Imágenes del desarrollo cerebrovascular en larvas de pez cebra se describe. También se proporcionan técnicas para facilitar la proyección de imagen 3D y modificar desarrollo cerebrovascular el uso de tratamientos químicos.
El pez cebra son una poderosa herramienta para estudiar la biología del desarrollo y la patología en vivo. El pequeño tamaño y la transparencia relativa de embriones de pez cebra los hacen particularmente útiles para el examen visual de los procesos tales como el corazón y el desarrollo vascular. En varios estudios recientes pez cebra transgénico que expresan EGFP en las células endoteliales vasculares se utilizaron para la imagen y analizar las redes vasculares complejas en el cerebro y la retina, utilizando microscopía confocal. Las descripciones se proporcionan a preparar, tratar y la imagen embriones de pez cebra que expresan mayor proteína verde fluorescente (EGFP), y luego generar representaciones 3D integrales del sistema cerebrovascular. Los protocolos incluyen el tratamiento de embriones, la imagen confocal, y protocolos de fijación que preservan la fluorescencia de EGFP. Además, se proporcionan consejos útiles sobre la obtención de imágenes de alta calidad de las estructuras vasculares cerebrales, como la eliminación del ojo sin dañar el tejido neural cercano. Peligros potencialescon la imagen confocal se discuten, junto con los pasos necesarios para generar reconstrucciones en 3D de pilas de imágenes confocal utilizando software de código abierto disponible gratuitamente.
El pez cebra proporciona un potente sistema para estudiar la biología del desarrollo, y la transparencia relativa de sus embriones es susceptible a los estudios basados en la imagen 1. El pez cebra ahora se ha utilizado como un modelo para el desarrollo de vertebrados durante décadas. Teleósteos, incluyendo el pez cebra, tienen un sistema vascular vertebrados simplificado que no tiene homólogo razonable en los invertebrados. La sangre es bombeada desde la cámara anterior de un corazón de dos cámaras a través de las branquias, donde se oxigena. La sangre de las branquias converge en la aorta dorsal y pasa a través de las arterias que se ramifican en vasos más pequeños y más pequeños, eventualmente capilares alcance en tejidos de órganos. Dentro de oxígeno capilares se libera y el dióxido de carbono es absorbido. En el lado venoso de los capilares de la sangre fluye hacia las venas más grandes y más grandes y finalmente se introduce en la cámara posterior del corazón, donde el ciclo se repite.
Un pez cebra adulta puede poner 200 o más huevos a la vez, y once fertilizado, se desarrollan rápidamente 2. Dentro de un día al eje del cuerpo está bien desarrollada, incluyendo los músculos que se contraen y se mueven al embrión por el interior de la membrana coriónica. De 2-7 días después de la fertilización (dpf) la mayoría de los sistemas del cuerpo a desarrollar, incluyendo los ojos y el sistema nervioso central que puede coordinar a nadar hacia la comida o lejos de la luz brillante. Hasta 7 embriones dpf son lo suficientemente pequeños para permitir la visualización con microscopia. Las líneas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes se pueden obtener imágenes con microscopía confocal o de fluorescencia. Confocal de imágenes se puede combinar con el software de código abierto 3 para crear representaciones en 3D de estructuras vasculares completos en embriones de pez cebra que ofrecen una perspectiva de la biología de sistemas del desarrollo vascular. Estudios relacionados con los cambios en la complejidad vascular y cerebrovascular se beneficiarán de este protocolo, ya que permite un análisis a nivel de sistemas de redes vasculares 4,5. Una compilación de los métodos y recursos son proporcionard para permitir una fácil adopción y de estas técnicas para los estudios que requieren de formación de imágenes de estructuras vasculares en embriones de pez cebra. La eficiencia de costes del pez cebra como un modelo animal es la combinación con tecnologías de la imagen emergentes para proporcionar nuevas plataformas con las que evaluar los efectos angiogénicos de vías moleculares en el desarrollo de vertebrados y la homeostasis.
Los métodos descritos aquí proporcionan una base para los estudios visuales del sistema vascular en el desarrollo de pez cebra. Los especímenes vivos se pueden utilizar para evaluar los parámetros fisiológicos, tales como la frecuencia cardíaca y el volumen sistólico del corazón, mientras que las muestras fijas se pueden utilizar para la formación de imágenes confocal de alta resolución. Drosophila y C. elegans permite la formación de imágenes de todo el cuerpo, pero el pez cebra son vertebrados y proporcionan un modelo útil para los tejidos de vertebrados, incluyendo un sistema vascular de células forrado endotelial. Estos estudios pueden incorporar líneas transgénicas importantes y recursos genómicos de la comunidad de investigación de pez cebra. Reconstrucción 3D y renderizado de imágenes de confocal de embriones de pez cebra, tal como se describe aquí, permitir un enfoque de la biología de sistemas para la ramificación vascular y la densidad de los vasos sanguíneos que no es posible con los modelos animales más grandes, como las ratas y los ratones. Además, como amniotas pez cebra se desarrollan en un entorno modificable (tampón E3), donde se puede agregar fácilmente chemicals que inhiben las enzimas específicas u otros procesos que afectan al desarrollo vascular. La concentración y el tiempo de entrega de productos químicos pueden ser alterados, lo que permite al investigador condiciones de tratamiento para afinar.
1. Modificaciones y solución de problemas
Las modificaciones de este sistema puede incorporar líneas transgénicas de pez cebra que expresan proteínas fluorescentes EGFP o otros en una variedad de tejidos, de órganos o región patrones específicos 10. Además, el análisis de los cambios neovasculares de la retina de pez cebra recientemente se ha publicado 5. Problemas con la pigmentación en embriones de pez cebra adultos mayores y pueden ser compensadas por el cruce con líneas transgénicas que no producen pigmentos escala o pigmentario de la retina. Problemas con fluorescencia disminuida resultan típicamente de fijación de condiciones inapropiadas. El paraformaldehído (4%) durante 1 día es el óptimo, pero fijadores más fuertes, tales como glutaraldehído, tetróxido de osmio o alcohol, mayodestruir EGFP fluorescencia. Después de la fijación, los embriones deben mantenerse en PBS a 4 ° C y siempre protegidos de la luz directa del sol.
2. Limitaciones de esta técnica
La calidad y la resolución de representaciones en 3D producidas con este protocolo dependen de la calidad de las imágenes generadas. Penetración de la luz a través de estos embriones se limita al plano sagital medial utilizando un microscopio confocal estándar. Este aspecto de la imagen limita la profundidad de las imágenes en los embriones de más edad y los adultos, pero los sistemas de microscopía multifotónica más avanzados permiten la proyección de imagen a mayores profundidades.
3. Importancia con respecto a los métodos existentes
Este protocolo proporciona un enfoque para el análisis de redes de vasos sanguíneos en un nivel de sistemas que puede incorporar un animal entero. Representaciones anteriores de tales datos a menudo se basaban en serie de imágenes dispuestas juntos, pero 3D proporciona una mejor resolución de la relación espacialciones implicadas.
4. Las futuras aplicaciones
Nuevos avances en la formación de imágenes y procesamiento de tejidos ofrecerá muchas nuevas aplicaciones para estos métodos que pueden incluir hacer embriones de más edad o adultos transparente 11-14. Mayor transparencia aumentará en gran medida la penetración del tejido por los láseres confocal y multi-fotón. Además, como la velocidad de las cámaras y los tubos fotomultiplicadores aumentar pronto podría ser posible producir representaciones en 3D de peces en tiempo real, proporcionando una 4 ª dimensión de análisis.
5. Los pasos críticos
Un paso crítico en este protocolo es la preparación para la formación de imágenes, que incluye la fijación adecuada. Imaging se debe hacer lo más pronto posible después de la fijación de los objetivos de alta calidad que tienen las mejores aperturas numéricas disponibles. Resolución depende del sistema de imagen utilizado, por lo que los sistemas de alta calidad son generalmente mejores. La generación de representaciones en 3D requiere mucha memoriaPorque de esta manera nuevos, computadoras de alta gama con una gran cantidad de memoria y buenos procesadores gráficos son recomendables.
El sistema de la biología visual descrito aquí ha sido optimizado para el pez cebra transgénico que expresan EGFP en células endoteliales vasculares, aunque estos métodos se pueden adaptar a los embriones transgénicos que expresan la GFP, o de otras proteínas fluorescentes, en las poblaciones de neuronas, músculos, glándulas o de cualquier número de otras células. La principal ventaja de trabajar con este sistema es la posibilidad de estudiar lo que está sucediendo en todo el embrión en cualquier momento durante este período de desarrollo, en los animales fijos y / o en vivo.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a los miembros pasados y presentes de nuestros laboratorios que ayudaron a desarrollar estas técnicas. Parte de la financiación proporcionada al DE por una subvención del Instituto de California para la Medicina Regenerativa / CIRM (RN1-00538).
N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC | |
E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipets | |
Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |