Imaging von zerebrovaskulären Entwicklung in Zebrafisch-Larven beschrieben. Techniken zur 3D-Bildgebung zu erleichtern und zu ändern zerebrovaskuläre Entwicklung mit chemischen Behandlungen sind ebenfalls vorhanden.
Zebrafische sind ein mächtiges Werkzeug, um die Entwicklungsbiologie und Pathologie in vivo zu untersuchen. Die geringe Größe und die relative Transparenz der Zebrafisch-Embryonen machen sie besonders geeignet für die visuelle Untersuchung der Prozesse, wie Herz-und Gefäßentwicklung. In mehreren aktuellen Studien wurden transgene Zebrafisch, die EGFP in vaskulären Endothelzellen exprimieren zur Abbildung und Analyse komplexer Gefäßnetze im Gehirn und Netzhaut, mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Beschreibungen sind vorgesehen, um vorzubereiten, zu behandeln und Bild Zebrafischembryonen, die verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) ausdrücken, und dann erzeugen umfassende 3D-Renderings des zerebrovaskulären Systems. Protokolle umfassen die Behandlung von Embryonen, konfokale Bildgebung, und die Fixierung Protokolle, die EGFP-Fluoreszenz zu bewahren. Weiterhin werden nützliche Tipps für die Beschaffung qualitativ hochwertiger Bilder von zerebrovaskulären Strukturen, wie das Auge die Entfernung ohne Beschädigung in der Nähe von Nervengewebe zur Verfügung gestellt. Mögliche Fallstrickemit konfokaler Bildgebung diskutiert, zusammen mit den notwendigen 3D-Rekonstruktionen aus konfokalen Bildstapeln mit frei verfügbaren Open-Source-Software erzeugen Schritte.
Zebrafisch bieten ein leistungsfähiges System zur Entwicklungsbiologie zu studieren, und die relative Transparenz ihrer Embryonen zugänglich ist Imaging-basierte Studien ein. Der Zebrafisch ist nun als Modell für die Entwicklung von Wirbeltieren seit Jahrzehnten eingesetzt. Knochenfischen, einschließlich Zebrafisch, eine vereinfachte Wirbelkreislauf-System, die keine angemessenen Homolog in Wirbellosen hat. Blut wird aus der vorderen Kammer eines Zwei-Kammer-Herz durch Kiemen, wo es mit Sauerstoff angereichert wird, gepumpt. Blut von den Kiemen konvergiert an der dorsalen Aorta und durch Arterien, Zweig in immer kleinere Schiffe erreicht schließlich Kapillaren in Organgeweben. Innerhalb Kapillaren Sauerstoff freigesetzt und Kohlendioxid absorbiert. Auf der venösen Seite des Blut Kapillaren fließt in immer größeren Venen und wird schließlich in die hintere Kammer des Herzens, wobei der Zyklus wiederholt gezogen.
Ein erwachsener Zebrafisch kann 200 oder mehr Eier auf einmal legen und ONCE befruchtet, entwickeln sie schnell zwei. Innerhalb eines Tages die Körperachse ist gut entwickelt, einschließlich der Muskeln, die Vertrags-und um den Embryo innerhalb der Chorion-Membran zu bewegen. Von 2-7 Tage nach der Befruchtung (DPF) die meisten Körpersysteme zu entwickeln, einschließlich der Augen und des Zentralnervensystems, die koordinieren können schwimmen in Richtung Essen oder weg von hellem Licht. Bis zu 7 dpf Embryonen sind klein genug, um für die Visualisierung mit der Mikroskopie zu ermöglichen. Transgene Linien, die fluoreszierende Proteine exprimieren, können mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie oder abgebildet werden. Die konfokale Bildgebung kann mit Open-Source-Software 3 bis 3D-Renderings von kompletten Gefäßstrukturen in Zebrafischembryonen, die einen systembiologischen Perspektive der Gefäßentwicklung bieten erstellen gepaart werden. Mit Veränderungen in der Gefäß-und zerebrovaskuläre Komplexität betreffenden Studien werden von diesem Protokoll profitieren, da sie ermöglicht eine Analyse der Systemebene Gefäßnetze 4,5. Eine Zusammenstellung von Methoden und Ressourcen zur Verfügung stellend für die einfache Annahme und dieser Techniken für Studien, die Abbildung von Gefäßstrukturen in embryonalen Zebrafisch erfordern können. Die Kosteneffizienz der Zebrafisch als Tiermodell ist mit Schwellen Imaging-Technologien kombinieren, um neue Plattformen, mit dem angiogenen Effekte der molekularen Signalwege in der Wirbeltierentwicklung und Homöostase beurteilen zu können.
Die hier beschriebenen Methoden bieten eine Grundlage für die visuelle Untersuchungen des Gefäßsystems bei der Entwicklung von Zebrafisch. Lebende Exemplare können verwendet werden, um physiologische Parameter, wie die Herzfrequenz und die Herzschlagvolumen zu beurteilen, während feste Proben für hochauflösende konfokale Bildgebung. Drosophila und C eingesetzt werden elegans ermöglichen Ganzkörper-Bildgebung, aber Zebrafisch sind Wirbeltiere und ein nützliches Modell für Wirbeltiergewebe, einschließlich einer Endothelzellen ausgekleidet Gefäßsystem. Diese Studien können erhebliche transgenen Linien und genomische Ressourcen aus dem Zebrafisch-Forschung zu integrieren. 3D-Rekonstruktion und Wiedergabe von konfokalen Bildern aus embryonalen Zebrafisch, wie hier beschrieben, ermöglichen einen systembiologischen Ansatz, um Gefäßverzweigung und Blutgefäßdichte, die nicht mit größeren Tiermodellen, wie Ratten und Mäusen ist möglich. Ferner ist, wie Zebrafisch Amnioten entwickeln in einer modifizierbaren Umwelt (E3-Puffer), wo man leicht hinzufügen chemicals, die bestimmte Enzyme oder andere Prozesse, die Gefäßentwicklung beeinflussen zu hemmen. Die Konzentration und der Zeitpunkt der Lieferung kann chemisch verändert werden, so dass die Forscher die Feinabstimmung Behandlungsbedingungen.
1. Änderungen und Fehlersuche
Modifikationen dieses Systems können transgene Linien, die EGFP Zebrafisch oder andere fluoreszierende Proteine exprimieren, in einer Vielzahl von Gewebe, Organ oder einer Region spezifische Muster 10 zu integrieren. Ferner Analyse der neovaskulären Änderungen im Zebrafisch Retina wurde kürzlich veröffentlicht 5. Probleme mit Pigmentierung bei älteren Embryonen und erwachsenen Zebrafisch kann durch Kreuzung mit transgenen Linien, die Skala Pigmente oder Netzhautpigment produzieren nicht kompensiert werden. Probleme mit verminderter Fluoreszenz typischerweise vor unangemessenen Bedingungen Fixierung führen. Paraformaldehyd (4%) für 1 Tag ist optimal, aber stärker Fixiermittel, wie Glutaraldehyd, Osmiumtetroxid oder Alkohol,zerstören EGFP Fluoreszenz. Nach der Fixierung sollte Embryonen in PBS bei 4 ° C aufbewahrt werden und immer vor direkter Sonneneinstrahlung geschützt.
2. Einschränkungen dieser Technik
Die Qualität und Auflösung der 3D-Renderings mit diesem Protokoll erzeugt, hängt von der Qualität der Bilder erzeugt. Lichtdurchlässigkeit durch diese Embryonen zu der Mitte Sagittalebene mit einem Standard-Konfokalmikroskop beschränkt. Dieser Aspekt der Bild begrenzt die Tiefe der Bildgebung bei älteren Embryonen und Erwachsene, aber mehr erweiterte Multi-Photonen-Mikroskopie-Systeme ermöglichen für die Bildgebung in größeren Tiefen.
3. Bedeutung in Bezug auf bestehenden Methoden
Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für die Analyse von Blutgefäßnetze auf Systemebene, die eine ganze Tier integrieren können. Frühere Darstellungen solcher Daten oft angeführte Reihe von Bildern zusammen gelegt, aber 3D-Rendering bietet eine bessere Auflösung der räumlichen Beziehungenhungen beteiligt.
4. Zukünftige Anwendungen
Neue Entwicklungen in der Bildgebung und Gewebeverarbeitung bieten viele neue Anwendungen für diese Methoden, die zählen können machen älteren Embryonen oder Erwachsene transparent 14.11. Verbesserte Transparenz Gewebepenetration deutlich erhöhen durch konfokale und Multiphotonen-Laser. Ferner ist, wie die Geschwindigkeit der Kameras und Photomultiplier-Röhren zu erhöhen kann es bald möglich sein wird, um 3D-Renderings von Fischen in Echtzeit zu erzeugen, die eine 4. Dimension Analyse.
5. Kritische Schritte
Ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll ist die Vorbereitung für die Bildgebung, die die ordnungsgemäße Fixierung beinhaltet. Imaging sollte nach der Fixierung mit hohen Qualitätszielen, die die besten numerischen Aperturen zur Verfügung haben so schnell wie möglich durchgeführt werden. Auflösung ist abhängig von der Abbildungssystem verwendet werden, sind so hoch, Qualitätssysteme in der Regel besser. Generieren von 3D-Renderings ist speicherintensivfür so neuere, High-End-Computer mit einer großen Menge an Speicher und gute Grafik-Prozessoren empfohlen.
Die hier beschriebene optische System ist für die Biologie transgenen Zebrafisch, das EGFP in vaskulären Endothelzellen exprimieren optimiert, wenn diese Verfahren auf die GFP-transgenen Embryos oder andere fluoreszierende Proteine exprimieren, in Populationen von Neuronen, Muskeln, Drüsen oder einer beliebigen Anzahl von anpassen anderen Zellen. Der große Vorteil bei der Arbeit mit diesem System ist die Möglichkeit, zu jeder Zeit während dieser Entwicklungsphase zu studieren, was in der gesamten Embryo, in fest-und / oder lebenden Tieren.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder unseres Labors, die diese Techniken entwickeln geholfen. Teilfinanzierung durch einen Zuschuss aus dem California Institute for Regenerative Medicine / CIRM (RN1-00538) DE zur Verfügung gestellt.
N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC | |
E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipets | |
Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |