Imaging di sviluppo cerebrovascolare in zebrafish larvale è descritto. Sono forniti anche tecniche per facilitare l'imaging 3D e modificare lo sviluppo cerebrale con trattamenti chimici.
Zebrafish sono un potente strumento per studiare la biologia dello sviluppo e patologia in vivo. La piccola dimensione e relativa trasparenza di embrioni di zebrafish li rendono particolarmente utile per l'esame visivo dei processi come cuore e sviluppo vascolare. In diversi studi recenti zebrafish transgenici che esprimono EGFP in cellule endoteliali vascolari sono stati usati per immagine e analizzare reti vascolari complesse nel cervello e retina, usando la microscopia confocale. Le descrizioni sono forniti da preparare, trattare e immagine embrioni di zebrafish che esprimono una maggiore proteina fluorescente verde (EGFP), e quindi generare rendering 3D completi del sistema cerebrovascolare. Protocolli includono il trattamento di embrioni, confocale, e protocolli di fissaggio che conservano EGFP fluorescenza. Inoltre, sono forniti consigli utili su come ottenere immagini di alta qualità delle strutture cerebrovascolari, come ad esempio la rimozione dell'occhio senza danneggiare vicina tessuto neurale. Potenziali insidiecon confocale sono discussi, insieme con i passi necessari per generare ricostruzioni in 3D stack di immagini confocale utilizzando liberamente disponibile software open source.
Zebrafish forniscono un potente sistema per studiare la biologia dello sviluppo, e la relativa trasparenza dei loro embrioni è suscettibile di studi di imaging basata su 1. Lo zebrafish è stato ora utilizzato come modello per lo sviluppo dei vertebrati per decenni. Teleostei, inclusi zebrafish, hanno un sistema vascolare vertebrato semplificato che non ha omologo ragionevole invertebrati. Il sangue viene pompato dalla camera anteriore di un cuore a due camere attraverso branchie, dove è ossigenata. Il sangue dalle branchie converge alla aorta dorsale e passa attraverso le arterie che si diramano in vasi più piccoli, infine capillari raggiungendo in tessuti di organi. Da capillari ossigeno viene rilasciato e anidride carbonica viene assorbita. Sul lato venoso dei capillari sangue scorre nelle vene sempre più grandi e viene infine aspirato nella camera posteriore del cuore, in cui il ciclo si ripete.
Un zebrafish adulto può deporre 200 o più uova alla volta, e ONCe fecondato, si sviluppano rapidamente 2. Entro un giorno l'asse corpo è ben sviluppato, compresi i muscoli che muovono contratto e l'embrione intorno all'interno della membrana coriali. Da 2-7 giorni dopo la fecondazione (dpf) la maggior parte dei sistemi del corpo a sviluppare, tra cui gli occhi e un sistema nervoso centrale in grado di coordinare nuotare verso il cibo o lontano dalla luce intensa. Fino a 7 embrioni DPF sono abbastanza piccoli da consentire la visualizzazione al microscopio. Linee transgeniche che esprimono proteine fluorescenti possono essere esposte con microscopia confocale o fluorescenza. Confocale può essere accoppiato con il software open-source 3 per creare rendering 3D delle strutture vascolari complete in embrioni di zebrafish che forniscono una prospettiva biologia dei sistemi di sviluppo vascolare. Studi in questione con i cambiamenti nella complessità vascolare e cerebrovascolari potranno beneficiare di questo protocollo in quanto consente una analisi a livello di sistemi di reti vascolari 4,5. Una raccolta di metodi e risorse sono fornired per consentire un facile adozione e di queste tecniche per studi che richiedono l'imaging di strutture vascolari in zebrafish embrionale. L'efficienza di costo di zebrafish come modello animale sta combinando con le tecnologie di imaging emergenti per fornire nuove piattaforme con cui valutare gli effetti angiogenici di vie molecolari di sviluppo dei vertebrati e l'omeostasi.
I metodi qui descritti forniscono una base per gli studi visivi del sistema vascolare nello sviluppo di zebrafish. Esemplari vivi possono essere usate per valutare i parametri fisiologici, come la frequenza cardiaca e la gittata sistolica cardiaca, mentre i campioni fissi possono essere usate per alta risoluzione confocale. Drosophila e C. elegans consentire intero corpo di imaging, ma zebrafish sono vertebrati e fornire un modello utile per tessuti vertebrati, compreso un sistema vascolare cellule endoteliali allineato. Questi studi possono incorporare significative linee transgeniche e risorse genomiche dalla comunità di ricerca zebrafish. Ricostruzione 3D e rendering delle immagini confocale di zebrafish embrionale, come qui descritte, consentirà un approccio di biologia dei sistemi di ramificazione vascolare e del sangue densità dei vasi che non è possibile con modelli animali grandi come ratti e topi. Inoltre, come amnioti zebrafish sviluppano in un ambiente modificabili (buffer E3), dove si può facilmente aggiungere chemicals che inibiscono gli enzimi specifici o altri processi che influenzano lo sviluppo vascolare. La concentrazione e la tempistica di consegna chimiche possono essere modificati, consentendo al ricercatore condizioni di trattamento di fine-tune.
1. Modifiche e risoluzione dei problemi
Le modifiche al sistema possono includere linee transgeniche di zebrafish che esprimono proteine fluorescenti EGFP o altri in una varietà di tessuto, organo o regione specifici modelli 10. Inoltre, l'analisi delle variazioni neovascolari nella retina zebrafish è stato recentemente pubblicato 5. Problemi con la pigmentazione di embrioni anziani e zebrafish adulti possono essere compensati da incrocio con linee transgeniche che non producono pigmenti di scala o pigmentato retinico. Problemi con la fluorescenza diminuita in genere derivano da condizioni di fissazione inadeguato. Paraformaldeide (4%) per 1 giorno è ottimale, ma fissativi più forti, come la glutaraldeide, tetrossido di osmio o alcool, possonodistruggere EGFP fluorescenza. Dopo la fissazione, gli embrioni devono essere conservati in PBS a 4 ° C e sempre protetti dalla luce solare diretta.
2. Limitazioni di questa tecnica
La qualità e la risoluzione di rendering 3D prodotti con questo protocollo dipendono dalla qualità delle immagini generate. Penetrazione della luce attraverso questi embrioni è limitata al piano sagittale utilizzando un microscopio confocale standard. Questo aspetto delle immagini limita la profondità delle immagini in embrioni grandi e negli adulti, ma i sistemi di microscopia multi-fotone più avanzati consentono per l'imaging a profondità maggiori.
3. Importanza rispetto ai metodi esistenti
Questo protocollo fornisce un approccio per l'analisi delle reti del vaso sanguigno a livello dei sistemi che possono incorporare un intero animale. Rappresentazioni precedenti di tali dati, spesso invocato serie di immagini disposte insieme, ma il rendering 3D fornisce una migliore risoluzione del rapporto spazialetionships coinvolti.
4. Applicazioni future
Nuovi sviluppi nel campo dell'imaging e trattamento dei tessuti fornirà molte nuove applicazioni per questi metodi che possono comprendere facendo embrioni superiore o gli adulti trasparente 11-14. Maggiore trasparenza aumenterà notevolmente la penetrazione nei tessuti da laser confocale e multi-fotone. Inoltre, poiché la velocità di telecamere e fotomoltiplicatori aumentare potrebbe essere presto possibile produrre rendering 3D di pesci in tempo reale, fornendo una 4 ° dimensione di analisi.
5. Passaggi critici
Un passo fondamentale in questo protocollo è la preparazione per l'imaging, che comprende la fissazione corretta. Imaging deve essere fatto il più presto possibile dopo fissazione con obiettivi di alta qualità che hanno le migliori aperture numeriche disponibili. Risoluzione dipende dal sistema di imaging utilizzata, sistemi così alta qualità sono generalmente migliori. Generazione di rendering 3D è la memoria intensivaper così nuovi, computer di fascia alta, con una grande quantità di memoria e di buoni processori grafici sono raccomandati.
Il sistema visivo biologia qui descritto è stato ottimizzato per zebrafish transgenici che esprimono EGFP in cellule endoteliali vascolari, sebbene questi metodi possono essere adattati agli embrioni transgenici che esprimono GFP, o altre proteine fluorescenti, in popolazioni di neuroni, muscoli, ghiandole o qualsiasi numero di altre cellule. Il principale vantaggio nel lavorare con questo sistema è la possibilità di studiare ciò che sta accadendo in tutta embrione in qualsiasi momento durante questo periodo di sviluppo, negli animali fisse e / o dal vivo.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano i membri passati e presenti dei nostri laboratori che hanno contribuito a sviluppare queste tecniche. Finanziamento parziale fornito DE da una sovvenzione da parte del California Institute for Regenerative Medicine / CIRM (RN1-00538).
N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC | |
E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipets | |
Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |