Abstract
المناعية (IHC) يوفر محددة للغاية، موثوقة وجذابة التصور البروتين. الأداء الصحيح والتفسير لوضع العلامات متعدد الألوان استنادا IHC-هو أمر صعب، خصوصا عندما تستخدم لتقييم العلاقات المتبادلة بين البروتينات المستهدفة في الأنسجة ذات المحتوى العالي من الدهون مثل الجهاز العصبي المركزي (CNS).
ويمثل بروتوكول لدينا صقل تقنية immunolabeling القياسية المعدلة وخاصة للكشف عن كل من البروتينات الهيكلية والقابلة للذوبان في الفئران الجهاز العصبي المركزي والغدد الليمفاوية الطرفية (LN) تتأثر neuroinflammation. ومع ذلك، مع أو من دون مزيد من التعديلات، يمكن أن المرجح أن تستخدم بروتوكول لدينا للكشف عن أهداف البروتين الأخرى ذات الصلة، حتى في الأجهزة والأنواع الأخرى من المقدمة هنا.
Introduction
وعلى الرغم من استخدام متقدمة عالية الإنتاجية التحليلات التي أجريت على methylome، Transcriptome على أو حتى مستوى بروتيوم، لا يزال المناعية المعيار الذهبي للكشف عن البروتين مباشرة في عينات الأنسجة، زراعة الخلايا أو مسحة الخلية. من خلال الكشف عن نمط التعريب / التوزيع، المناعية (IHC) قد تقييم نسب النسبية والعلاقات المتبادلة الطبوغرافية من البروتينات المستهدفة، وحتى تشير الأنشطة البيولوجية. لذلك، ويستخدم على نطاق واسع لأغراض IHC السريرية والبحوث، على سبيل المثال، للتشخيص والتقييم العلاج، ودراسة آليات المرض، وإجراء التعديلات الفنية وphenotypical في النماذج الحيوانية، الخ
تتألف أساسا الأنسجة، علم الأمراض، والكيمياء الحيوية وعلم المناعة، وقد تقدمت IHC بشكل ملحوظ منذ عام 1941، عندما كانت تستخدم الأجسام المضادة fluorescently المسمى لأول مرة لتحديد المستضدات المكورات الرئوية في الأنسجة المصابة 1. الخامسويستند isualization من المنتجات الخلوية والمكونات التي كتبها IHC على ربط الأجسام المضادة (عبس) لمستضد معين من (حج). بالإضافة إلى استخدام fluorophore الموسومة الأجسام المضادة، ويمكن أيضا التفاعلات المناعية يمكن تصور باستخدام الإنزيمات مثل البيروكسيديز 2،3 أو الفوسفاتيز القلوية 4. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام الغروية الأجسام المضادة الموسومة الذهب 5 للكشف عن تفاعل ضد مستضد معين من قبل كل من الضوء والمجهر الإلكتروني، في حين تصور تسميات المشعة عن طريق تصوير الإشعاع الذاتي.
وتفاعل مناعي حج-أب يمكن أن يتم الكشف عن طريق وسائل مباشرة وغير مباشرة. الطريقة المباشرة هي في جوهرها أسرع وأبسط، كما أنه يستخدم المسمى مباشرة عبس الأساسي 6. ولكن نظرا لنقص كبير في الحساسية، ويفضل الطرق غير المباشرة لتلك المباشرة. خطوتين إجراءات الكشف غير المباشرة تتطلب الخالي من الملصقات عبس الأساسي، كما الأولى، وصفت عبس الثانوية موجهة ضد عبس الابتدائي، والطبقة الثانية 7.تضخيم إشارة يمكن أن يتحقق من خلال إشراك أبعد من ذلك، يقترن انزيم العالي أب (ثلاث خطوات الطريقة غير المباشرة) التي تربط لأب الثانوي. يشيع استخدامها طرق الكشف غير المباشرة أفيدين البيوتين والبيروكسيديز-antiperoxidase (PAP). بدلا من ذلك، الفوسفاتيز القلوية-antialkaline الفوسفاتيز (APAAP) مجمع يمكن أن تستخدم بدلا من أسلوب PAP. والجدير بالذكر أن تظهر الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) طرق لتكون أكثر حساسية من طرق المناعي 4. يستخدم معقدة (ABC) طريقة أفيدين البيوتين أب الثانوي المعقدة البيروكسيديز في تركيبة مع أي المسمى أفيدين البيوتين معقد (LAB)، أو المسمى streptavidin البيوتين معقد (سلاب). حساسية الكشف يمكن زيادة أخرى عن طريق إشراك أفيدين المسمى مع البيروكسيديز أو الفوسفاتيز القلوية 8. طرق الكشف أخرى في الاستخدام هي العلامات البوليمر، والتضخيم، الثيامين والمناعية المتداول دائرة 9. والجدير بالذكر أن طرق الكشف مختلفة يمكن الجمع للكشف عن حج متعددة في نفس النسيجتم إجراء العينة التي تم الإبلاغ عنها للمرة الأولى في عام 1978 (4). المناعية مزدوجة في وقت واحد المقدمة هنا في الثابتة الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين الفئران الجهاز العصبي المركزي وLN أقسام الأنسجة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية محددة البيروكسيديز وAP-مترافق، على التوالي. وتصور الإشارات باستخدام 3،3'-diaminobencidine (DAB) مولد اللون والأزرق السريع (FB) APAAP المجمع، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان أخلاقي
يتم تنفيذ الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية من المجلس الوطني السويدي لحيوانات المختبر وتوجيه مجلس الاتحاد الأوروبي (86/609 / EEC) تحت تصاريح الأخلاقية N338 / 09، N15 / 10 و N65 / 10، والتي وافق عليها ستوكهولم جنة الأخلاقيات الحيوانية الشمال.
1. نسيج التحضير
- نضح وتثبيت
- تخدير الحيوانات مع isoflurane لأداء نضح transcardial عبر البطين الأيسر. بدء الشطف من الأوعية الدموية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لإزالة مكونات الدم، تليها بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1 م برنامج تلفزيوني (PFA).
- يحملق العقول تشريح، النخاع الشوكي والأنسجة الطرفية LN عن طريق غمر في منهاج العمل. بعد 24 ساعة على 4 درجات مئوية، ونقل الأنسجة من منهاج العمل في برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة. بدلا من ذلك إلى برنامج تلفزيوني تجاري، ويحل 9 ز كلوريد الصوديوم في 250 مل من S &# 246؛ rensen العازلة وإضافة 750 مل من الماء منزوع الأيونات (درهم 2 O). لإعداد 0.2 عازلة M سورنسن (7.4 درجة الحموضة) بحل 13.8 غ ناه 2 ص 4 × 1H 2 O و71،2 ز نا 2 هبو 4 × 2H 2 O في 2.5 L درهم 2 O.
- الجفاف وتضمين
- قطع الأنسجة إلى ما يقرب من 5 ملم أجزاء سميكة باستخدام شفرة حلاقة.
- الشروع في عملية تصلب الأنسجة (الجفاف) باستخدام الأنسجة تيك VIP فراغ تسلل المعالج (الإجراء المعياري استنادا إلى الانغمار في تركيزات تصاعدي من الإيثانول، تليها زيلين وأخيرا البارافين (الجدول 1).
- وضع الأنسجة في قالب وتصب في البارافين السائل حول عينة لتشكيل "كتلة البارافين". تخزين على المدى الطويل يتطلب درجة حرارة الغرفة (RT). ومع ذلك، قبل باجتزاء، ومن المفضل أن يبرد الكتل، على سبيل المثال، بين عشية وضحاها (س / ن) في 4 درجات مئوية.
2. باجتزاء
- وضع كتلة البارافين إلى حامل ثابت من مشراح زلاجة، التي يمكن ان تتحرك جيئة وذهابا عبر سكين. ضبط زاوية المثلى بين كتلة والسكين مشراح (التي تعتمد على هندسة سكين، ولكن أيضا على سرعة القطع وتقنية).
- قطع 3-5 ميكرون سميكة المقاطع العرضية من كتلة البارافين.
- نقل القسم مجرد قطع في وعاء ماء وتركيبها في وقت لاحق من الماء على شريحة زجاجية.
- اضغط على القسم شنت بعناية ضد منشفة ورقية لإزالة المياه المتبقية وفقاعات الهواء المحتملة. تجاريا قبل المغلفة الشرائح الزجاجية لاصقة والتوصية بها.
- شنت الجافة الشرائح لبضع ساعات في فرن على 50 - 60 درجة مئوية.
3. Deparaffinization (الإماهة وحجب الذاتية البيروكسيد)
- تزج الشرائح 2X إلى زيلين (بديل زيلين بدلا من ذلكزيروكس-200)، في كل مرة 15-20.
- شطف في 99٪ من الإيثانول.
- لمنع النشاط البيروكسيداز الذاتية، احتضان أقسام لل30 'في حل الميثانول التي تحتوي على 0.25٪ بيروكسيد الهيدروجين.
- مواصلة معالجة الجفاف عن طريق استخدام الإيثانول مع زيادة محتوى الماء (99٪، 70٪، وتنتهي في الماء المقطر.
- من هذه النقطة حتى المتصاعدة من غطاء ينزلق أقسام لها أن تبقى رطبة.
4. مستضد استرجاع
- استخدام باخرة الغذاء لالمغلي الشرائح في حل استرجاع مستضد (في هذه الحالة EDTA الرقم الهيدروجيني 8.5 العازلة) لمدة 60 '(EDTA حل المخزون الاحتياطي يحتوي على 1.21 غرام تريس و 0.37 غرام EDTA الذائبة في 50 مل درهم 2 O؛ لإعداد عمل محلول مخفف محلول المخزون 2.5ML EDTA في 47.5 مل درهم 2 O).
- تهدئة الشرائح على RT تقريبا. 1 ساعة ثم شطف 3 - 5X مع تريس مخزنة المالحة (TBS، استخدم بدلا من ذلك في برنامج تلفزيوني)، ويتألف من 0.05 M تريس و 0.15 م كلوريد الصوديوم. الرقم الهيدروجيني 7.5 تعديل وايعشر حمض الهيدروكلوريك. بدلا من ذلك استخدام TBS التجارية.
5. حجب مواقع غير محددة ملزمة
- لتجنب التفاعلات خلفية غير محددة، واحتضان المقاطع على RT لمدة 30 'في حل حجب تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) و 90٪ عازلة داكو.
6. انقر نقرا Immunolabeling: الحضانة في وقت واحد مع عبس الابتدائية
- تخفيف المبلغ المطلوب من الأجسام المضادة الأولية في عرقلة الحل واحتضان س / ن في 4 درجات مئوية. لالمناعية مزدوجة تجمع بين ألفا-eotaxin (Ccl11، 1: 300) مع α-Cd68 (ED1، 1: 1000) أو α-Iba1 (Aif1، 1: 1000) أو α-Cd8α (ثور 8؛ 1: 200) .
- شطف الشرائح 3-5x مع العازلة TBS (استخدم بدلا من ذلك 10X عازلة داكو مخفف).
- تخفيف المبلغ المطلوب من الأجسام المضادة الثانوية (المعقدة البيروكسيديز مكافحة الماعز وAP-مترافق مكافحة فأر، على حد سواء 1: 200) في عرقلة الحل واحتضان 1 ساعة على RT.
- شطف الشرائح 3 - 5X العازلة مع TBS (لناالبريد بدلا من 10X المخفف عازلة داكو).
- احتضان الشرائح مع مجمع أفيدين-الفجل البيروكسيديز (HRP) المخفف في عرقلة الحل لمدة 1 ساعة على RT.
- شطف الشرائح 3 - 5X العازلة مع TBS (استخدم بدلا من ذلك 10X عازلة داكو مخفف).
7. التصور
- التصور من الأجسام المضادة الثانوية ملزمة المسمى AP-
- إعداد 0.1 عازلة M تريس، حمض الهيدروكلوريك عن طريق إذابة 12.1 غرام تريس في 1 لتر درهم 2 O وضبط درجة الحموضة إلى باستخدام حمض الهيدروكلوريك. استخدام نفس عازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك لإعداد 1 M حل الليفاميزول. إعداد الطازجة 4٪ نانو 2 الحل في DH 2 O.
- للحصول على 50 مل من الأزرق (FB) الركيزة سريع (حجم اللازمة لكوفيت الزجاج القياسية واحد) بحل 6.25 ملغ نفتول-AS-MX-الفوسفات في 312.5 DMF ميكرولتر في أنبوب زجاجي ويقلب في 50 مل من قبل حرارة (37 ° C) عازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك. حل 12.5 ملغ FB RR الملح في 312.5 ميكرولتر 2 N حمض الهيدروكلوريك إضافة 312.5 ميكرولتر من قبل استعداداتأحمر 4٪ نانو 2 حل ويحرك الخليط في نفس 50 مل من العازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك قبل تحسنت. هزة خفيفة حتى يصبح سائل أصفر واضح وأخيرا إضافة 77 ميكرولتر من معدة مسبقا محلول 1 M الليفاميزول. الترشيح الحصول على الخليط ويصب على الشرائح وضعها في كوفيت الزجاج.
- الشروع في الحضانة عند 37 درجة مئوية، والسيطرة على عملية وضع تحت مجهر الضوء تقريبا. كل 15-30 دقيقة. إذا تحول غامض، يحل محل الحل FB مع الخليط الطازج.
- شطف الشرائح 3 - 5X مع العازلة TBS ونقل لاحقا إلى العازلة في برنامج تلفزيوني.
- التصور من الأجسام المضادة الثانوية المعقدة البيروكسيديز المربوطة
- إعداد DAB / H 2 O 2 وضع حل عن طريق تمييع 1 مل من محلول الأسهم DAB (25 ملغ DAB لكل 1 مل PBS) في 49 مل برنامج تلفزيوني. إضافة 16.5 ميكرولتر H 2 O 2 و الترشيح قبل صب على أقسام.
- تحويل DAB مولد اللون في عجل جبينن الصباغ يمكن أن يكون فوريا. السيطرة على عملية وضع تحت المجهر الضوئي (حتى بضع ثوان حضانة أطول قد يثير خلفية عالية وتحجب إشارة محددة).
- شدة راسب الصباغ البني يمكن أن تتعزز بدلا من الحضانة في حل يتكون من 2٪ كبريتات النحاس و 0.9٪ كلوريد الصوديوم لمدة 5 ".
- شطف الشرائح 3 - 5X مع برنامج تلفزيوني، وأخيرا مع DH 2 O، واستخدام الاستفادة بدلا من الماء.
- جبل الشرائح مع زلات تغطية مباشرة من الماء باستخدام مائي GelTol المتوسطة المتزايدة. تجنب خلق فقاعات الهواء.
- تسمح التجفيف الكامل للتصاعد المتوسط، على سبيل المثال، س / ن في 4 درجات مئوية. متجر جفت الشرائح على RT.
| 1. | ٪ إيثانول | 20 ' | 40 ° C |
| 2. | ٪ إيثانول | 60 &# 39؛ | 40 ° C |
| 3. | ٪ إيثانول | 90 ' | 40 ° C |
| 4. | ٪ إيثانول | 60 ' | 40 ° C |
| 5. | ٪ إيثانول | 90 ' | 40 ° C |
| 6. | ٪ إيثانول | 60 ' | 40 ° C |
| 7. | ٪ إيثانول | 90 ' | 40 ° C |
| 8. | ٪ إيثانول | 120 ' | 40 ° C |
| 9. | زايلول | 30 ' | 40 ° C |
| 10. | زايلول | 60 ' | 40 ° C |
| 11. | البارافين | 60 ' | 60 ° C |
| 12. | البارافين | 60 ' | 60 ° C |
| 13. | البارافين | 60 ' | 60 ° C |
| 14. | البارافين | 120 ' | 60 ° C |
الجدول 1. معالجة الأنسجة بواسطة الأنسجة تيك VIP فراغ تسلل المعالج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أجريت immunostainings مزدوجة (شارك في stainings) في الثابتة الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين الفئران الجهاز العصبي المركزي وLN أقسام. قطعت 3-5 ميكرون شرائح الأنسجة السميكة باستخدام مشراح زلاجة، التي شنت في وقت لاحق على الشرائح الزجاجية لاصق قبل المغلفة وتعامل كما هو موضح سابقا 10،11،12. لفترة وجيزة، بعد deparaffinizing، الإماهة الأنسجة والذاتية تثبيط البيروكسيديز، تعرضوا المقاطع لعملية استرجاع مستضد، تليها خطوة حجب للقضاء على مواقع الربط غير محددة. أجريت المشارك stainings في المجموعات التالية: أ) Ccl11 / إيبا-1، ب) Ccl11 / ED1 والثالث) Ccl11 / CD8. أثيرت عبس الأولية المستخدمة لكل المشاركين في تلطيخ في نوعين من أنواع مختلفة (الماعز والفأرة، على التوالي)، والتي مكنت الحضانة الخاصة بهم في وقت واحد. وقد تصور Ccl11 من البني ناتج التفاعل البيروكسيديز، في حين إيبا-1، ED1 و CD8، والتي تصور إشارة AP الزرقاء.
الآثار البيئية-together.within الصفحات = "1"> سبق أن وصفت نتائج المعروضة هنا بمزيد من التفصيل وفي سياق أوسع في دراستنا الأخيرة عن دور chemokine Ccl11 في التصلب المتعدد (MS) تشبه neuroinflammation 10. وفقا لIHC التحليلات التي أجريت في الفئران الجهاز العصبي المركزي، وكان Ccl11 الحاضر في pericarya، التشعبات والمحاور من الخلايا العصبية تقع في القرون البطنية من المادة الرمادية الحبل الشوكي (الشكل 1A و B). وعلاوة على ذلك، كانت Ccl11 + خلايا البلازما واحدة للكشف في أقسام الأنسجة نفسها (الشكل 1A)، وكذلك Ccl11 احد + / ED1 + الضامة والخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الدماغ لوحظ في الموقع التهاب (لا تظهر البيانات. ED1 هو علامة من بروتين الليزوزومية في الضامة تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة و13). والجدير بالذكر، أنه لم يتم العثور Ccl11 chemokine شارك في توطين مع إيبا-1 + الضامة والخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الدماغ (1A، إيبا-1 هو علامة للكشف عن تأين الكالسيوم 2+ -bindi البروتين نانوغرام 14).
البروتين على أساس IHC-الاستهداف التي تؤدى في LN الفئران الطرفية عرضت البروتين Ccl11 شارك في التعريب مع ED1 (الشكل 2B). ومع ذلك، لم تكن هناك أية CD8 + T الخلايا الليمفاوية إفراز Ccl11 اكتشافها في أقسام الأنسجة نفسها (الشكل 2A، تم الكشف عن خلايا CD8 + باستخدام مكافحة Cd8α، علامة للحصول على خلايا T في الغالب السامة للخلايا التي تربط لمعقد التوافق النسيجي الكبير أنا الجزيئات 15). باستثناء حذف عبس الابتدائية خلال س / ن حضانة في عرقلة الحل، والتعامل مع المقاطع التحكم كما هو موضح في البروتوكول. (، B كما وردت في أرقام 1A، B و2A) لم يلاحظ أي إشارات الكشف عن البروتينات المستهدفة في أقسام الجهاز العصبي المركزي وLN التحكم (الشكل 1C 2C و، على التوالي).
ق / ftp_upload / 50425 / 50425fig1.jpg "/>
الشكل 1. A، B: انقر نقرا المناعية في الفئران LN. الأجسام المضادة الأولية الموجهة ضد chemokine Ccl11 في تركيبة مع أي α-CD8 (A) أو ED1 (B). ولم يلاحظ أي شارك في الترجمة ضمن نفس الخلية لCcl11 + (البني) و CD8 + الخلايا (الأزرق) (ب): Ccl11 إشارة كشف (البني) شارك في توطين مع علامة لبروتين الليزوزومية في الضامة (ED1 والأزرق). C: السيطرة السلبية. والتفاصيل تظهر خلايا المقيمين غير المسماة في LN الطرفية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. A، B: انقر نقرا المناعية في الفئران Sالحبل بينال. القرن البطني من المادة الرمادية واظهار Ccl11 في pericarya العصبية، التشعبات والمحاور (البني) المشارك ملطخة إما إيبا-1 + (A؛ الأزرق) أو ED1 + (باء؛ الأزرق) الضامة / الخلايا الدبقية الصغيرة C: السيطرة السلبية. والتفاصيل تظهر خلايا المقيمين غير المسماة في القرن البطني من المادة الرمادية الحبل الشوكي. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وغالبا ما تتطلب إجراءات IHC القياسية تعديلات محددة للحصول على نتيجة أفضل، وهو ما يعني عادة خبرة واسعة ولكن أيضا "التجربة والخطأ" النهج. من إعداد الأنسجة حتى التصور الهدف، لا يجوز إخضاع تقريبا كل خطوة في بروتوكول لمصممة بشكل فردي التعديلات من أجل تحسين النتيجة النهائية. بروتوكول تلطيخ مزدوج المعروضة هنا مثالا البروتين على أساس IHC استهداف تعديل ولا سيما لتقييم العلاقات المتبادلة بين البروتينات المستهدفة من اهتمامنا الثابتة الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين الفئران أقسام الجهاز العصبي المركزي وLN الأنسجة المتضررة من neuroinflammation. على هذا النحو، فإنه يمكن استخدامها في برنامج تعليمي لتعلم تقنية IHC، ولكن أيضا كمصدر للإلهام للمحاكمات أكثر تقدما. ومع ذلك، ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن مجرد استنساخ هذا البروتوكول لاستهداف البروتينات الأخرى و / أو في الأنسجة الأخرى من المقدمة هنا قد تولد نتائج دون المستوى الأمثل.
> في الموقع التهجين باستخدام مقفل الحمض النووي (LNA) riboprobe ضد Ccl11 عرضت upregulation من مستويات مرنا منها في الجهاز العصبي المركزي من الفئران سلالة مسانج 10. هذا الاستنتاج ما أكده QPCR يحلل. وعلاوة على ذلك، كشفت QPCR Ccl11 upregulation أيضا في LN الطرفية مسانج مقارنة مع السلالة البرية من نوع (وزن). وأخيرا، البقعة الغربية (WB) أظهرت upregulation كبير من البروتين Ccl11 في كل الأنسجة المستهدفة للمحمية المرض مسانج الفئران سلالة 10. ولذلك، فإننا تهدف إلى التحقيق في أصل هذه chemokine مباشرة في الأنسجة المستهدفة، ولهذا الغرض قمنا بتطوير هنا وصف بروتوكول تلطيخ مزدوجة.
وبالاضافة الى تجنب الميكانيكية ضررا للأنسجة أثناء تشريح ما بعد الوفاة وزوال الكلس بعد التثبيت، قد تظهر باجتزاء الأنسجة صعبة جدا. عادة ما يتطلب باجتزاء المهارة والممارسة. نوعية شريحة تعتمد على العديد من جوانب الصورةاوك وتعديل زاوية قائمة بين كتلة الأنسجة والسكين من أجل الحد من الضغوط التي مورست على عينة خلال عدة قطاعات، سرعة القطع، الخ سمك شرائح الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين التي تنتجها مشراح زلاجة قد تختلف 2-50 ميكرون. قطع هي التي شنت شرائح الأنسجة البارافين من حمام ماء دافئ على الشرائح الزجاجية ويفضل المغلفة تجاريا مع لاصقة مثل بولي-L-يسين أو aminopropyltriethoxysilane (APTS) لضمان سيطرة أفضل أثناء إجراء تلطيخ تطلبا. وعلى النقيض من البرد أقسام الأنسجة التي يتم قطع في حوالي -20 درجة مئوية باستخدام cryomicrotome والمجففة في RT قبل تلطيخ، تبريد وشرائح كتل البارافين في RT، وتجفيفها بعد ذلك في 50- 60 درجة مئوية قبل deparaffinization.
الحفاظ على درجة عالية من بنية الأنسجة، مورفولوجيا الخلايا والهدف الحواتم ضرورية لتقييم التوطين والترابط من البروتينات المستهدفة. من أجل تحقيق بريزر الأنسجة الأمثلvation، والعينات يجب أن تكون ثابتة بشكل صحيح، وذلك باستخدام إما التخثر أو مثبتات عبر ربط. التخثر مثبتات، مثل الإيثانول، وغالبا ما يستخدم لحفظ البرودة. ويتحقق البروتين تمسخ باستخدام الايثانول من خلال جفاف الأنسجة 9؛ مما قد يؤدي إلى عدم كفاية الحفاظ الخلوي 16. وعلى النقيض من مثبتات التخثر، والفورمالديهايد هو ربط عبر تثبيتي الذي هو الأكثر استخداما في الأنسجة الروتينية وIHC 9 لكل من الحفاظ على الأنسجة cryo- والبارافين. لقد حققت تثبيت الأمثل للجرذ الجهاز العصبي المركزي وLN عن طريق غمر في حل والفورمالديهايد لمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية قبل زوال الكلس وتضمينها البارافين لاحق. على الرغم من تسبب تغيرات عميقة في التشكل من الجزيئات (الفورمالديهايد وهي تشكل الجسور الميثيلين أن تشعبي البروتينات، وبالتالي قناع مولدات المضادات، التي قد تحول دون ملزمة محددة من الأجسام المضادة)، ويوفر هذا شبه عكسها، التساهمية كاشف عالية التأهيليةإيتي الحفاظ على الأنسجة. والجدير بالذكر أن درجة الحرارة ومدة التثبيت مع الكواشف عبر ربط قد تؤثر عدة جوانب IHC مثل باجتزاء، كشف حاتمة وحتى عبر التفاعل. وهكذا على حد سواء دون تثبيت والإفراط في تثبيت باستخدام الكواشف القائم ألدهيد مثل الفورمالديهايد قد تسبب القطع الأثرية التي ترجع في المقام الأول إلى انحلال ذاتي أو المفرطة الروابط عبر 17 على التوالي. ومع ذلك، لتلوين الخلفية غير محدد بسبب بروتين مسعور ملزمة لوحظ من قبل overfixation يمكن تخفيض باستخدام مخازن المملحة منخفضة تحتوي المنظفات غير أيوني، أو عن طريق رفع درجة حموضة المخزن المؤقت التخفيف عند استخدام عبس بولكلونل 18. ومع ذلك، يمكن أن ينخفض لتلوين الخلفية غير محددة (الضوضاء) الناجمة عن تفاعلات البروتين الأيونية وكهرباء باستخدام مخازن مخفف مع القوة الأيونية عالية، والتي في نفس الوقت قد تزيد من الضوضاء الناجمة عن البروتين مسعور ملزمة 18. عندما يتعلق الأمر الكشف عن الحواتم الهدف، والفورمالديهايد، طتغيير nduced من الهيكل العالي من البروتينات يمكن أن يكون، وإن لم يكن تماما، عكس من استرجاع مستضد 19: أ) عن طريق التسخين في المخازن مع مختلف القيم الرقم الهيدروجيني (الناجم عن الحرارة استرجاع حاتمة (هير)، ب) من خلال تدهور الأنزيمية (البروتياز التي يسببها استرجاع حاتمة (الرصيف، و 20))، ثالثا) من خلال حضانة في قلوية قوية أو محلول حمض، أو السكروز 21، 22 أو IIII) عن طريق التعامل مع حمض الفورميك المركز 23. يبدو هير مناسب لغالبية الهدف الحواتم 19. وبالاضافة الى مدة التسخين، قد تكون قيمة الرقم الهيدروجيني من الحلول مثل EDTA (الرقم الهيدروجيني 5.5، 8.5 أو 9.0) أو عازلة سيترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.0- 6.2) ضروري لنتائج هير. والجدير بالذكر، تم تحقيق نتيجة مرضية للغاية في دراستنا بالبخار العينات لمدة 1H في حل EDTA مع قيمة الرقم الهيدروجيني 8.5.
على الرغم من أن الأجسام المضادة ربط تفضيلي لالحواتم الخاصة، جذب انوعي، على غرار حج وما شابه ذلك ملزمةالمواقع، لا يمكن استبعادها تماما. والجدير بالذكر، ربما الأسلوب الأكثر فعالية للحد من تلطيخ الخلفية حضانة في منع البروتينات (مثل FCS المستخدمة في دراستنا) قبل تطبيق عبس الأساسي 9. ويفضل وحيدة النسيلة عبس الابتدائية على أية حال على القيمة المطلقة بولكلونل بسبب ارتفاع خصوصية وبالتالي انخفاض إشارة الخلفية غير محددة. ومع ذلك، لا يزال قد تظهر عبر التفاعل، كما يتم توجيه عبس وحيدة النسيلة ضد الحواتم تتألف عادة من عدد قليل من الأحماض الأمينية، والتي قد تكون جزءا من بعض الدول الأخرى (غير محددة) بروتين 24. على عكس وحيدة النسيلة، وتقاسم المنافع بولكلونل لديها فرصة أكبر للاعتراف الإسوية متعددة من البروتين المستهدف. كنا في البداية اثنين عبس الأساسي مختلفة للكشف عن Ccl11: ط) على بولكلونل أثيرت في الماعز والثاني) وحيدة النسيلة أثار في الماوس. في أيدينا، أظهرت كل من منتجات نفس النمط تلطيخ لchemokine الهدف. من أجل القيام في وقت واحد شارك في تلطيخ، وكنا الماعز مكافحة الفئران Ccl11 أب في تركيبة مع الأجسام المضادة ضد إيبا-1، ED1 و CD8، على التوالي، التي أنتجت كل في الماوس. ومع ذلك، بالإضافة إلى وقت واحد، المناعية مزدوج ويمكن أيضا أن يؤديها بشكل متتالي 25، كما هو مطلوب للمشاركة في وضع العلامات على القيمة المطلقة الأساسي أنتجت في نفس النوع.
ويقدر تركيز العمل على النحو الأمثل من القيمة المطلقة المستخدمة في دراستنا من خلال سلسلة تجارب تخفيف باعتبارها النسبة المثلى بين شدة إشارة محددة، والضوضاء في الخلفية. ومع ذلك، ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن تركيز العمل الأمثل من نفس الأجسام المضادة قد تختلف في بعض الأحيان بين الأجهزة، والأنواع، علم الأمراض الخلفية، الخ والجدير بالذكر، لم يكن مطلوبا permeabilization في إجراء تلطيخ قد حققت أداء في البارافين جزءا لا يتجزأ، 3-5 ميكرون أقسام الأنسجة السميكة، ومع ذلك، المنظفات مثل تريتون X-100 لا يزال من الممكن تم استخدامها للحد من التوتر السطحي، وبالتالي تسهيل الربط بين المستضد والأجسام المضادة. علىمطلوب مخالف، وتحسين permeabilization- بوساطة من اختراق أب عادة للكشف عن البروتين في الخلايا أو تعليق خلية مثقف (مناعية (ICC))، لالمناعي (IF) في الأقسام البرد وIHC / IF في العذبة (سميك، vibratome قطع) احلرية العائمة شرائح الأنسجة.
ضوابط متعددة مهمة بشكل أساسي لتوليد / immunotargeting موثوقة محددة. كما تحكم إيجابية، كنا الرئتين من نموذج الفئران من الربو، حيث أننا يمكن أن كشف Ccl11 + الحمضات. حضنت الضوابط السلبية فقط في عرقلة الحل س / ن في 4 درجات مئوية في غياب عبس الأساسي.
ذكرنا سابقا بعض الأسباب والحلول الممكنة للحد من إشارة الخلفية. قد يحدث المنتجات المناعية غير محددة أيضا التفاعل بين DAB وpseudoperoxidase من خلايا الدم الحمراء والبيروكسيديز من خلايا الدم النخاعي 26. نشاط هذه الإنزيمات، كما أن مركز دراسات الضوضاءإد من البيوتين الذاتية أو قد خفضت بالفعل من AP خلال الفورمالين-التثبيت. ومع ذلك، فإن المعالجة مع الميثانول / H 2 O 2 ضرورية لزيادة أو كاملة تعطيل لها 27 و 28. تلطيخ الخلفية الناجمة عن النشاط AP في أنسجة الثدييات يمكن زيادة مستعمل من قبل الليفاميزول 29، أو حامض الخليك 29. غير محددة ملزمة نتيجة لجاذبية الأيونية بين أفيدين والجزيئات الخلوية اتهم معاكس 30 يمكن تجنبها عن طريق استبدال أفيدين من بياض البيض مع streptavidin من السبحية avidinii 31.
DAB هو على الارجح الاكثر استخداما مولد اللون في IHC. إلى جانب DAB (البني ناتج التفاعل)، المكوره البيروكسيديز أخرى في الاستخدام هي 3-أمينو-9-ethylcarbazole (AEC، أحمر)، 4-الكلور-1-نفثول (CN، الأزرق) وtetramethylbenzidine (تمب، الأزرق). اختيار عادة المكوره AP هي FB، الوجبات الأحمر (FR)، بالفوكسين جديد و5-برومو-4-كلورو-3-indolylphosphate / نيترو BLرق نتروبلو كلوريد (BCIP / NBT). الاختيار من الانزيمات والمكوره هو في الأساس مسألة تفضيل الفردية، ومع ذلك، فإنه يمكن أن توجهها الميزات المستهدفة مثل الترجمة، ونمط التعبير، ولكن أيضا من خلال وجود أصباغ الذاتية (الميلانين، هيموسيديرين) 32. مباين هو الخطوة الاختيارية الأخيرة في إجراء IHC عادة ما تؤدى باستخدام الهيماتوكسيلين وسريعة أحمر النووية أو الميثيل الأخضر 18. عموما أكثر ملاءمة لوضع العلامات واحد، مباين يسهل تفسير التشكل الأنسجة وينبغي وضع بمهارة لتجنب أي تدخل في راسب مولد اللون.
عند الانتهاء من أقسام الأنسجة الإجراء تلطيخ يجب أن يتم تنظيمها بعناية مع ساترة باستخدام المتوسطة المتزايدة. وينبغي تجنب تشكيل فقاعات الهواء. بجانب الحماية المادية، تصاعد المتوسطة يحسن التصور وجودة التصوير. إما العضوية / مسعور أو مائي / ماء، والفصلOICE من تصاعد المتوسط يعتمد على ذوبان المنتج النهائي في المذيبات العضوية. في حين أن المتوسط تصاعد toluene- مقرها سيكون مناسبة، على سبيل المثال، لDAB، يمكن تطبيق مائي المتوسطة المتزايدة لجميع المكوره الأنزيمية، بما في ذلك وضع العلامات مضان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 | ||
References
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
- Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
- Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
- Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
- Ramos-Vara, J. A.
- Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
- Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
- Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
- Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
- Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
- Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
- Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , Kluwer Academic. New York. (2002).
- Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
- Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
- Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
- Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
- Nelson, P. N., et al.
- Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
- Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , ASCP Press. Chicago. (2003).
- Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
- Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
- Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
- Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
- Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
