد البؤر من الزرد الجنينية، كما هو موضح هنا، والسماح لنهج النظم لعلم الأحياء المتفرعة الأوعية الدموية والدم كثافة السفينة لم يكن ذلك ممكنا مع النماذج الحيوانية الكبيرة مثل الجرذان والفئران. كذلك، amniotes الزرد التطور في بيئة قابلة للتعديل (العازلة E3)، حيث يمكن للمرء بسهولة إضافة جhemicals التي تمنع إنزيمات معينة أو العمليات الأخرى التي تؤثر على التنمية الأوعية الدموية. تركيز وتوقيت التسليم الكيميائية يمكن تغييرها، مما يتيح للباحث ظروف العلاج لصقل.
1. التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
يمكن إدخال تعديلات على هذا النظام دمج خطوط المعدلة وراثيا من الزرد التي تعبر عن البروتينات الفلورية EGFP أو غيرها في مجموعة متنوعة من الأنسجة أو جهاز أو المنطقة أنماط محددة 10. علاوة على ذلك، تم مؤخرا نشر التوعية المستحدثة تحليل التغيرات في شبكية العين الزرد 5. مشاكل مع تصبغ في الأجنة الزرد الكبار في السن ويمكن تعويضها عن طريق عبور مع خطوط المعدلة وراثيا التي لا تنتج على نطاق وأصباغ أو صبغة الشبكية. مشاكل مع مضان تقلص ينتج عادة من ظروف غير ملائمة التثبيت. بارافورمالدهيد (4٪) لمدة 1 يوم هو الأمثل، ولكن قد مثبتات أقوى، مثل غلوتارالدهيد، رباعي أكسيد الأوزميوم أو الكحول،تدمير EGFP مضان. بعد التثبيت، يجب أن تبقى الأجنة في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية ومحمية دائما من أشعة الشمس المباشرة.
2. حدود هذه التقنية
جودة ودقة الأداءات 3D المنتجة مع هذا البروتوكول يعتمد على نوعية الصور ولدت. اختراق الضوء من خلال هذه الأجنة يقتصر على الطائرة منتصف السهمي باستخدام مجهر متحد البؤر القياسية. هذا الجانب من التصوير يحد من عمق التصوير في الأجنة الأكبر سنا والبالغين، ولكن أنظمة متعددة الفوتون المجهري أكثر تقدما تسمح للتصوير في أعماق أكبر.
3. أهمية فيما يتعلق بأساليب القائمة
يوفر هذا البروتوكول مدخلا لتحليل شبكات الأوعية الدموية على مستوى النظم التي يمكن أن تتضمن حيوان بأكمله. كثيرا ما يعتمد التمثيل في وقت سابق من هذه البيانات على مجموعة من الصور التي وضعت معا، ولكنها توفر 3D تقديم أفضل قرار من العالقات المكانيةtionships المعنية.
4. التطبيقات المستقبلية
والتطورات الجديدة في مجال التصوير ومعالجة الأنسجة توفير العديد من التطبيقات الجديدة لهذه الأساليب التي يمكن أن تتضمن الإدلاء الأجنة الأكبر سنا أو البالغين شفافة 11-14. سوف الشفافية المحسن زيادة كبيرة في اختراق الأنسجة بواسطة الليزر متحد البؤر ومتعددة الفوتون. أبعد من ذلك، لأن سرعة الكاميرات وأنابيب مضخم زيادة قد يكون من الممكن قريبا لإنتاج الاداءات 3D من الأسماك في الوقت الحقيقي، وتوفير البعد 4 عشر من التحليل.
5. خطوات حاسمة
خطوة حاسمة في هذا البروتوكول هو إعداد للتصوير، والذي يتضمن تثبيت المناسبة. وينبغي أن يتم التصوير في أقرب وقت ممكن بعد التثبيت مع أهداف الجودة العالية التي لديها أفضل فتحات الرقمية المتاحة. يعتمد القرار على نظام التصوير المستخدمة، وأنظمة الجودة عالية جدا عادة ما تكون أفضل. توليد الاداءات 3D هو الذاكرة المكثفةلذلك أجدد، أجهزة الكمبيوتر الراقية مع كمية كبيرة من الذاكرة ومعالجات رسومات جيدة ويوصى.
وقد تم تحسين نظام البيولوجيا البصرية الموصوفة هنا لالزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن EGFP في الخلايا البطانية في الأوعية الدموية، رغم أن هذه الأساليب يمكن أن تتكيف مع الأجنة وراثيا التي تعبر عن GFP، أو البروتينات الفلورية الأخرى، والسكان من الخلايا العصبية والعضلات والغدد أو أي عدد من الخلايا الأخرى. والميزة الرئيسية في العمل مع هذا النظام هو القدرة على دراسة ما يحدث في الجنين بأكمله في أي وقت خلال هذه الفترة التنموية، في الحيوانات ثابتة و / أو الحية.
The authors have nothing to disclose.
الكتاب أشكر أعضاء في الماضي والحاضر من مختبراتنا الذي ساعد في تطوير هذه التقنيات. التمويل الجزئي المقدمة للDE بمنحة من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي / CIRM (RN1-00538).
N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC | |
E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipets | |
Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |