Imagem do desenvolvimento vascular cerebral em zebrafish larval é descrito. Técnicas para facilitar a imagens 3D e modificar o desenvolvimento vascular cerebral utilizando tratamentos químicos também são fornecidos.
Zebrafish são uma ferramenta poderosa para estudar a biologia do desenvolvimento e patologia in vivo. O tamanho pequeno e transparência relativa de embriões de peixes-zebra tornam particularmente úteis para o exame visual dos processos, tais como o coração e o desenvolvimento vascular. Em vários estudos recentes peixes-zebra transgénicos que expressam GFP em células endoteliais vasculares foram utilizados para a imagem e analisar as redes vasculares complexos no cérebro e na retina, utilizando microscopia confocal. As descrições são fornecidos para preparar, tratar e imagem embriões de peixes-zebra que expressam reforçada proteína verde fluorescente (EGFP), e depois gerar renderings 3D abrangentes do sistema vascular cerebral. Protocolos incluem o tratamento de embriões, imagiologia confocal, e protocolos de fixação que preservam EGFP fluorescência. Além disso, dicas úteis sobre como obter imagens de estruturas vasculares cerebrais, tais como a remoção do olho sem tecido neural nas proximidades prejudicial de alta qualidade são fornecidos. Armadilhas potenciaiscom imagem confocal são discutidas, junto com os passos necessários para gerar reconstruções 3D a partir de pilhas de imagens confocal usando livremente disponível software de código aberto.
Peixe-zebra fornecer um sistema poderoso para estudar a biologia do desenvolvimento, e da transparência relativa dos seus embriões é passível de estudos imagiológicos 1. O peixe-zebra foi agora utilizado como modelo para o desenvolvimento dos vertebrados durante décadas. Teleósteos, incluindo peixe-zebra, possuem um sistema vascular vertebrados simplificada que não tem homólogo razoável em invertebrados. O sangue é bombeado a partir da câmara anterior de uma de duas câmaras do coração através das guelras, onde é oxigenado. O sangue das brânquias converge na aorta dorsal e passa por artérias que se ramificam em vasos cada vez menores, eventualmente atingindo capilares em tecidos de órgãos. Dentro capilares oxigênio é liberado e dióxido de carbono é absorvido. No lado venoso dos capilares sangue flui para veias cada vez maiores e finalmente é arrastado para a câmara posterior do coração, onde o ciclo repete-se.
Um peixe-zebra adulto pode colocar 200 ou mais ovos de cada vez, e once fertilizados, eles desenvolvem rapidamente 2. Dentro de um dia, o eixo do corpo é bem desenvolvida, incluindo os músculos que movem o contrato e embrião em torno de dentro da membrana coriônica. De 2-7 dias pós-fertilização (dpf) a maioria dos sistemas do corpo se desenvolver, incluindo olhos e um sistema nervoso central que possa coordenar nadando em direção a comida ou abrigo da luz brilhante. Até 7 embriões dpf são suficientemente pequenas para permitir a visualização em microscopia. Linhagens transgênicas que expressam proteínas fluorescentes podem ser visualizados com microscopia confocal ou fluorescência. Imagem confocal pode ser emparelhado com software open-source 3 para criar desenhos em 3D de estruturas vasculares completos em embriões de peixe-zebra que fornecem uma perspectiva de biologia de sistemas de desenvolvimento vascular. Estudos relacionados com mudanças na complexidade vascular e cerebrovascular serão beneficiados com este protocolo, uma vez que permite uma análise de nível de sistemas de redes vasculares 4,5. Uma compilação de métodos e recursos são fornecerd para permitir a adoção fácil e destas técnicas para estudos que exigem imagens de estruturas vasculares em peixes-zebra embrionários. A eficiência de custo do peixe-zebra como modelo animal está combinando com as tecnologias de imagem emergentes para fornecer novas plataformas que permitam avaliar os efeitos angiogênicos de vias moleculares no desenvolvimento de vertebrados e homeostase.
Os métodos descritos aqui fornecer uma base para os estudos visuais do sistema vascular no desenvolvimento do peixe-zebra. Os espécimes vivos pode ser usado para avaliar os parâmetros fisiológicos, como freqüência cardíaca e volume de ejeção cardíaca, enquanto as amostras fixas podem ser usados para confocal de alta resolução de imagem. Drosophila e C. elegans permitir a imagiologia de todo o corpo, mas de peixe-zebra são animais vertebrados e fornecer um modelo útil para tecidos de vertebrados, incluindo um sistema vascular forrado de célula endotelial. Estes estudos podem incorporar linhagens transgênicas significativas e recursos genômicos da comunidade de pesquisa do peixe-zebra. Reconstrução 3D e renderização de imagens confocal de peixe-zebra embrionária, como descrito aqui, permitir uma abordagem de biologia de sistemas de ramificação vascular e densidade de vasos sanguíneos que não é possível com modelos animais maiores, como ratos e camundongos. Além disso, como amniotas zebrafish desenvolver em um ambiente modificável (tampão E3), onde se pode facilmente adicionar chemicals que inibem enzimas específicas ou outros processos que afetam o desenvolvimento vascular. A concentração eo tempo de entrega química pode ser alterada, permitindo que o pesquisador condições de tratamento para afinar.
1. Modificações e solução de problemas
Modificações a este sistema pode incorporar linhas de peixes-zebra transgénicos que expressam proteínas fluorescentes EGFP ou outros numa variedade de tecidos, órgãos ou de padrões específicos da região 10. Além disso, a análise de alterações neovasculares da retina de peixe-zebra foi recentemente publicado em 5. Problemas com pigmentação em embriões de peixe-zebra mais velhas e adultos pode ser compensada pelo cruzamento com linhagens transgênicas que não produzem pigmentos escala ou pigmentar da retina. Problemas com fluorescência reduzida tipicamente resultam de condições inadequadas de fixação. Paraformaldeído (4%) durante 1 dia é óptimo, mas fixadores mais fortes, tais como o glutaraldeído, tetróxido de ósmio ou álcool, podedestruir EGFP fluorescência. Após a fixação, os embriões devem ser mantidos em PBS a 4 ° C e sempre protegida da luz solar directa.
2. Limitações desta técnica
A qualidade e resolução de desenhos em 3D produzidos com este protocolo dependem da qualidade das imagens geradas. A penetração de luz através destes embriões se limita ao plano médio-sagital utilizando um microscópio confocal padrão. Este aspecto da imagem limita a profundidade da imagem em embriões mais velhas e adultos, mas os sistemas de microscopia multi-fotão mais avançados permitem a imagem em maiores profundidades.
3. Significado no que diz respeito aos métodos existentes
Este protocolo proporciona uma abordagem para a análise de redes dos vasos sanguíneos em um nível de sistemas que podem incorporar um animal inteiro. Representações anteriores de tais dados, muitas vezes invocada série de imagens dispostas em conjunto, mas a renderização 3D proporciona uma melhor resolução da relação espacialções envolvidas.
4. Aplicações futuras
Novos desenvolvimentos na imagem e processamento de tecidos irá proporcionar muitas novas aplicações para esses métodos que podem incluir fazendo embriões mais velhas ou adultos transparente 11-14. Maior transparência permitirá aumentar significativamente a penetração nos tecidos por lasers confocal e multi-fotão. Além disso, como a velocidade de câmeras e tubos fotomultiplicadores aumentá-lo em breve poderá ser possível a produção de desenhos em 3D de peixes em tempo real, proporcionando uma 4 ª dimensão de análise.
5. Passos críticos
Um passo crítico neste protocolo é a preparação para a imagem latente, que inclui a fixação adequada. Imagem deve ser feito o mais cedo possível após a fixação com os objetivos de alta qualidade que têm as melhores aberturas numéricas disponíveis. A resolução depende do sistema de imagem usado, os sistemas de tão alta qualidade são geralmente melhor. Gerando desenhos em 3D é a memória intensivapara assim mais novos, computadores high-end, com uma grande quantidade de memória e bons processadores gráficos são recomendados.
O sistema de biologia visuais aqui descrita foi optimizado para peixes-zebra transgénicos que expressam GFP em células endoteliais vasculares, embora estes métodos pode ser adaptado a embriões transgénicos que expressam a GFP, ou outras proteínas fluorescentes, em populações de neurónios, músculos, glândulas ou qualquer número de outras células. A principal vantagem em trabalhar com este sistema é a possibilidade de estudar o que está acontecendo em todo o embrião, a qualquer momento durante este período de desenvolvimento, em animais fixos e / ou ao vivo.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem os membros passados e presentes dos nossos laboratórios que ajudaram a desenvolver essas técnicas. Financiamento parcial fornecido ao DE por um subsídio do Instituto Califórnia de Medicina Regenerativa / CIRM (RN1-00538).
N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC | |
E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipets | |
Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |