Abstract
Immunohistokemi (IHC) ger mycket specifik, tillförlitlig och attraktiv protein visualisering. Korrekt prestanda och tolkning av en IHC-baserade multi märkning är utmanande, särskilt när de används för att bedöma samspelet mellan målproteiner i vävnaden med en hög fetthalt såsom det centrala nervsystemet (CNS).
Vår protokoll utgör en förfining av standard immunomärkning teknik särskilt justerat för detektering av både strukturella och lösliga proteiner i rått CNS och perifera lymfkörtlar (LN) som påverkas av neuroinflammationen. Icke desto mindre, med eller utan ytterligare modifieringar, våra protokoll kunde sannolikt användas för detektion av andra relaterade proteinmål, även i andra organ och arter än här presenteras.
Introduction
Trots användning av avancerad hög genomströmning analyser utförs på methylome, transkriptom eller proteom nivå, immunfärgning fortfarande den gyllene standarden för proteindetektion direkt i vävnadsprov, cellodling eller en cell cellprov. Genom att avslöja lokaliseringen / fördelningsmönstret kan immunohistokemi (IHC) bedöma relativa förhållanden och topografiska inbördes av målproteiner, och även ange sina biologiska aktiviteter. Därför är IHC allmänt används för kliniska och forskningsändamål, till exempel, för diagnos, behandling utvärderingar, studier av sjukdomsmekanismer, funktionella och fenotypiska förändringar i djurmodeller, etc.
I huvudsak bestående av histologi, patologi, biokemi och immunologi, har IHC betydande framsteg sedan 1941, när fluorescerande antikroppar användes för första gången för att identifiera pneumokocker antigener i den infekterade vävnaden 1. Visualization av cellulära produkter och komponenter från IHC är baserad på bindning av antikroppar (ABS) till deras specifika antigen (Ag). Förutom att använda fluorofor taggade antikroppar kan immunreaktioner även visualiseras genom användning av enzymer som peroxidas 2,3 eller alkalinfosfatas 4. Vidare är koUoidala guldmärkta antikroppar 5 används för att detektera specifik antigen-antikroppsinteraktion av både ljus- och elektronmikroskopi, medan radioaktiva märkningar visualiseras genom autoradiografi.
Ag-Ab immunoreaktion kan upptäckas via direkta och indirekta metoder. Den direkta metoden är väsentligen snabbare och enklare, eftersom den använder direkt märkt primär Abs 6. Men på grund av betydande brist på känslighet, är indirekta metoder föredrog att de direkta sådana. Två steg-anvisningar indirekt detektion kräver omärkt primär Abs, som den första, och märkt sekundära Abs riktade mot den primära Abs, som det andra skiktet 7.Signalförstärkning kan uppnås genom att involvera ytterligare, enzym-kopplad tertiär Ab (tre-stegs indirekt metod) som binder till den sekundära Ab. Vanligen använda metoder indirekta detektions är avidin-biotin och peroxidas-antiperoxidas (PAP). Alternativt kan alkaliskt fosfatas-antialkaline fosfatas (APAAP) komplex användas i stället för PAP-metoden. Noterbart är alkaliskt fosfatas (AP) metoder verkar vara ännu känsligare än immunoperoxidas metoder 4. Avidin-biotin komplex metod (ABC) använder biotinylerad sekundär Ab i kombination med antingen märkt avidin-biotin-komplex (LAB), eller streptavidin-biotin-komplex (SLAB). Detektionskänslighet kan ökas ytterligare genom att involvera avidin märkt med peroxidas eller alkaliskt fosfatas 8. Andra detektionsmetoder som används är polymera märkning, tyramin förstärkning och immunrullningscirkeln 9. Noterbart kan olika detektionsmetoder kombineras för flera Ag detektion i samma vävnadprov, som rapporterades för första gången år 1978 4. Samtidig dubbel immunfärgning presenteras här utfördes i formalinfixerade, paraffininbäddade råtta CNS och LN vävnadssnitt med hjälp av peroxidas-bundet och AP-konjugerade sekundära antikroppar, respektive. Signalerna visualiserades med användning av 3,3-diaminobencidine (DAB) kromogen och Fast Blue (FB) APAAP komplex, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
etiska riktlinjer
Aktuella studien genomförs i enlighet med riktlinjer från den svenska Nämnden för försöksdjurs och Europeiska gemenskapen rådets direktiv (86/609 / EEG) enligt de etiska tillstånd N338 / 09, N15 / 10 och N65 / 10, som godkändes av North Stockholm Animal etikkommittén.
1. Vävnadsberedning
- Perfusion & fixering
- Söva djuret med isofluran att utföra transcardial perfusion via vänster kammare. Initiera sköljningen av kärlsystemet med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna blodkomponenterna, följt av 4% paraformaldehyd i 0,1 M PBS (PFA).
- Fixera dissekerade hjärnor, ryggmärg och perifera LN vävnad genom nedsänkning i PFA. Efter 24 h vid 4 ° C och överför den vävnad från PFA in PBS och lagra vid 4 ° C tills vidare bearbetning. Som alternativ till kommersiella PBS, upplösa 9 g NaCl i 250 ml S &# 246; Rensen buffert och tillsätt 750 ml avjoniserat vatten (dH 2 O); att förbereda 0,2 M Sörensen-buffert (pH 7,4) upplöses 13,8 g NaH 2 PO 4 x 1H H2O och 71,2 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O i 2,5 L dH 2 O.
- Dehydrering & inbäddning
- Skär vävnaden i ungefär 5 mm tjocka partier med hjälp av ett rakblad.
- Initiera vävnadshärdningsprocessen (dehydrering) genom att använda Tissue-Tek VIP Vacuum Infiltration Processor (standardförfarande baserat på nedsänkning i stigande koncentrationer av etanol, följt av xylen och slutligen paraffin (tabell 1).
- Placera vävnaden i en form och häll i flytande paraffin runt provet för att bilda en "paraffinblock". Långtidslagring kräver rumstemperatur (RT). Emellertid före snitt, är det att rekommendera att kyla ner blocken, t.ex., över natt (o / n) vid 4 ° C.
2. Sektione
- Placera paraffinblocket i en fast hållare av släden mikrotom, som kan röra sig fram och tillbaka över kniven. Justera den optimala vinkeln mellan blocket och mikrotomen kniv (som beror på kniv geometri, utan även på skärhastighet och teknik).
- Skär 3-5 pm tjockt tvärsnitt från paraffinblocket.
- Ta bara klippa avsnitt i en vattenbehållare och montera den därefter från vattnet på glasskivan.
- Tryck på den monterade avsnitt noggrant mot en pappershandduk för att avlägsna resterande vatten och potentiella luftbubblor. Kommersiellt pre-belagda självhäftande glas är tillråda.
- Torr monterade diabilder i ett par timmar i en ugn på 50 till 60 ° C.
3. Avparaffinering (Rehydrering & Blockering av endogen peroxidasaktivitet)
- Sänk bilderna 2x i xylen (alternativt xylenersättningXEM-200), varje gång 15-20 '.
- Skölj i 99% etanol.
- För att blockera endogen peroxidasaktivitet, inkubera de sektioner för 30 'i metanollösning innehållande 0,25% väteperoxid.
- Fortsätta rehydrering genom användning av etanol med ökande vatteninnehåll (99%, 70%, slutar upp i destillerat vatten.
- Från denna punkt tills monteringen av täckglas sektionerna måste hållas fuktiga.
4. antigenåtervinning
- Använd ett livsmedel ångbåt för kokning bilderna i en antigenåtervinning lösning (i det här fallet EDTA pH 8,5 buffert) för 60 '(EDTA buffertstamlösning innehåller 1,21 g Tris och 0,37 g EDTA löstes i 50 ml dH 2 O, för att förbereda arbets lösning utspädd 2,5 ml EDTA-stamlösning i 47,5 ml dH 2 O).
- Kyl ner glasen på RT för ca. 1 timme och skölj sedan tre - 5x med Tris-buffrad saltlösning (TBS, alternativt använda PBS) bestående av 0,05 M Tris och 0,15 M NaCl; pH 7,5 justerat with HCl. Alternativt kan du använda kommersiella TBS.
5. Blockerings den ospecifika bindningsställen
- För att undvika ospecifika bakgrundsreaktioner, inkubera de andra avsnitten på RT i 30 'i den blockerande lösningen innehållande 10% fetalt kalvserum (FCS) och 90% DAKO buffert.
6. Dubbel immunomärkning: Samtidig inkubering med primära Abs
- Späd erforderliga mängden av primära antikroppar i den blockerande lösningen och inkubera o / n vid 4 ° C. För den dubbla immunfärgning kombinera α-eotaxin (Ccl11; 1: 300) med α-CD68 (ED1; 1: 1000) eller α-Iba1 (Aif1, 1: 1000) eller α-CD8a (Ox-8; 1: 200) .
- Skölj objektglasen 3-5x med TBS buffert (använd alternativt 10x utspädd DAKO buffert).
- Späd erforderliga mängden sekundära antikroppar (biotinylerad anti-get och AP-konjugerad anti-mus, både 1: 200) i blockeringslösning och inkubera 1 tim på RT.
- Skölj objektglasen 3 - 5x med TBS-buffert (osse alternativt 10x utspädd DAKO buffert).
- Inkubera glasen med avidin-pepparrotsperoxidas komplex (HRP) utspädd i blockeringslösning under 1 timme på RT.
- Skölj objektglasen 3 - 5x med TBS-buffert (använd alternativt 10x utspädd DAKO buffert).
7. Visualisering
- Visualisering av den bundna AP-märkt sekundär antikropp
- Förbereda 0,1 M Tris-HCl-buffert genom upplösning av 12,1 g Tris i en L dH 2 O och justera pH till genom användning av HCl. Använda samma Tris-HCl-buffert för att framställa en M levamisol lösning. Bered färsk 4% NaNO 2 lösning i dH 2 O.
- För erhållande av 50 ml av Fast Blue (FB) substrat (volym som erfordras för ett standardglas kyvett) lösa upp 6,25 mg naftol-AS-MX-fosfat i 312,5 | il DMF i glasröret och rör om i 50 ml förvärmda (37 ° C) Tris-HCl-buffert. För att lösa 12,5 mg FB RR salt i 312,5 pl 2 N HCI till 312,5 pl tidigare preparöd 4% NaNOs två lösning och rör om blandningen i samma 50 ml förvärmda Tris-HCl-buffert. Skaka lätt tills den gula vätskan blir klar och tillsätt slutligen 77 ul av tidigare framställd 1 M Levamisol lösning. Filtrat erhållna blandningen och häll på objektglas placeras i glaskuvett.
- Initiera inkubationen vid 37 ° C och styra framkallningsprocess under ljusmikroskop ca.. varje 15-30 min. Om vrida luddigt, byt ut FB lösningen med färsk blandning.
- Skölj objektglasen 3 - 5x med TBS-buffert och överför därefter i PBS-buffert.
- Visualisering av den bundna biotinylerade sekundära antikroppen
- Förbereda DAB / H2O 2 framkallningslösning genom att späda 1 ml DAB-stamlösning (25 mg DAB per 1 ml PBS) i 49 ml PBS. Lägg 16,5 l H2O 2 och filtrat innan hälla på sektioner.
- Omvandling av kromogen DAB i utfällning av pannan pigment kan vara omedelbar. Styra framkallningsprocessen under ljusmikroskop (även några sekunder längre inkubationstid kan ta upp en hög bakgrund och maskera den specifika signalen).
- Intensiteten hos den bruna pigmentet fällningen kan alternativt förstärkas genom inkubering i lösning bestående av 2% kopparsulfat och 0,9% NaCl under 5 '.
- Skölj objektglasen 3 - 5x med PBS och slutligen med dH 2 O, alternativt använda kranvatten.
- Mount objektglasen med täckglas direkt från vattnet genom användning av vattenhaltig GelTol monteringsmedium. Undvik att skapa luftbubblor.
- Medge fullständig torkning av monteringsmedium, t ex, o / n vid 4 ° C. Store torkade diabilder på RT.
| 1. | % Etanol | 20 ' | 40 ° C |
| 2. | % Etanol | 60 &# 39; | 40 ° C |
| 3. | % Etanol | 90 ' | 40 ° C |
| 4. | % Etanol | 60 ' | 40 ° C |
| 5. | % Etanol | 90 ' | 40 ° C |
| 6. | % Etanol | 60 ' | 40 ° C |
| 7. | % Etanol | 90 ' | 40 ° C |
| 8. | % Etanol | 120 ' | 40 ° C |
| 9. | xylen | 30 ' | 40 ° C |
| 10. | xylen | 60 ' | 40 ° C |
| 11. | Paraffin | 60 ' | 60 ° C |
| 12. | Paraffin | 60 ' | 60 ° C |
| 13. | Paraffin | 60 ' | 60 ° C |
| 14. | Paraffin | 120 ' | 60 ° C |
Tabell 1. Vävnadsbearbetning av Tissue-Tek VIP Vakuum Infiltration Processor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dubbla immunostainings (co-färgningar) utfördes i formalinfixerade, paraffininbäddade råtta CNS och LN sektioner. 3-5 pm tjocka vävnadsskivor skars med hjälp av en släde mikrotom, monteras därefter på förbelagda självhäftande glas och behandlades som tidigare beskrivits 10,11,12. Kortfattat, efter deparaffinizing, vävnads rehydrering och endogent peroxidas inaktivering, har sektionerna utsattes för antigenåtervinning processen, följt av ett blockeringssteg för att eliminera ospecifika bindningsställen. De båda färgningar utfördes i följande kombinationer: i) Ccl11 / Iba-1, ii) Ccl11 / ED1 och iii) Ccl11 / CD8. Den primära Abs används för varje co-färgning har uppkommit i två olika arter (get och mus, respektive), vilket möjliggjort deras samtidiga inkubation. Ccl11 visualiserades genom brun peroxidas reaktionsprodukten, medan Iba-1, ED1 och CD8, synliggjordes av den blå AP-signalen.
10. Enligt den IHC-analyser utfördes i råtta CNS, Ccl11 var närvarande i pericarya, dendriter och axoner av nervceller som finns i de ventrala hornen av ryggmärgen grå substans (Figur 1A och B). Dessutom enkel Ccl11 + plasmaceller kunde detekteras i samma vävnadssnitt (Figur 1A), såväl som enstaka Ccl11 + / ED1 + makrofager och hjärn bosatta mikroglia observerades vid inflammationsstället (data ej visade; ED1 är en markör för lysosomalt protein i aktiverade makrofager och mikroglia 13). Noterbart var Ccl11 kemokin hittades inte co-lokaliserande med Iba-1 + makrofager och hjärna bosatta mikroglia (1A, Iba-1 är en markör för detektering av joniserat Ca2 + -bindi ng protein 14).
IHC-baserade proteininriktning utförs i den perifera råtta LN uppvisade Ccl11 protein samlokalisering med ED1 (Figur 2B). Emellertid inga Ccl11-utsöndrande CD8 + T-lymfocyter var detekterbara i samma vävnadssnitt (figur 2A; CD8 + celler detekterades med användning av anti-CD8a, markör för övervägande cytotoxiska T-celler som binder till MHC klass I-molekyler 15). Utom för att utesluta primär Abs under O / N inkubation i blockeringslösningen, var kontrollsektioner behandlades såsom beskrivits i protokollet. Inga detekteringssignaler från målproteinerna (som presenteras i figurerna 1A, B och 2A, B) observerades i CNS och LN styrsektioner (Figur 1C och 2C, respektive).
s / ftp_upload / 50425 / 50425fig1.jpg "/>
Figur 1. A, B: Double immunfärgning i Rat LN. Primära antikroppar riktade mot Ccl11 kemokin i kombination med antingen α-CD8 (A) eller ED1 (B). Ingen co-lokalisering inom samma cell observerades för Ccl11 + (brun) och CD8 + -celler (blå) B:. Ccl11 detekteringssignal (brun) co-lokaliserande med markören för en lysosomalt protein i makrofager (ED1, blå). C: Negativ kontroll; en detalj som visar omärkta residensceller i det perifera LN. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. A, B: Double immunfärgning i Rat SPinal Cord. Ventrala horn den grå massan uppvisar Ccl11 i neuronala pericarya, dendriter och axoner (brun) co-färgades med antingen Iba-1 + (A, blå) eller ED1 + (B, blå) makrofager / mikroglia celler C. Negativ kontroll; en detalj som visar omärkta bosatta celler i den ventrala horn ryggmärgen grå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standard IHC-procedurer kräver ofta särskilda anpassningar för att uppnå ett optimalt resultat, som ofta innebär omfattande erfarenhet men också "trial and error" -metoden. Från förberedelse vävnad tills målvisualisering, kan nästan varje steg i protokollet underkastas individuellt utformade ändringar för att förbättra slutresultatet. Dubbel färgningsprotokollet presenteras här exemplifierar IHC-baserade protein inriktning särskilt justerat för att bedöma samspelet mellan målproteiner av vårt intresse i formalinfixerade, paraffininbäddade råtta CNS och LN vävnadssnitt som drabbats av neuroinflammationen. Som sådan kan den användas som en handledning för att lära sig tekniken med IHC, men också som en inspirationskälla för mer avancerade försök. Det bör dock hållas i minnet att en ren reproduktion av detta protokoll för att rikta andra proteiner och / eller i andra vävnader än här presenteras kan generera suboptimala resultat.
In situ hybridisering med användning av låst nukleinsyra (LNA) riboprob mot Ccl11 uppvisade uppreglering av respektive mRNA-nivåer i CNS av kongena råttstammen 10. Denna slutsats bekräftades av qPCR analyser. Vidare avslöjade qPCR Ccl11 uppreglering även i kongena perifera LN jämfört med vildtypen (wt) stam. Slutligen Western Blöt (WB) visade signifikant uppreglering av Ccl11 protein i båda målvävnaderna sjukdomen skyddade kongena råttstam 10. Därför syftade vi att undersöka ursprunget till denna kemokin direkt i målvävnader, och för detta ändamål vi utvecklat här beskrivna dubbelfärgningsprotokollet.
Förutom att undvika mekaniska skador på vävnaden under obduktion dissekering och efter fixering urkalkning kan vävnad sektionering verkar ganska utmanande. Sektione kräver oftast skicklighet och praxis. Kvaliteten på skiva är beroende av många aspekter such som att justera en rät vinkel mellan vävnadsblock och kniven i syfte att minska det tryck som appliceras på provet under skärning, kan skärhastigheten, etc. Tjocklek på paraffininbäddade vävnadsskivor framställda genom släde mikrotom varierar från 2 till 50 um. Skär paraffinvävnadsskivor är monterade från ett varmvattenbad på objektglas företrädesvis kommersiellt belagda med ett lim, såsom poly-L-lysin eller aminopropyltrietoxisilan (APTS) för att säkerställa en bättre grepp under krävande färgningsproceduren. I motsats till Cryo vävnadssnitt som skärs vid approximativt -20 ° C med användning cryomicrotome och torkades vid RT före färgningen, kyldes paraffinblock skivas vid RT, och torkas därefter vid 50- 60 ° C före avparaffinering.
Mycket bevarade vävnad arkitektur, cellmorfologin och mål epitoper är viktiga för att bedöma lokalisering och samverkan av målproteiner. För att uppnå optimal vävnad bevaradetion, prover måste vara ordentligt fast, antingen med koagulering eller tvärbindande fixativ. Koagulerande fixativ, såsom etanol, oftare används för frysförvaring. Proteindenaturering med användning av etanol uppnås genom vävnads uttorkning 9; vilket kan resultera i otillräcklig cellulär konservering 16. I motsats till att koagulera fixativ, är formaldehyd ett tvärbindande fixativ som oftast används vid rutinmässig histologi och IHC 9 för både cryo- och paraffinvävnadskonservering. Vi har uppnått en optimal fixering för rått-CNS och LN genom nedsänkning i formaldehydlösning under 24 h vid 4 ° C före urkalkning och efterföljande paraffininbäddning. Trots att orsaka djupgående förändringar i konforma av makromolekyler (formaldehyd bildar nämligen metylenbryggor som tvärbinder proteiner och därmed maskera antigener, som kan förhindra specifik bindning av antikroppar), denna semi-reversibel, kovalent reagens ger hög kvaltetsvävnads bevarande. Anmärkningsvärt, kan temperaturen och varaktigheten av fixering med tvärbindningsreagens påverkar flera aspekter av IHC såsom sektionering, epitop upptäckt och även korsreaktivitet. Således både under fixering och överfixering med hjälp av aldehyd-baserade reagens såsom formaldehyd kan orsaka artefakter som i första hand på grund av autolys eller överdriven tvärbindningar 17, respektive. Icke desto mindre kan en ospecifik bakgrundsfärgning på grund av hydrofoba proteinbindning observeras av overfixation reduceras med användning av låga saltade buffertar innehållande nonjoniska detergenter, eller genom att höja pH-värdet i utspädningsbuffert vid användning av polyklonala Abs 18. Däremot kan en ospecifik bakgrundsfärgning (buller) som orsakas av joniska och elektroproteininteraktioner reduceras med hjälp av utspädningsbuffertar med hög jonstyrka, som samtidigt kan förvärra det buller som orsakas av hydrofoba proteinbindning 18. När det gäller detektion av mål-epitoper, formaldehyd-induced förändring av den tertiära strukturen hos proteiner kan vara, även om inte helt, reverseras av antigenåtervinning 19: i) genom upphettning i buffertar med olika pH-värden (värmeinducerad epitop (HIER), ii) genom enzymatisk nedbrytning (proteas-inducerad epitopåtervinning (PIR, 20)), iii) genom inkubation i stark alkalisk eller sur lösning, eller sackaros 21, 22 eller iiii) genom behandling med koncentrerad myrsyra 23. HIER verkar bekvämt för majoriteten av målet epitoperna 19. Förutom uppvärmningstiden, kan pH-värdet för lösningarna såsom EDTA (pH 5,5, 8,5 eller 9,0) eller natriumcitratbuffert (pH 6.0- 6.2) vara avgörande för resultatet av HIER. Noterbart var den mest tillfredsställande resultat i vår studie uppnås genom ånga proverna under 1 h i EDTA-lösning med pH-värdet 8,5.
Även antikroppar binder företrädesvis till deras specifika epitoper, attraktion till ospecifik, liknande den besläktade Ag bindandeplatser, inte helt kan uteslutas. Noterbart är förmodligen den mest effektiva metoden för att minska bakgrundsfärgning inkubation i blockerings proteiner (såsom FCS används i vår studie) före tillämpning av primär Abs 9. Monoklonala primära Abs är ändå att föredra framför polyklonala Abs på grund av högre specificitet och därmed minskad ospecifik bakgrundssignal. Ändå korsreaktivitet fortfarande kan tyckas, eftersom monoklonala Abs är riktade mot epitoper som vanligen består av ett litet antal aminosyror, som kan vara en del av något annat (ospecifikt) protein 24. Till skillnad från monoklonala, polyklonala Abs har en större chans att känna igen flera isoformer av målproteinet. Vi använde ursprungligen två olika primära Abs att upptäcka Ccl11: i) en polyklonal uppvuxen i get och ii) en monoklonal upp i mus. I våra händer, uppvisade båda produkterna samma färgningsmönstret för målet kemokin. För att utföra samtidig co-färgning, använde vi get-anti råtta Ccl11 Ab i kombination med antikropparna mot Iba-1, ED1 och CD8, respektive, som alla producerats i mus. Ändå, förutom samtidigt, dubbel immunfärgning kan även utföras sekventiellt 25, vilket krävs för co-märkning av primära Abs produceras i samma art.
Den optimala arbetskoncentration av Abs som används i vår studie uppskattades genom provspädningsserie som ett optimalt förhållande mellan intensiteten hos den specifika signalen och bakgrundsbruset. Det bör dock hållas i minnet att en optimal arbetskoncentration av samma antikropp ibland kan variera mellan organ, arter bakgrund patologi, etc. Notably ades permeabilisering inte krävs i vår färgningsprocedur som utförs i paraffininbäddade, 3-5 | j, m tjocka vävnadssnitt, dock detergenter såsom Triton X-100 fortfarande kunde ha använts för att minska ytspänning och därigenom underlätta bindningen mellan antigen och antikropp. PåTvärtom permeabilization- medierad förbättring av Ab penetration vanligen krävs för proteindetektion i odlade celler eller cellsuspensioner (immunocytokemi (ICC)), för immunofluorescens (IF) i Cryo sektioner och IHC / IF i färskt (tjock, vibratome-cut) fri- flytande vävnadsskivor.
Flera kontroller är i huvudsak viktigt för att generera specifika / pålitlig immunotargeting. Som en positiv kontroll använde vi lungor från en råttmodell av astma, där vi kunde upptäcka Ccl11 + eosinofiler. De negativa kontrollerna inkuberades endast i den blockerande lösningen o / n vid 4 ° C i frånvaro av den primära Abs.
Vi har redan nämnt några orsaker och möjliga åtgärder för att minska en bakgrundssignal. En ospecifik immunfärgning produkten kan också förekomma som reaktion mellan DAB och pseudoperoxidas av de röda blodkropparna och peroxidas av myeloidceller 26. Aktiviteten hos dessa enzymer, liksom brus caused av endogena biotin eller AP redan har minskat under formalin-fixering. Men är nödvändig för deras vidare eller fullständig inaktivering 27, 28. Bakgrundsfärgning orsakad av AP-aktivitet i däggdjursvävnader kan ytterligare hämmas av levamisol 29, eller genom ättiksyra 29 förbehandling med metanol / H2O 2. Ospecifik bindning som ett resultat av jonisk attraktion mellan avidin och motsatt laddade cellulära molekyler 30 kan undvikas genom att ersätta avidin från äggvita med streptavidin från Streptomyces avidinii 31.
DAB är förmodligen den mest använda kromogen i IHC. Förutom DAB (brun reaktionsprodukt), andra peroxidas kromogener som används är 3-amino-9-etylkarbazol (AEC, röd), 4-klor-1-naftol (CN, blå) och tetrametylbensidin (TMB, blå). Vanligen väljs AP kromogener är FB, Fast Red (FR), ny fuchsin och 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat / nitro blue tetrazoliumklorid (BCIP / NBT). Valet av enzymer och kromogener är i grunden en fråga om individuell preferens, kan det emellertid styras av målgrupp funktioner såsom lokalisering, uttrycksmönster, utan även genom närvaro av endogena pigment (melanin, hemosiderin) 32. Kontrast är det sista, fakultativa steg i IHC förfarande vanligtvis utförs med hjälp av hematoxylin, kärnkraft snabbt röd eller metylgrönt 18. I allmänhet mer lämplig för den enda märkning underlättar kontrast tolkningen av vävnad morfologi och det bör subtilt utvecklas för att undvika störningar med kromogen fällning.
Efter avslutad vävnadssnitt färgning Förfarandet bör noggrant monteras med en täck med hjälp av en monteringsmedium. Bildandet av luftbubblor bör undvikas. Förutom fysiskt skydd, monteringsmedium förbättrar visualisering och kvalitet avbildning. Antingen organiskt / hydrofoba eller vatten / hydrofila, CHoice av monteringsmediet beroende på lösligheten för slutprodukten i det organiska lösningsmedlet. Medan en toluen- baserat monteringsmedel skulle vara lämplig, till exempel, för DAB, kan vattenmonteringsmedium tillämpas på alla enzymatiska kromogener, inklusive fluorescensmärkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 | ||
References
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
- Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
- Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
- Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
- Ramos-Vara, J. A.
- Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
- Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
- Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
- Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
- Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
- Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
- Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , Kluwer Academic. New York. (2002).
- Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
- Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
- Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
- Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
- Nelson, P. N., et al.
- Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
- Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , ASCP Press. Chicago. (2003).
- Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
- Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
- Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
- Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
- Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
