Beeldvorming van cerebrovasculaire ontwikkeling in larvale zebravis wordt beschreven. Technieken om 3D-beeldvorming te vergemakkelijken en het gebruik van chemische behandelingen cerebrovasculaire ontwikkeling passen zijn ook aanwezig.
Zebravis is een krachtig hulpmiddel om de ontwikkelingsbiologie en pathologie te bestuderen in vivo. Het kleine formaat en de relatieve transparantie van de zebravis embryo's maken ze bijzonder nuttig voor het visuele onderzoek van de processen, zoals hart-en vasculaire ontwikkeling. In verschillende recente studies transgene zebravis die EGFP expressie in vasculaire endotheelcellen werden gebruikt om beelden en complexe vasculaire netwerken te analyseren in de hersenen en het netvlies, met confocale microscopie. Beschrijvingen zijn gegeven voor te bereiden, te behandelen en imago zebravis embryo's die versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP) te uiten, en dan het genereren van uitgebreide 3D renderings van het cerebrovasculaire systeem. Protocollen omvatten de behandeling van embryo, confocale beeldvorming en fixatie protocollen die EGFP fluorescentie behouden. Verder, nuttige tips over het verkrijgen van beelden van hoge kwaliteit van cerebrovasculaire structuren, zoals het verwijderen van de ogen zonder schadelijke nabijgelegen zenuwweefsel zijn aanwezig. Mogelijke valkuilenmet confocale beelden worden besproken, samen met de stappen die nodig zijn om 3D-reconstructies van confocale beeld stapels met behulp van vrij beschikbare open source software te genereren.
Zebravis een krachtig systeem om ontwikkelingsbiologie te bestuderen, en de relatieve transparantie van hun embryo vatbaar is voor-imaging gebaseerde studies 1. De zebravis is nu gebruikt als een model voor de ontwikkeling van vertebraten decennia. Teleosten, met inbegrip van de zebravis, een vereenvoudigde gewervelde vasculaire systeem dat geen redelijk homoloog in ongewervelde dieren heeft. Bloed wordt door kieuwen, waar het zuurstof uit de voorste kamer van een twee-chambered hart gepompt. Bloed uit de kieuwen convergeert op de dorsale aorta en loopt door slagaders die tak in kleinere en kleinere schepen, en bereikte uiteindelijk haarvaten in orgaanweefsels. Binnen haarvaten zuurstof vrijkomt en kooldioxide wordt geabsorbeerd. Aan de aderlijke kant van capillairen bloed stroomt in steeds grotere aders en uiteindelijk getrokken in de achterste kamer van het hart, waarbij de cyclus herhaalt.
Een volwassen zebravissen kunnen 200 of meer eieren te leggen in een tijd, en ONCe bevrucht, ontwikkelen ze snel 2. Binnen een dag het lichaam as is goed ontwikkeld, met inbegrip van spieren die overeenkomst en het embryo verplaatsen binnen het chorion membraan. Vanaf 2-7 dagen na de bevruchting (DPF) de meeste systemen van het lichaam te ontwikkelen, met inbegrip van ogen en een centrale zenuwstelsel die kan coördineren zwemmen ten opzichte van voedsel of uit de buurt van fel licht. Tot 7 dpf embryo's zijn klein genoeg om voor visualisatie met microscopie. Transgene lijnen die fluorescerende eiwitten tot expressie kunnen worden afgebeeld met confocale of fluorescentie microscopie. Confocale beeldvorming kan worden gecombineerd met open-source software 3 naar 3D renderings van complete vasculaire structuren te creëren in de zebravis embryo's die een systeembiologie perspectief van vasculaire ontwikkeling. Bezig met veranderingen in de vasculaire en cerebrovasculaire complexiteit studies zullen profiteren van dit protocol omdat het zorgt voor een systeemniveau analyse van vasculaire netwerken 4,5. Een compilatie van methoden en middelen te verstrekkend om gemakkelijk te kunnen aannemen en van deze technieken voor studies die beeldvorming van vasculaire structuren in embryonale zebravis vereisen. De kostenefficiëntie van de zebravis als diermodel is het combineren met opkomende imaging technologieën om nieuwe platforms waarmee angiogene effecten van moleculaire pathways in gewervelde ontwikkeling en homeostase beoordelen.
De hier beschreven methoden leveren een basis voor visueel onderzoek van het vaatstelsel in het ontwikkelen van de zebravis. Levende exemplaren kunnen worden gebruikt om fysiologische parameters, zoals hartslag en slagvolume beoordelen, terwijl gefixeerde monsters kunnen worden gebruikt voor hoge-resolutie confocale beeldvorming. Drosophila en C. elegans zorgen voor het gehele lichaam, maar zebravis zijn vertebraten en een nuttig model voor gewervelde weefsels, met inbegrip van een endotheelcel beklede bloedvaten. Deze studies kunnen belangrijke transgene lijnen en genomische hulpbronnen te nemen vanuit de zebravis onderzoeksgemeenschap. 3D reconstructie en weergave van confocale beelden van embryonale zebravis, zoals hier beschreven, zorgen voor een systeembiologie aanpak van vasculaire vertakking en bloedvat dichtheid die niet mogelijk is met grotere diermodellen zoals ratten en muizen. Verder, zoals amniotes zebravis ontwikkelen in een veranderbare omgeving (E3 buffer), waar men kan gemakkelijk c toevoegenhemicals die specifieke enzymen of andere processen die vasculaire ontwikkeling beïnvloeden remmen. De concentratie en de timing van chemische levering kan worden gewijzigd, zodat de onderzoeker te fine-tunen van de behandeling.
1. Wijzigingen en het oplossen van problemen
Wijzigingen in dit systeem transgene lijnen zebravis die EGFP of andere fluorescerende eiwitten tot expressie in een verscheidenheid van weefsel, orgaan of regiospecifieke patronen 10 opgenomen. Verdere analyse van neovasculaire ontwikkeling van de zebravis netvlies is onlangs gepubliceerd 5. Problemen met de pigmentatie in oudere embryo's en volwassen zebravissen kan worden gecompenseerd door kruising met transgene lijnen die niet produceren schaal pigmenten of retinale pigment. Problemen met verminderde fluorescentie meestal het gevolg zijn van een onjuiste fixatie voorwaarden. Paraformaldehyde (4%) gedurende 1 dag optimaal, maar sterker fixatieven, zoals glutaaraldehyde, osmiumtetroxide of alcohol, kanvernietigen EGFP fluorescentie. Na fixatie moet embryo in PBS bewaard bij 4 ° C en altijd beschermd tegen direct zonlicht.
2. Beperkingen van deze techniek
De kwaliteit en de resolutie 3D renderings geproduceerd met dit protocol afhankelijk van de kwaliteit van de beelden gegenereerd. Lichtinval door middel van deze embryo's is beperkt tot het sagittale middenvlak met een standaard confocale microscoop. Dit aspect van de beeldvorming beperkt de diepte van de beeldvorming bij oudere embryo's en volwassenen, maar meer geavanceerde multi-foton microscopie systemen maken het mogelijk voor de beeldvorming op grotere diepte.
3. Belang met betrekking tot bestaande methoden
Dit protocol stelt een aanpak voor de analyse van netwerken bloedvat op een systeem dat zorgt voor een hele dier kan nemen. Eerdere voorstellingen van deze gegevens vaak ingeroepen reeks samen aangelegd beelden, maar 3D-weergave zorgt voor een betere resolutie van de ruimtelijke relatietionships betrokken.
4. Toekomstige toepassingen
Nieuwe ontwikkelingen in de beeldvorming en weefselverwerking zullen veel nieuwe toepassingen voor deze methoden die kunnen bestaan uit het maken van oudere embryo's of volwassenen transparant 11-14 bieden. Meer transparantie zal sterk toenemen weefselpenetratie door confocale en multi-foton-lasers. Verder, aangezien de snelheid van camera en fotomultiplicatorbuizen verhogen binnenkort mogelijk om 3D weergaven van de vissen in realtime, die een 4e dimensie analyse.
5. Kritische stappen
Een cruciale stap in dit protocol is de voorbereiding voor de beeldvorming, die een goede fixatie omvat. Imaging moet zo snel mogelijk na fixatie met een hoge kwaliteit doelstellingen die de beste numerieke openingen beschikbaar hebben. Afhankelijk van de gebruikte beeldvormingssysteem gebruikt zodat hoogwaardige systemen algemeen beter. Het genereren van 3D-renderings vergt veel geheugenvoor zo nieuwere, high-end computers met een grote hoeveelheid geheugen en goede grafische processors worden aanbevolen.
De visuele biologie systeem beschreven is geoptimaliseerd voor transgene zebravis die EGFP expressie in vasculaire endotheelcellen, maar deze werkwijzen kunnen worden aangepast om transgene embryo's die GFP of andere fluorescerende eiwitten tot expressie, in populaties van neuronen, spieren, klieren of een aantal andere cellen. Het grote voordeel van het werken met dit systeem is de mogelijkheid om te onderzoeken wat er in het gehele embryo op enig moment gedurende deze ontwikkelingsfase in vaste en / of levende dieren.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken verleden en huidige leden van onze laboratoria die heeft geholpen deze technieken te ontwikkelen. Gedeeltelijke financiering door een subsidie van het California Institute for Regenerative Medicine / CIRM (RN1-00538) naar DE verstrekt.
N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC | |
E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipets | |
Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |