Billeddannelse af cerebrovaskulær udvikling i larvernes zebrafisk er beskrevet. Teknikker til at lette 3D billedbehandling og ændre cerebrovaskulær udvikling ved hjælp af kemiske behandlinger også.
Zebrafisk er et kraftfuldt værktøj til at studere udviklingsmæssige biologi og patologi in vivo. Den lille størrelse og relative gennemsigtighed i zebrafisk embryoner gør dem særligt anvendelige til visuel undersøgelse af processer såsom hjerte-kar-udvikling. I flere nylige undersøgelser transgene zebrafisk, der udtrykker EGFP i vaskulære endotelceller blev brugt til billede og analysere komplekse vaskulære netværk i hjernen og nethinden, ved hjælp af konfokal mikroskopi. Beskrivelser er forudsat at forberede, behandle og image zebrafisk embryoner, der udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), og derefter generere omfattende 3D-gengivelser af det cerebrovaskulære system. Protokoller omfatte behandling af embryoner, konfokal billedbehandling, og fiksering protokoller, der bevarer EGFP fluorescens. Endvidere er nyttige tips om at få billeder af cerebrovaskulære strukturer, såsom fjernelse øjet uden at beskadige nærliggende neurale væv af høj kvalitet til rådighed. Potentielle faldgrubermed konfokal imaging diskuteres sammen med de nødvendige foranstaltninger til at generere 3D-rekonstruktioner fra konfokal billedstakke bruger frit tilgængelige open source software trin.
Zebrafisk giver et kraftfuldt system til at studere udviklingsmæssige biologi, og den relative gennemsigtighed i deres embryoner er modtagelig for imaging-baserede undersøgelser 1.. Zebrafisk er nu blevet anvendt som en model for vertebrat udvikling i årtier. Benfisk, herunder zebrafisk, har et forenklet hvirveldyr vaskulære system, der ikke har nogen rimelig homolog i hvirvelløse dyr. Pumpes blodet fra det forreste kammer i en to-kamret hjertet gennem gæller, hvor det oxygenerede. Blod fra gællerne konvergerer på ryggens aorta og passerer gennem arterierne, der gren i mindre og mindre fartøjer, til sidst nå kapillærer i orgel væv. Inden kapillærer ilt frigives og kuldioxid absorberes. På den venøse side af kapillærer blod strømmer ind i større og større vener og er endelig trukket ind i bageste kammer i hjertet, hvor cyklus gentager.
En voksen zebrafisk kan lægge 200 eller flere æg ad gangen, og once befrugtet, udvikler de hurtigt 2. Inden for én dag kroppen aksen er veludviklet, herunder muskler, kontrakt og flytte fosteret rundt inde i chorion membran. Fra 2-7 dage efter befrugtningen (DPF) de fleste af kroppens systemer udvikler sig, herunder øjne og en central nervesystem, der kan koordinere svømme mod mad eller væk fra stærkt lys. Op til 7 dpf embryoner er små nok til at muliggøre visualisering med mikroskopi. Transgene linier, der udtrykker fluorescerende proteiner kan afbildes med konfokal eller fluorescensmikroskopi. Konfokal imaging kan parres med open source-software 3 for at skabe 3D-gengivelser af komplette vaskulære strukturer i zebrafisk embryoner, der giver en systembiologi perspektiv af vaskulær udvikling. Undersøgelser beskæftiger sig med ændringer i vaskulær og cerebrovaskulær kompleksitet vil drage fordel af denne protokol, da det giver mulighed for en systemniveau analyse af vaskulære netværk 4,5. En samling af metoder og ressourcer er at gived for at give mulighed for nem vedtagelse og af disse teknikker til undersøgelser, der kræver billedbehandling af vaskulære strukturer i embryonale zebrafisk. Omkostningseffektivitet zebrafisk som en dyremodel er at kombinere med nye imaging teknologier til at levere nye platforme til at vurdere, angiogene effekter af molekylære veje i hvirveldyr udvikling og homeostase.
De her beskrevne metoder giver et fundament for visuelle undersøgelser af det vaskulære system i udviklingslandene zebrafisk. Levende enheder kan bruges til at vurdere fysiologiske parametre, såsom puls og hjerte slagtilfælde volumen, mens faste prøver kan bruges til høj opløsning konfokal billedbehandling. Drosophila og C. elegans mulighed for hele kroppen, men her zebrafisk er hvirveldyr og giver en nyttig model for vertebrate væv, herunder en endotelcelle-foret vaskulære system. Disse undersøgelser kan omfatte betydelige transgene linjer og genomiske ressourcer fra zebrafisk forskningsmiljø. 3D rekonstruktion og gengivelse af konfokal billeder fra embryonale zebrafisk, som beskrevet her, give mulighed for en systembiologi tilgang til vaskulær forgrening og blodkar tæthed der ikke er muligt med større dyremodeller, såsom rotter og mus. Yderligere, da amniotes zebrafisk udvikle sig i en modificerbare miljø (E3 buffer), hvor man kan nemt tilføje chemicals der hæmmer specifikke enzymer eller andre processer, der påvirker vaskulær udvikling. Koncentrationen og timingen af kemiske levering kan ændres, således at forskeren at finjustere behandling forhold.
1. Ændringer og fejlfinding
Modifikationer til dette system kan inkorporere transgene linjer af zebrafisk, der udtrykker EGFP eller andre fluorescerende proteiner i en lang række væv, organ eller en region specifikke mønstre 10. Endvidere har analyse af neovaskulære ændringer i zebrafisk nethinden for nylig blevet publiceret 5.. Problemer med pigmentering i ældre fostre og voksne zebrafisk kan kompenseres ved at krydse med transgene linier, der ikke producerer skala pigmenter eller retinal pigment. Problemer med formindsket fluorescens typisk resultere fra upassende fikseringen forhold. Paraformaldehyd (4%) i 1 dag er optimal, men stærkere fikseringsmidler, såsom glutaraldehyd, osmiumtetroxid eller alkohol, kanødelægge EGFP fluorescens. Efter fiksering bør embryoner opbevares i PBS ved 4 ° C og altid er beskyttet mod direkte sollys.
2. Begrænsninger af denne teknik
Den kvalitet og opløsning af 3D-gengivelser produceret med denne protokol afhænger af kvaliteten af billeder, der genereres. Lysgennemtrængning gennem disse embryoner er begrænset til midten Sagittalplan hjælp af en standard konfokal mikroskop. Dette aspekt af imaging begrænser dybden af billeddannelse i ældre fostre og voksne, men mere avancerede multi-foton mikroskopi-systemer giver mulighed for billedbehandling på større dybder.
3.. Betydning i forhold til de eksisterende metoder
Denne protokol giver en tilgang til analysen af blodkarrenes netværk på uddannelsessystemerne, der kan inkorporere en hel dyr. Tidligere fremstillinger af disse data ofte påberåbte serie af billeder, der ud sammen, men 3D-rendering giver bedre opløsning af det rumlige forholdverandører involveret.
4.. Fremtidige anvendelser
Ny udvikling i billedbehandling og vævsbehandlingen vil give mange nye applikationer til disse metoder, der kan omfatte at gøre ældre fostre eller voksne gennemsigtig 11-14. Øget gennemsigtighed vil i høj grad øge vævspenetration ved konfokal og multi-foton lasere. Yderligere, da hastigheden af kameraer og fotomultiplikatorrør øge det kan snart være muligt at producere 3D-gengivelser af fisk i realtid, hvilket giver en 4. dimension af analysen.
5.. Kritiske trin
Et afgørende skridt i denne protokol er forberedelse til billedbehandling, som omfatter korrekt fiksering. Billeddiagnostik bør ske så hurtigt som muligt efter fiksering med høj kvalitet mål, der har de bedste numeriske åbninger til rådighed. Opløsning afhænger af det billeddannende system, der anvendes, så systemer af høj kvalitet er generelt bedre. Generering 3D-gengivelser er hukommelse intensivfor så nyere, high-end computere med en stor mængde hukommelse og god grafik-processorer anbefales.
Den visuelle biologi her beskrevne system er blevet optimeret til transgene zebrafisk, der udtrykker EGFP i vaskulære endotelceller, selv om disse fremgangsmåder kan tilpasses til transgene embryoner, der udtrykker GFP eller andre fluorescerende proteiner, i populationer af neuroner, muskler, kirtler eller en række andre celler. Den største fordel i at arbejde med dette system er evnen til at studere, hvad der sker i hele embryo på noget tidspunkt i løbet af denne udviklingsmæssige periode, i faste og / eller levende dyr.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker tidligere og nuværende medlemmer af vores laboratorier, der hjalp med at udvikle disse teknikker. Delvis finansiering til DE af en bevilling fra California Institute til regenerativ medicin / CIRM (RN1-00538).
N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC | |
E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipets | |
Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |