Larva Zebrafish serebrovasküler gelişme görüntüleme açıklanmıştır. 3D görüntüleme kolaylaştırmak ve kimyasal tedaviler kullanarak serebrovasküler gelişimini değiştirme teknikleri de verilmektedir.
Zebra balığı, in vivo gelişimsel biyoloji ve patoloji incelemek için güçlü bir araçtır. Küçük boyutu ve zebra balığı embriyoların nispi şeffaflık gibi kalp ve damar gelişimi gibi süreçlerinin görsel inceleme için özellikle kullanışlı hale getirir. Birçok son çalışmalarda, vasküler endotelyal hücrelerde EGFP ifade eden transgenik zebra balığı görüntü için kullanıldı ve konfokal mikroskopi kullanılarak, beyinde ve retinada kompleks vasküler ağların analiz. Tanımlar, hazırlama ve tedavi resim gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) ifade zebra balığı embriyolar ve daha sonra serebrovasküler sistemin kapsamlı 3D kaplamalar oluşturmak için temin edilmiştir. Protokoller embriyoların tedavi, konfokal görüntüleme ve EGFP floresan korumak tespit protokolleri bulunmaktadır. Ayrıca, bu tür zararlı yakındaki sinir doku olmadan çıkarılması göz gibi serebrovasküler yapıların, yüksek kaliteli görüntüler elde etme hakkında yararlı ipuçları verilmektedir. Potansiyel tuzaklarkonfokal görüntüleme ile serbestçe kullanılabilir açık kaynak kodlu yazılım kullanarak konfokal görüntü yığınlarının 3D rekonstrüksiyon oluşturmak için gerekli adımları birlikte tartışılmıştır.
Zebra balığı gelişim biyolojisi okumak için güçlü bir sistem sağlamak ve onların embriyoların göreceli saydamlık görüntüleme bazlı çalışmalarda 1 elverişlidir. Zebrafish on yıllardır omurgalı gelişimi için bir model olarak kullanılmıştır. Zebra balığı dahil Teleost'un, omurgasızlar hiçbir makul homoloğunu sahip basitleştirilmiş bir omurgalı damar sistemi var. Kan bu oksijenli solungaçları yoluyla iki bölmeli bir kalbin ön odasından pompalanır. Solungaçları Kan dorsal aorta yakınsarsa ve daha küçük ve daha küçük damarları içine şube arterler, organ dokularında sonunda ulaşan kılcal damarlar yoluyla geçer. Kılcal kısımlar, oksijen içinde serbest bırakılır ve karbon dioksit emilir. Kapiller venöz kan tarafında daha büyük ve büyük damarlar içine akar ve son olarak döngü tekrar kalp, posterior odacık içine çekilir.
Bir yetişkin zebrabalıkları bir seferde 200 veya daha fazla yumurta, ve onc olabilire döllenmiş, hızla 2 gelişir. Bir gün içinde vücut ekseni de koryon zarı içinde etrafında embriyo hareket sözleşme ve kaslar da dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. 2-7 günden sonrası fertilizasyon (DPF) çoğu vücut sistemleri gözleri ve gıda doğru veya uzakta parlak ışıktan yüzme koordine bir merkezi sinir sistemi de dahil olmak üzere, gelişir. Kadar 7 dpf'e embriyolar mikroskobu ile görselleştirme için izin vermek için yeterince küçük. Floresan proteinleri sentezleyen transgenik hatları konfokal veya floresan mikroskobu ile görüntülü olabilir. Konfokal görüntüleme vasküler gelişimin bir sistem biyolojisi bakış açısı sağlamak Zebra balığı embriyolarının tam vasküler yapıların 3 boyutlu görüntü oluşturmak için açık kaynak yazılım 3 ile eşleştirilmiş olabilir. Bu damar ağlarının 4,5 bir sistem düzeyinde analiz için izin verir gibi vasküler ve serebrovasküler karmaşıklığı değişiklikleri ile ilgili çalışmalar, bu protokol yararlanacaktır. Yöntemleri ve kaynakların bir derleme sağlamak vardırembriyonik Zebrafish vasküler yapıların görüntülemesi gerektiren çalışmalar için kolay benimsenmesi ve bu tekniklerin izin d. Bir hayvan modeli olarak zebrabalıkları maliyet etkinliği, omurgalı gelişimi ve homeostazında moleküler yollarının anjiyojenik etkisini değerlendirmek için yeni platformlar sağlamak için ortaya çıkan görüntüleme teknolojileri ile bir araya getirmektedir.
Burada açıklanan yöntemler zebrafish gelişmekte olan damar sistemi görsel çalışmalar için bir temel sağlar. Sabit örnekleri yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme. Drosophila ve C için kullanılabilir ise canlı örnekleri, kalp hızı ve kalp vuruş hacmi olarak fizyolojik parametreleri değerlendirmek için kullanılabilir elegans tüm vücut görüntülemesi için izin verir, ama omurgalıların zebra balığı ve bir endotel hücre-kaplı damar sistemi de dahil olmak üzere omurgalı dokular için yararlı bir model sağlar. Bu çalışmalar Zebrafish araştırma eden önemli transgenik hatları ve genomik kaynaklar dahil edebilirsiniz. 3D rekonstrüksiyonu ve embriyonik zebrabalıkları ikinci eş odaklı görüntü oluşturma, burada açıklandığı gibi, damar dallanması ve bu sıçan ve fareler gibi daha büyük hayvan modelleri ile mümkün değildir damar yoğunluğu ile bir sistem biyoloji yaklaşımı için izin verir. Ayrıca, Zebra balığı değiştirilebilir bir ortamda (E3 tampon) geliştirmek amniotları gibi, nerede bir kolaylıkla c ekleyebilirsinizdamar gelişimini etkileyen belirli enzimleri veya diğer süreçlerini engelleyen hemicals. Kimyasal teslim konsantrasyonu ve zamanlaması araştırmacı ince ayar tedavi koşulları sağlayan, değiştirilebilir.
1.. Değişiklikler ve sorun giderme
Bu sistem değişiklikler doku, organ veya bölgeye özel desenler 10 çeşitli EGFP ya da diğer floresan proteinleri ifade zebrabalıkları transjenik çizgileri dahil olabilir. Bundan başka, zebra balığı retinada neovasküler değişikliklerin analizi son 5 yayınlanmıştır. Büyük embriyolar ve yetişkin zebrabalıkları pigmentasyon problemleri ölçekli pigmentler veya retina pigment üretemez transgenik hatları ile geçerek telafi edilebilir. Azalmış floresan Sorunları genellikle uygunsuz tespit koşullarından kaynaklanabilir. 1 gün boyunca paraformaldehit (% 4) uygun olduğu, ancak bu glutaraldehit, ozmiyum tetroksit veya alkol gibi güçlü bir sabitleyici, mayEGFP floresan yok eder. Fiksasyon sonra, embriyolar 4 ° C'de PBS tutulmalı ve her zaman doğrudan güneş ışığından korunmalıdır.
Bu tekniğin 2. Sınırlamalar
Bu protokol ile üretilen 3D görüntü kalitesi ve çözünürlüğü oluşturulan görüntülerin kalitesine bağlıdır. Bu embriyolar ile ışık penetrasyon standart bir konfokal mikroskop kullanılarak orta sajital düzlem ile sınırlıdır. Bu görüntüleme yönü büyük embriyolar ve yetişkinlerde görüntüleme derinliğini sınırlar, ancak daha gelişmiş çoklu foton mikroskopi sistemleri derinlikte görüntüleme için izin.
Mevcut yöntemlere göre 3. Önemi
Bu protokol, bütün bir hayvan dahil bir sistem bir düzeyde kan damarı ağları analizlerine bir yaklaşım sağlar. Bu verilerin daha önceki temsilleri sık sık birlikte ortaya koydu görüntülerin dizi dayanıyordu, ancak 3D render mekansal Yakınlarının daha iyi çözünürlük sağlariçeriyordu tin.
4. Gelecek uygulamalar
Görüntüleme ve doku işleme yeni gelişmeler yaşlı embriyolar veya yetişkin şeffaf 11-14 yaparak içerebilir, bu yöntemler için yeni uygulamalar sağlayacaktır. Geliştirilmiş şeffaflık büyük ölçüde konfokal ve çoklu foton lazerler doku penetrasyonu artacak. Bundan başka, kamera ve foto çoklayıcı tüplerin hızı gibi yakında bir analiz 4. boyuta sağlayan, gerçek zamanlı olarak balık 3D kaplamalar üretmek mümkün olabilir artar.
5.. Kritik adımlar
Bu protokol kritik bir adım, tam sabitlemeyi içeren görüntüleme için hazırlıktır. Görüntüleme mevcut en iyi sayısal deliklere sahip yüksek kalite hedefleri ile tespitin ardından en kısa sürede yapılmalıdır. Çözünürlük kullanılan görüntüleme sistemine bağlıdır, çok yüksek kalite sistemleri genellikle daha iyi. 3D render üreten, yoğun bellekbellek ve iyi bir grafik işlemciler büyük bir miktarı ile çok daha yeni, yüksek-uç bilgisayarlar için tavsiye edilir.
Bu yöntemler, nöronlar, kas, bezler ya da herhangi bir sayıda popülasyonlarında, GFP ya da diğer floresan proteinleri ifade eden transgenik embriyo adapte edilebilir olsa da, burada açıklanan görsel biyoloji sistemi, vasküler endotelyal hücrelerde EGFP ifade eden transgenik zebrabalıkları için optimize edilmiştir Diğer hücreler. Bu sistemle birlikte çalışma konusunda büyük avantajı sabit ve / veya canlı hayvanlarda, bu gelişim sürecinde herhangi bir anda tüm embriyo neler olduğunu incelemek için yeteneğidir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar bu teknikler geliştirmeye yardımcı laboratuarlarımızda geçmiş ve mevcut üyelerine teşekkür ederim. Kısmi finansman Rejeneratif Tıp / CIRM (RN1-00538) için California Institute hibe tarafından DE sağladı.
N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC | |
E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipets | |
Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |