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Biology

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

doi: 10.3791/50417 Published: April 22, 2014

Summary

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

Abstract

제브라 피쉬는 생체 내에서 발생 생물학 및 병리학을 연구 할 수있는 강력한 도구입니다. 작은 크기와 제브라 피쉬 배아의 상대적으로 투명성이 심장과 혈관의 개발과 같은 프로세스의 시각적 심사에 특히 유용합니다. 최근의 여러 연구에서 혈관 내피 세포에서 EGFP를 표현 형질 전환 지브라 피쉬는 화상에 사용하고, 공 초점 현미경을 사용하여, 뇌 및 망막 혈관 복잡한 네트워크를 분석한다. 설명은, 준비 치료 및 이미지 강화 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 표현하는 제브라 피쉬 배아를 한 다음 뇌 혈관 시스템의 종합적인 3D 렌더링을 생성하기 위해 제공됩니다. 프로토콜은 배아의 처리, 공 촛점 이미징 및 EGFP 형광을 유지 고정 프로토콜 (가) 있습니다. 또한, 이러한 손상 근처의 신경 조직을 제거하지 않고 눈과 같은 뇌 혈관 구조의 고품질 이미지를 구하는 방법에 대한 유용한 정보가 제공됩니다. 잠재적 인 함정공 촛점 이미징은 자유롭게 사용할 수있는 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 공 초점 이미지 스택에서 3D 복원을 생성하는 데 필요한 단계와 함께 설명합니다.

Introduction

제브라 피쉬는 발달 생물학을 연구 할 수있는 강력한 시스템을 제공하고, 그들의 태아의 상대적인 투명성 영상 기반 연구 1 의무이다. 제브라 피쉬는 이제 수십 년 동안 척추 동물의 개발을위한 모델로 사용되어왔다. 제브라 피쉬를 포함 Teleosts는 무척추 동물에 적당한 동체가없는 단순화 된 척추 혈관 시스템이 있습니다. 혈액이 산소를 함유 아가미를 통해 두 챔버 마음의 전방 펌핑된다. 아가미에서 피가 등쪽 대동맥에 수렴하고 더 작은 혈관에 동맥 분기, 장기 조직에 결국 도달하는 모세 혈관을 통과한다. 모세관 산소 이내에 해제되고 이산화탄소가 흡수된다. 모세 혈관의 정맥 측에 피가 더 큰 혈관에 흐르고 마침내 사이클이 반복 심장의 후방 챔버로 유입된다.

성인 제브라 피쉬는 한 번에 200 개 이상의 알을 낳기 및 ONC 수전자가 수정 된, 그들은 신속하게 2를 개발. 하루 만에 몸의 축이 아니라 융모 막 내부에 주변의 배아를 이동 계약과 근육을 포함하여, 개발되고있다. 2-7일에서 포스트 수정 (DPF)는 대부분의 신체 시스템은 눈과 식품 안쪽 또는 바깥쪽으로 밝은 빛에서 수영을 조정할 수있는 중추 신경계를 포함하여, 개발. 최대 7 DPF의 배아는 현미경과 시각화 수 있도록 충분히 작은 수 있습니다. 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 라인은 공 촛점 또는 형광 현미경으로 몇 군데 있습니다. 공 촛점 이미징은 혈관 개발의 시스템 생물학의 관점을 제공 제브라 피쉬 배아에 완전한 혈관 구조의 3 차원 렌더링을 만들 수있는 오픈 소스 소프트웨어 3와 결합 할 수 있습니다. 그것은 혈관 네트워크 4,5의 시스템 수준의 분석을 허용하는 혈관과 뇌 혈관 복잡성의 변화와 관련된 연구는이 프로토콜에서 도움이 될 것입니다. 방법과 자원의 컴파일이 제공됩니다배아 제브라 피쉬의 혈관 구조의 영상을 필요로 연구에 쉽게 채택 및 이러한 기술을 허용하는 D. 동물 모델로서 지브라 피쉬의 비용 효율은 척추 동물 발달 및 항상성 분자 경로의 혈관 신생 효과를 평가와 새로운 플랫폼을 제공하기 위해 새로운 이미징 기술들과 결합된다.

Protocol

1. Zebrafish의 축산, 배아의 생성 및 처리

  1. 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의지도하에 및 NIH 또는 기타 규제 기관 / 지침의 동물 관리 가이드 라인에 다음과 같은 제브라 피쉬 프로토콜을 실시한다.
  2. 특정 조직, 세포 또는 장기에 형광 단백질을 표현 제브라 피쉬 균주 Zebrafish의 국제 자원 센터 (ZIRC)에서 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Tg는 (KDR : EGPF)는이 프로토콜에서와 같이 완전한 3D 혈관 구조를 제조하는데 사용될 수 혈관 내피 세포를 06 일에서 EGFP를 표현 S843. 형질 전환 제브라 피쉬의 다른 라인은 ZIRC에서 사용할 수 있습니다.
  3. 산도, 염도, 온도, 용존 산소, 빛, 및 기타 환경 요인에 7을 모니터링 적절한 양식 시스템에서의 주택 성인 제브라 피쉬. 여기에 표시된 제브라 피쉬는 14 시간 LIG와 28.5 ° C에서 Aquaneering 주식 시스템 (샌디에고, CA)에 보관 하였다ht/10 시간 어두운주기. 성인 제브라 피쉬에게 소금물 새우와 NRD 4 / 6 물고기 음식 (소금물 새우 직접 오그 던, 유타)의 균형 잡힌 식단을 공급.
  4. 성인 남성과 번식 연령의 여성 제브라 피쉬는 짝짓기에 성공 높이기 위해 별도로 보관해야합니다.
  5. 함께 계란을 통해 가을에 충분히 큰 구멍이 메쉬 바닥이 결합 용기에 여성 (2-4)과 남성 (4-6)를 배치하여 달걀 누워 및 수정을 자극하지만, 너무 작은 제브라 피쉬 성인이 합격을위한 . 전에 저녁이 교배를 설정; 계란은 낮의 빛을주기 천천히 강도 (새벽)에 증가 일반적으로있는 동안, 새벽 근처에 배치됩니다. 결합 용기의 바닥 모든 15 ~ 30 분 계란을 확인합니다.
  6. E3 버퍼 (5 ​​mM의 염화나트륨, 0.17 밀리미터의 KCl, 0.33 mM의 염화칼슘, 0.33 mM의 망초)과 메쉬 스트레이너 청소를 사용하여 계란을 수집합니다. 28 ° C 배양기에서 E3 버퍼와 상점으로 가득 100mm 배양 접시에 계란을 전송합니다.
  7. CER을 변경 화학 물질을 연구하는ebrovascular 원하는 화학 물질의 농도를 추가 분파. 예를 들어 neovasular 분기는 24를 시작 γ-세 크레타 제 억제제를 DMSO 4 가용화 (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5 - Difluorophenacetyl-L-알라 닐)]-S-phenylglycinet-부틸 에스테르)로 유도 될 수있다 시간 포스트 수정 (HPF). 그 때 점 배아에서 융모막에서 여전히 많은 화학 물질은 8 통과 할 수있다. 처리 조건은 융모막의 무료 휴식 배아의 능력을 손상시킬 신경 모터 효과를 가지고 있다면, 배아는 프로 나제 (2)의 어느 겸자로 수행 될 수있다 (24) 및 HPF (48) 사이에서 디 chorionated한다. 제공되는 이미지에 표시된 태아 부드럽게 두 날카롭게 집게로 융모막을 잡아 열어 찢어 dechorionated했다.
  8. 필요하다면 / 소망, 색소 형성은 HPF (24)에서 E3 버퍼에 0.003 % N-Phenylthiourea (PTU)를 첨가함으로써 억제 할 수있다.

뇌 혈관 구조체 2. 공 촛점 이미징고정 제브라 피쉬 배아에 URES

  1. 250 ㎎ / L의 Tricaine 메탄의 배아를 희생하고 2 침지하여이를 수정 - 4 ℃에서 하룻밤 4 % 파라 포름 알데히드 형광 태아가 들어있는 용기는 호일에 싸여되어야한다. 이미지가 될 때까지 한 번 고정, 배아는 4 ° C에서 PBS에 보관해야합니다 - EGFP 형광 강도는 약 일주일 후 작은 해결이됩니다 만, 형태는 (시야에서 볼 때) 훨씬 오래 유지됩니다.
  2. 먼저 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용하여 하나의 눈을 제거하여 배아를 탑재 할 준비를합니다. 눈을 연결 조직 주위에 잘라 먼저 근육을 절단하고, 마지막으로 눈을 치환하는 시신경을 절단. (참고 : 양쪽 결상 원하는 경우 제거 두 눈을.)
  3. 눈을 제거한 후에, 3 % 메틸 셀룰로오스의 방울을 사용 커버 글라스에 배아 마운트. 제거 된 눈을 가진면이 커버 글라스에 직면하고 가능한 한 유리에 가깝게되도록 배아의 방향. 메틸로 전체 배아를 커버이미징 동안 건조를 방지하기 위해 lcellulose.
  4. 이미지 즉시 고품질 20X 플랜 아포 목적 (개구 = 0.75 이상)을 탑재 반전 공 촛점 현미경을 사용하여 장착 배아. 이 구성은 두 개의 유리 평면 사이 배아를 협지하고, 전면 글라스에 대해 배아를 가압 필요 비 반전 현미경 것이 바람직하다.
  5. 중간 또는 큰 조리개 설정을 사용하여 1 μm의 단위로 광 조각을 수집합니다. 2.5 μM의 확대 단계가 또한 사용될 수 있지만, 그것은 작은 물체의 공간적 순서를 결정하는 것이 더 어려울 수있다. 작은 구멍이 선명한 디테일을 생산하지만, 필요 이상 검사는 EGFP 표백도 얻을 수있는 배아로 영상의 깊이를 제한 할 수 있습니다. 공 초점 현미경은 배아를 통해 절반 방법에 대한 영상을 허용합니다.
  6. 전체 물고기의 영상을 원하는 경우, (단계 3.2의 주 참조) 처음에 두 눈을 제거, 걸 보면 후 배아를 회전반대편 2.5 - G 한쪽 반복 2.3 단계를 반복합니다.

배아 Zebrafish의 Cerebrovasculature 3. 3D 재건

  1. 무료, 3D 렌더링에 최적화 및 PC, Mac 및 Linux 컴퓨터와 호환되는 오픈 소스 ImageJ에의 피지 분포 3 (http://fiji.sc)를 사용합니다.
  2. 플러그인> 궤적> BioFormats 가져 오기 (9)는 다음, 니콘 스택 (그림 2A)에 대한 예를 들어 name.ids를 공 초점 파일을 선택 이동하여 피지로 가져 오기 공 초점 스택. 분할 채널을 확인, 자동 설정을 확인, 그레이 스케일 : Hyperstack, 컬러 모드와보기 스택을 선택합니다.
  3. 이러한 선택은 네 개의 개별 채널 패널을 엽니 다; EGFP에 대해 하나는 일반적으로 세 번째 다운을 필요합니다. C = 1 (그림 2A) 다음에 긴 이름을 가진 16 비트 이미지를 떠나 다른 세 개의 패널 (빨강, 파랑 및 알파)를 닫습니다.
  4. 이미지가 스크롤을 따 사용하지만 스캔하여 임계 값을 조정B 관심 영역 또는 구조를 가지고 조각을 찾기 위해 하단에 다음 (그림 2C)> 임계 값을 조정합니다> 이미지로 이동합니다.
  5. 등장 패널의 구조는 배경에 아주 잘 볼 수 있도록 왼쪽 상단 바 (블랙 레벨)를 밀어하고 (그림 2D)입니다 하단 슬라이드 (화이트 레벨)을 둡니다. B & W를 선택, 어두운 배경을 선택합니다. 다른 조정이 각 조각에, 검정색 배경을 선택해야하지 않는 한 각 이미지에 대한 계산 임계 값을 선택하지 마십시오. 이 과정은 새로운 8 비트 이미지를 생성합니다.
  6. 경고 임계 값은 취소 또는 저장 ImageJ에있는, 그래서 공 초점 스택은 변경이 필요할 때마다 다시로드해야합니다 수 없습니다. 숫자를 기록하고 원하는 결과를 얻을 때까지 다른 설정을 시도해보십시오.
  7. 요인 1 (최상) 또는 2 (좋은)을 재 샘플링, 플러그인> 3D 뷰어> 임계 값을 0으로 이동, 녹색 3D 출력을 할 수있는 빨간색과 파란색 색상 상자의 선택을 취소합니다 - 그렇지 않으면 위스콘신LL 흰색 렌더링을 생성 - (자동) (그림 2E) 적용을 선택합니다.
  8. 회전, 스핀과 마우스와 키보드 컨트롤 (그림 2F)를 사용하여 3D 이미지를 확대.
  9. 메뉴에서 캡처 옵션을 사용하여 어느 지점에서 정지 영상을 저장합니다. 화면에 이미지 상자의 크기는 생성 된 이미지의 픽셀 사이즈를 지시하므로 고해상도 화상 메이크 오른쪽 하단 모서리를 끌어 상자가 확대를 원하는 경우.
  10. 보기> 기록 360 ℃의 회전 (그림 2G)를 선택하여 회전하는 3D 영화를 만들 수 있습니다. 단계 당 2도까지 회전 기본적으로,하지만 훨씬 작은 파일 크기를 생성합니다 예를 들어 5도에 변경 될 수 있지만, 애니메이션에 경련을 추가 할 수 있습니다.
  11. 나중에, 미디어 플레이어로 볼 수 인터넷에 업로드하거나, 파워 포인트 프레 젠 테이션에 사용하기위한 몇 가지 가능한 형식 중 하나에 파일을 저장합니다. 오픈 소스 미디어 플레이어, VLC ( HT) :/ / www.videolan.org / VLC / index.html을 TP, 무료로 아주 잘 이러한 동영상을 처리합니다.

Representative Results

혈관 구조의 3 차원 재구성은 제브라 피쉬 개발의 포괄적이고 시각적으로 흥미로운 관점을 제공합니다. 그들은 일반적으로 수행으로 1, 2는 방법을 도시한다. 그림 3은 내피 세포에서 EGFP을 표현 제브라 피쉬 배아 DPF 6 혈관 구조의 여러 각도를 보여줍니다. 단색 녹색 또는 흰색 색상으로 신호 강도를 평가하기가 어려울 수 있습니다; 의사 색상은 룩업 테이블에서 이미지 강도를 제공하고 구조가 겹치는 경우에 더 깊이 인식 할 수 있습니다. 소재 맥관의 의사 - 컬러 3D 화상의 예 6 지브라 피쉬는도 4에 제공된다 DPF. 살아있는 배아의 형광 이미징은 눈 및 신체 움직임을 포함 생리적 특성을 연구하기 위해 이용 될 수 있으며, 심장 활동. 3,4 피규어 형질 전환 제브라 피쉬 줄을 사용하여, 이러한 방법으로 얻은 대표적인 결과를 보여 설명. 이미징 분해능 현미경 특성에 따라 다르지만, EGFP 신호의 밝기는 대부분의 상용 시스템과 양호한 화질 충분하다. 3D 표현의 재건 및 렌더링은 일관성이 오픈 소스 소프트웨어 내 옵션은 지속적으로 좋은 결과를 제공합니다.

그림 1
그림 1. 눈 제거. A) 텅스텐 필요없이 고정 세 DPF 배아는 눈 옆에 위치. 조직이)이 위치. B에서 눈 주위를 잘라 눈이가 빠지고 기본 안구 근육과 시신경이 절단된다. 빈 눈구멍은 점선 원으로 표시됩니다. C) 같은 배아 인계 및 메틸 셀룰로오스와 함께 장착되어, 최대 직면하고있는 그대로 눈으로. hres.jpg "대상 ="_blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 단계별 공 초점 이미지 스택의 3D 재건. A) 관심 영역으로 조각을 찾은 후. B)을 선택 플러그인> 궤적> Bioformat를 사용하여 피지 내에로드 파일 열기 (4104.1.ids), 임계 값 조정이 표시. C)로 선택 임계 값은 최고를 사용하여 (214)에 조정 슬라이더 적용이 선택됩니다. 같이 D) 3D 뷰어가 호출됩니다. E) 3 차원 재구성이 방향의 경우 그대로 눈을 가진 제브라 피쉬,. F) 이미지를 확대합니다. G) 360도 회전 동영상을 회전 한으로 표시됩니다 도시 된 바와 같이 이루어진다. res.jpg "대상 ="_blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 3D 재건의 전망. A) 10 배 목적으로 이미지화 6 DPF 배아의 내측 관점, 입이 오른쪽에, 입안하지 아가미. B 동일한 배아의) 측면, 주 지느러미 중간에 루프입니다. 20 배 목적으로 몇 군데 C) 같은 배아, 20 배 목표 영상의 중간 관점, 주 아가미 해상도. D) 측면 관점. 핀이 패널의 오른쪽 가장자리에 있습니다. 20 배 목적 영상의 E) 전후면 중간보기, 오른쪽에 20 배 목표, 머리 그것으로 몇 군데 같은 태아의 입 안에 주 아가미. F) 복부. 오른쪽 아래에 난황에 혈관을합니다.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg "대상 ="_blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
신호 강도에 대한 사색의 룩업 테이블을 사용하여 6 DPF 재건의 6 DPF의 배아 그림 4. 강도의 차이는. 이미지. 입, 뇌, 아가미 및 난황이 방향에 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
4 DPF의 제브라 피쉬의 재구성 혈관 시스템의 그림 5. 영화. 물고기는 2.5 μm의에서 몇 군데 있었다. 이미지가 있었다배아의 절반을 이미징. 그림 6에서 제공하는 GSI 처리 된 제브라 피쉬의 구조와 혈관 구조를 비교. 머리에 혈관의 밀도가 낮은 큰 아가미합니다. (다운로드 아래에있는 "Zfish_spin.avi"보충 파일을 참조하십시오)

그림 6
그림 6. 4 DPF에서 GSI 처리 된 배아의 혈관 시스템의 3D 영화. 물고기는 중간 선에 측면에서 통해 2.5 μm의에서 몇 군데 있었다. 그림 5와 같이 물고기 DPF 제어 4 혈관 구조를 비교. 아치형 다시 작은 크기는이 화학 물질로 처리 된 배아에서 전형적인이다. (다운로드 아래에있는 "GSI-treated_4dpf_fish.avi"보충 파일을 참조하십시오)

Discussion

여기에서 설명하는 방법은 zebrafish의 개발에 혈관 시스템의 시각적 인 연구를위한 기초를 제공한다. 고정 된 샘플은 고해상도 촛점 촬상. 초파리C. 위해 사용될 수있는 반면 라이브 시험편, 심박수 및 심장 박출량과 같은 생리 학적 파라미터를 평가하기 위해 사용될 수있다 엘레 전신 영상을 허용하지만, 제브라 피쉬는 척추 동물이며, 내피 세포가 늘어선 관 시스템을 포함한 척추 동물의 조직에 대한 유용한 모델을 제공합니다. 이러한 연구는 제브라 피쉬 연구 공동체에서 중요한 유전자 변형 라인과 게놈 자원을 통합 할 수 있습니다. 3D 재구성 및 배아 제브라 피쉬에서 공 촛점 이미지의 렌더링, 여기에 설명 된대로, 혈관 분기와 같은 쥐와 생쥐와 같은 큰 동물 모델을 할 수없는 혈관의 밀도에 시스템 생물학의 접근을 허용. 또한, 제브라 피쉬가 수정 환경 (E3 버퍼)에서 개발 양막 류 (amniotes)로, 어디 하나는 쉽게 C를 추가 할 수 있습니다혈관 발달에 영향을 미치는 특정 효소 나 다른 프로세스를 억제 hemicals. 화학 약품 이송의 농도 및 타이밍은 연구원 미세 조정 처리 조건을 가능하게 변경 될 수있다.

1. 수정 및 문제 해결

이 시스템에 대한 수정 사항은 조직, 기관 또는 지역 특정 패턴 (10)의 다양한 EGFP 또는 다른 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 제브라 피쉬의 라인을 통합 할 수 있습니다. 또한, zebrafish의 망막 신생 혈관의 변화의 분석은 최근 5를 발표하고있다. 이전의 배아와 성인 제브라 피쉬의 착색 문제는 규모 안료 또​​는 망막 색소를 생성하지 않는 유전자 변형 라인과 교차에 의해 보상 될 수있다. 감소 된 형광 문제는 일반적으로 부적절한 고정 조건에서 발생합니다. 1 일 동안 파라 포름 알데히드 (4 %)이 최적입니다 만 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde), 오스뮴 또는 알코올 등의 강한 고정 제는, 5 월EGFP 형광을 파괴한다. 고정 후, 배아는 4 ° C에서 PBS에 보관해야하고 항상 직사광선으로부터 보호.

이 기술의 2. 제한

이 프로토콜을 사용하여 생성 된 3D 렌더링의 품질과 해상도는 생성 된 이미지의 품질에 따라 달라집니다. 이러한 배아를 통해 빛의 침투는 표준 공 초점 현미경을 사용하여 중간 시상면으로 제한됩니다. 영상의이 부분은 이전의 배아와 성인 영상의 깊이를 제한하지만, 더 진보 된 다 광자 현미경 시스템은 깊은 수심에서 이미징 할 수 있습니다.

기존의 방법에 대하여 3. 의미

이 프로토콜은 전체 동물을 통합 할 수있는 시스템 레벨에서의 혈관 망의 분석 방법을 제공한다. 이러한 데이터의 이전 표현은 종종 함께 배치 일련의 이미지에 의존하지만, 3D 렌더링 공간 상대적으로 더 나은 해상도를 제공합니다참여 tionships.

4. 미래의 응용 프로그램

이미징 및 조직 처리의 새로운 발전은 이전의 배아 또는 성인 투명 11-14을 만드는 포함 할 수있는 방법에 대한 많은 새로운 응용 프로그램을 제공 할 것입니다. 향상된 투명성이 크게 공 초점 및 다중 광자 레이저로 조직의 침투를 증가시킬 것이다. 또한, 카메라 및 광전자 증 배관 튜브의 속도로 빨리 분석의 네 번째 차원을 제공하는 실시간 물고기의 3D 렌더링을 생성하는 것이 가능할 수도 증가한다.

5. 중요한 단계

이 프로토콜의 중요한 단계는 적절한 고정을 포함 이미징을위한 준비입니다. 영상은 사용할 수있는 최고의 숫자 구멍이 높은 품질의 목표에 고정 후 가능한 한 빨리 수행해야합니다. 해상도 사용한 촬상 시스템에 달려 있으므로 고품질의 시스템은 일반적으로 더 낫다. 3D 렌더링을 생성하면 메모리를 많이 사용메모리와 좋은 그래픽 프로세서의 다량 때문에 새로운 하이 엔드 컴퓨터를 권장합니다.

이들 방법은 신경, 근육, 동맥 또는 임의의 수의 개체군에서 GFP 또는 다른 형광 단백질을 표현 형질 전환 배아에 적용 할 수 있지만 여기에 기재된 시각 생물학 시스템은, 혈관 내피 세포에서 EGFP를 표현 형질 전환 지브라 피쉬 위해 최적화 된 다른 세포. 이 시스템으로 작업의 가장 큰 장점은 고정 및 / 또는 살아있는 동물에서,이 발달 기간 동안 언제든지 전체 배아에서 무슨 일이 일어나고 있는지 연구 할 수있는 기능입니다.

Disclosures

공개 아무것도 없다.

Acknowledgments

저자는 이러한 기술 개발을 도왔 우리 실험실의 과거와 현재 회원을 감사드립니다. 일부 자금은 재생 의료 / CIRM (RN1-00538)에 대한 캘리포니아 연구소에서 부여로 DE 제공.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N – Phenylthiourea  Alfa Aesar, catalog #41972 0.2 M in E3 buffer, kept at 4 °C
E3 buffer Sigma 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Confocal microscope  Nikon D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U
Glass bottom dishes Mat-Tek
GSI IX/DAPT N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences
24 well plates  Becton-Dickinson, cat# 351147 BD Falcon
Transfer pipettes  VWR, cat #414004-001 VWR disposable transfer pipettes
Methyl-cellulose  Alfa Aesar, cat#43146 3% in E3 buffer
NRD 4/6 Fish food  Brine Shrimp Direct Dried
Brine shrimp Brine Shrimp Direct Live
Tungsten wire  Small Parts # TW-016-60 0.016” OD
Tricaine VWR # 101107-950 Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer

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References

  1. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).
  2. Westerfield, M. The Zebrafish Book. University of Oregon Press. (2007).
  3. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  4. Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-β plays a conserved role in angiogenesis. PLoS ONE. 7, (2012).
  5. Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. Amyloid-β increases capillary bed density in the adult zebrafish retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).
  6. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  7. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
  8. Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo. Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).
  9. Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
  10. Opitz, R., et al. Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development. Dev Biol. 372, 203-216 (2012).
  11. Gleave, J. A., et al. Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging. Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  13. Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy. Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).
  14. Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. 68, e4272 (2012).
이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성
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Cite this Article

Ethell, D. W., Cameron, D. J. Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish. J. Vis. Exp. (86), e50417, doi:10.3791/50417 (2014).More

Ethell, D. W., Cameron, D. J. Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish. J. Vis. Exp. (86), e50417, doi:10.3791/50417 (2014).

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