Abstract
Immunohistochemie (IHC) levert zeer specifiek, betrouwbaar en aantrekkelijk eiwit visualisatie. Correcte uitvoering en interpretatie van een IHC-gebaseerde multicolor etikettering uitdagend, vooral wanneer gebruikt voor het beoordelen van verbanden tussen doeleiwitten in het weefsel met een hoog vetgehalte, zoals het centrale zenuwstelsel (CNS).
Ons protocol is een verfijning van deze techniek immunokleuring bijzonder aangepast voor het detecteren van zowel structurele als oplosbare eiwitten in het rat CNS en perifere lymfeknopen (LN) waarop inflammatoire processen. Niettemin, met of zonder verdere aanpassingen ons protocol kan waarschijnlijk worden gebruikt voor de detectie van gerelateerde targets, zelfs in andere organen en soorten dan hier gepresenteerd.
Introduction
Ondanks het gebruik van geavanceerde high-throughput analyses uitgevoerd op de methyloom, transcriptoom- of zelfs proteoom niveau, immunokleuring blijft de gouden standaard voor eiwit detectie direct in het weefselmonster, celkweek of een cel uitstrijkje. Door de onthulling van de lokalisatie / distributie patroon, kan immunohistochemie (IHC) relatieve verhoudingen en topografische onderlinge relaties van de doeleiwitten te beoordelen, en zelfs geven hun biologische activiteiten. Daarom wordt IHC wijd gebruikt voor klinische en onderzoeksdoeleinden, bijvoorbeeld voor diagnose, behandeling evaluaties studie ziektemechanismen, functionele en fenotypische veranderingen in diermodellen, etc.
Die voornamelijk histologie, pathologie, biochemie en immunologie, heeft IHC aanzienlijke vooruitgang geboekt sinds 1941, toen fluorescent gemerkte antilichamen werden voor het eerst Pneumokokken-antigenen herkennen in het geïnfecteerde weefsel 1. Visualization van cellulaire producten en componenten door IHC is gebaseerd op binding van antilichamen (Ab) niet specifieke antigen (Ag). Naast het gebruik van fluorofoor gelabeld antilichamen kunnen immuunreacties worden gevisualiseerd met behulp van enzymen zoals peroxidase of alkalische fosfatase 2,3 4. Verder colloïdaal goud-tag antilichamen 5 worden gebruikt voor het detecteren van antigeen-antilichaam interactie van licht en elektronenmicroscopie, terwijl radioactieve labels worden gevisualiseerd door autoradiografie.
De Ag-Ab immuunreactie kunnen worden opgespoord via directe en indirecte methoden. De directe werkwijze is in wezen sneller en eenvoudiger, aangezien het direct gebruikt gelabelde primaire Abs 6. Vanwege significant gebrek aan gevoeligheid, indirecte methoden met de directe degenen. Tweestaps indirect detectiemethoden vereisen ongelabeld primaire Abs, als de eerste en gekenmerkt tweede Abs gericht tegen de primaire Abs, de tweede laag 7.Signaalversterking kan gebeuren door met, enzym-gekoppelde tertiaire Ab (drietraps indirecte methode) dat bindt aan de secundaire Ab. Veelgebruikte indirecte detectiewerkwijzen zijn avidine-biotine-peroxidase en antipe- (PAP). Als alternatief kan alkalische fosfatase-antialcalinos fosfatase (APAAP) complex worden gebruikt in plaats van de PAP methode. Met name, alkalische fosfatase (AP) methoden lijken nog gevoeliger dan immunoperoxidase methode 4 zijn. Avidine- biotine complex (ABC) methode gebruikt gebiotinyleerd secundair Ab in combinatie met gemerkte avidine-biotine complex (LAB) of gemerkt streptavidine-biotine complex (SLAB). Detectiegevoeligheid kan verder worden vergroot door met avidine gemerkt met peroxidase of alkalische fosfatase 8. Andere opsporingsmethoden in gebruik zijn polymere etikettering, tyramine versterking en immuno-rolling circle 9. Met name kunnen verschillende detectiemethoden worden gecombineerd voor meerdere Ag detectie in hetzelfde weefselmonster, die in 1978 4. Simultaan dubbele immunokleuring hier gepresenteerd voor het eerst werd gemeld werd uitgevoerd in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde rat CNS en LN weefselcoupes met behulp van peroxidase-gebonden en AP-geconjugeerde secundaire antilichamen, respectievelijk. De signalen werden zichtbaar gemaakt met 3,3'-diaminobenzidine (DAB) chromogeen en de Fast Blue (FB) APAAP complex, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ethische verklaring
Deze studie wordt uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Zweedse Nationale Raad voor proefdieren en de Europese Richtlijn Gemeenschapsraad (86/609 / EEG van de Raad) in het kader van de ethische vergunningen N338 / 09, N15 / 10 en N65 / 10, die werden goedgekeurd door de North Stockholm Animal Ethics Committee.
1. Tissue Voorbereiding
- Perfusie & fixatie
- Verdoven het dier met isofluraan om transcardial perfusie uit te voeren via de linker hartkamer. Start de spoelen van vasculatuur met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan de bloedcomponenten, gevolgd door 4% paraformaldehyde in 0,1 M PBS (PFA) verwijderen.
- Fixeren ontleed hersenen, ruggenmerg en perifere LN weefsel door onder te dompelen in de PFA. Na 24 uur bij 4 ° C en breng het weefsel van PFA in PBS en bewaar bij 4 ° C tot verdere verwerking. Als alternatief voor commerciële PBS, los 9 g NaCl in 250 ml S &# 246; Rensen buffer en voeg 750 ml gedemineraliseerd water (dH 2 O); voorbereiden 0,2 M Sörensen buffer (pH 7,4) los 13,8 g NaH 2 PO 4 x 1 H 2 O en 71,2 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O in 2,5 L dH 2 O.
- Uitdroging & inbedden
- Snijd het weefsel in ongeveer 5 mm gedeelten met een scheermesje.
- Start het weefsel hardingsproces (dehydratie) met de Tissue-Tek VIP Vacuum Infiltration Processor (standaardprocedure gebaseerd op onderdompeling in oplopende concentraties ethanol, gevolgd door xyleen en tenslotte paraffine (tabel 1).
- Plaats het weefsel in een mal en giet de vloeibare paraffine rond het monster een "paraffine blok" vormen. Langdurige opslag vereist kamertemperatuur (RT). Voorafgaand aan het snijden, verdient het aanbeveling afkoelen van de blokken, bijvoorbeeld gedurende de nacht (o / n) bij 4 ° C.
2. Opdeling
- Plaats het paraffineblok in een vaste houder van de slede microtoom, die heen en weer kan bewegen over het mes. Pas de optimale hoek tussen het mes en de microtoom (die afhankelijk mes geometrie, maar ook op de snijsnelheid en de techniek).
- Snijd 3-5 pm dikke doorsneden van de paraffine blok.
- Transfer gewoon knippen sectie in een waterreservoir en monteer deze vervolgens uit het water op het glaasje.
- Druk op de gemonteerde gedeelte zorgvuldig tegen een papieren handdoek om het resterende water en potentiële luchtbellen te verwijderen. Commercieel pre-coated lijm glazen dia's zijn aan te bevelen.
- Dry gemonteerde dia's voor een paar uur in een oven op 50 - 60 ° C.
3. deparaffinisatie (Rehydration en blokkeren van de endogene peroxidase)
- Dompel de dia's 2x in xyleen (alternatief xyleen plaatsvervangerXEM-200), telkens 15-20 '.
- Spoel in 99% ethanol.
- De endogene peroxidase activiteit te blokkeren, incubeer de afdelingen 30 in methanoloplossing die 0,25% waterstofperoxide.
- Verder rehydratatie met ethanol toenemend watergehalte (99%, 70%, eindigend in gedestilleerd water.
- Vanaf dit punt tot het monteren van de dekglaasjes secties vochtig gehouden worden.
4. Antigen Retrieval
- Gebruik een stoomkoker voor het koken van de objectglaasjes in een antigen retrieval oplossing (in dit geval EDTA pH 8,5 buffer) gedurende 60 '(EDTA buffervoorraadoplossing bevat 1,21 g Tris en 0,37 g EDTA werd opgelost in 50 ml dH 2 O, voor de werking voorbereiden Verdun 2,5 ml EDTA-voorraad-oplossing in 47,5 ml dH 2 O).
- Afkoelen van de dia's op RT ca. 1 uur en spoel dan 3 - 5x met Tris gebufferde zoutoplossing (TBS, te gebruiken als alternatief PBS), bestaande uit 0,05 M Tris en 0,15 M NaCl; pH 7,5 bijgesteld with HCl. U kunt ook gebruik maken van commerciële TBS.
5. Het blokkeren van de aspecifieke bindingsplaatsen
- Om niet-specifieke achtergrond reacties te vermijden, incubeer de volgende secties in KT 30 in de blokkerende oplossing bevattende 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 90% DAKO buffer.
6. Dubbelklik immunokleuring: Gelijktijdige incubatie met de primaire Abs
- Verdun benodigde hoeveelheid primaire antilichamen in de blokkerende oplossing en incubeer o / n bij 4 ° C. Voor de dubbele immunokleuring combineren α-eotaxine (Ccl11; 1: 300) met α-CD68 (Ed1; 1: 1000) of α-Iba1 (Aif1, 1: 1000) of α-CD8a (Ox-8; 1: 200) .
- Spoel de dia's 3-5x met TBS-buffer (gebruik als alternatief 10x verdund DAKO buffer).
- Verdun benodigde hoeveelheid secundaire antilichamen (gebiotinyleerde anti-geit en AP-geconjugeerd anti-muis, beide op 1: 200) in de blokkerende oplossing en incubeer 1 uur bij RT.
- Spoel de slides 3 - 5x met TBS-buffer (use alternatief 10x verdund DAKO buffer).
- Incubeer de glaasjes met avidine- mierikswortelperoxidase complex (HRP) verdund in blokkeeroplossing gedurende 1 uur bij RT.
- Spoel de slides 3 - 5x met TBS-buffer (gebruik als alternatief 10x verdund DAKO buffer).
7. Visualisatie
- Visualisatie van de gebonden AP-gelabeld secundair antilichaam
- Bereid 0,1 M Tris-HCl-buffer door het oplossen van 12,1 g Tris in 1 L dH 2 O en de pH instellen op met behulp van HCl. Gebruik dezelfde Tris-HCl-buffer aan 1 M levamisool te bereiden. Bereid vers 4% NaNO 2-oplossing in dH 2 O.
- Tot 50 ml van de Fast Blue (FB) substraat (volume vereist voor een standaard glas cuvet) oplossen 6,25 mg naftol-AS-MX-fosfaat in 312,5 pl DMF in de glasbuis en roer 50 ml voorverwarmd verkrijgen (37 ° C) Tris-HCl buffer. Tot 12,5 mg FB RR zout op te lossen in 312,5 ui 2 N HCl toe te voegen 312,5 ul van eerder preparrood 4% NaNO 2-oplossing en roer het mengsel in dezelfde 50 ml voorverwarmde Tris-HCl buffer. Schud zachtjes tot de gele vloeistof duidelijk wordt en tot slot voeg 77 ul van eerder bereide 1 M Levamisole oplossing. Verkregen filtraat mengsel en giet op dia's geplaatst in het glas cuvet.
- Start de incubatie bij 37 ° C en controle ontwikkelproces onder de lichtmicroscoop ca. elke 15-30 minuten. Als het draaien fuzzy, vervang de FB-oplossing met de verse mengsel.
- Spoel de slides 3 - 5x met TBS-buffer en de overdracht vervolgens in PBS-buffer.
- Visualisatie van het gebonden gebiotinyleerde secundaire antilichaam
- Bereid DAB / H 2 O 2 ontwikkelaaroplossing door 1 ml DAB voorraadoplossing (25 mg DAB per 1 ml PBS) in 49 ml PBS. Voeg 16,5 ul H 2 O 2 en filtraat voorafgaande gieten op secties.
- Omzetting van het chromogeen DAB in het neerslaan van brown pigment kan worden onmiddellijk. De controle van de ontwikkeling van proces in het kader van de lichtmicroscoop (zelfs enkele seconden langer incubatietijd kan een hoge achtergrond te verhogen en te maskeren het specifieke signaal).
- De intensiteit van de bruine pigment neerslag kan ook worden verbeterd door incubatie in de oplossing bestaande uit 2% kopersulfaat en 0,9% NaCl 5 '.
- Spoel de slides 3 - 5x met PBS en tenslotte met dH 2 O, gebruiken tik alternatief water.
- Monteer de dia's met deksel direct glijdt uit het water met behulp van waterig GelTol montage medium. Voorkomen dat er luchtbellen.
- Sta volledige droging van het fixeermiddel, bijvoorbeeld o / n bij 4 ° C. Store gedroogde dia's op RT.
| 1. | % Ethanol | 20 ' | 40 ° C |
| 2. | % Ethanol | 60 &# 39; | 40 ° C |
| 3. | % Ethanol | 90 ' | 40 ° C |
| 4. | % Ethanol | 60 ' | 40 ° C |
| 5. | % Ethanol | 90 ' | 40 ° C |
| 6. | % Ethanol | 60 ' | 40 ° C |
| 7. | % Ethanol | 90 ' | 40 ° C |
| 8. | % Ethanol | 120 ' | 40 ° C |
| 9. | xylol | 30 ' | 40 ° C |
| 10. | xylol | 60 ' | 40 ° C |
| 11. | Paraffine | 60 ' | 60 ° C |
| 12. | Paraffine | 60 ' | 60 ° C |
| 13. | Paraffine | 60 ' | 60 ° C |
| 14. | Paraffine | 120 ' | 60 ° C |
Tabel 1. Tissue Verwerking door de Tissue-Tek VIP Vacuum Infiltration Processor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dubbele immunokleuring (co-kleuringen) werden in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde rat CNS en LN secties. 3-5 micrometer dikke weefsel plakjes werden gesneden met behulp van een slee microtoom, gemonteerd vervolgens op pre-coated lijm glasplaatjes en behandeld zoals eerder beschreven 10,11,12. Kort na deparaffiniseren, weefsel rehydratie en endogene peroxidase inactivering werden secties onderworpen aan het antigeen ophaalproves, gevolgd door een blokkerende stap aspecifieke bindingsplaatsen te elimineren. De co-kleuringen werden uitgevoerd in de volgende combinaties: i) Ccl11 / Iba-1, ii) Ccl11 / Ed1 en iii) Ccl11 / CD8. De primaire Abs gebruikt voor elke co-kleuring zijn gerezen in twee verschillende soorten (geit en muis, respectievelijk), die hun gelijktijdige incubatie ingeschakeld. Ccl11 werd gevisualiseerd door de bruine peroxidase reactieproduct, terwijl Iba-1, Ed1 en CD8 werden gevisualiseerd door de blauwe AP signaal.
10. Volgens de IHC analyses uitgevoerd bij ratten CNS was Ccl11 aanwezig in pericarya, dendrieten en axonen van de neuronen in de ventrale hoorn van het ruggenmerg grijze stof (figuur 1A en B). Bovendien één Ccl11 + plasmacellen detecteerbaar dezelfde weefselsecties (figuur 1A), alsmede enkele Ccl11 + / Ed1 + macrofagen en hersenen resident microglia waargenomen op de ontstekingsplaats (gegevens niet getoond, Ed1 is een marker van lysosomale eiwit in geactiveerde macrofagen en microglia 13). Met name werd Ccl11 chemokine niet gevonden co-lokalisatie met Iba-1 + macrofagen en brain resident microglia (1A, Iba-1 is een merker voor het detecteren geïoniseerd Ca2 + -bindi ng eiwit 14).
IHC-eiwitten targeting uitgevoerd in de perifere rat LN tentoongesteld Ccl11 eiwit co-lokalisatie met Ed1 (Figuur 2B). Echter geen Ccl11-uitscheidende CD8 + -T-lymfocyten werden gedetecteerd in dezelfde weefselsecties (figuur 2A; CD8 + cellen werden gedetecteerd met behulp van anti-CD8a, marker voor voornamelijk cytotoxische T-cellen die binden aan MHC klasse I moleculen 15). Behalve weglaten primaire Abs in o / n incuberen in blokkeeroplossing werden controlesecties behandeld zoals beschreven in het protocol. Nr detectiesignalen van de eiwitten (zoals weergegeven in de figuren 1A, B en 2A, B) waargenomen in het centrale en LN controlesecties (figuur 1C en 2C respectievelijk).
s / ftp_upload / 50425 / 50425fig1.jpg "/>
Figuur 1. A, B: Double Immunokleuring in Rat LN. Primaire antilichamen gericht tegen de Ccl11 chemokine in combinatie met α-CD8 (A) of Ed1 (B). Geen co-lokalisatie binnen dezelfde cel werd waargenomen voor Ccl11 + (bruin) en CD8 + cellen (blauw) B:. Ccl11 detectiesignaal (bruin) co-lokaliseren met de markering voor een lysosomale eiwit in macrofagen (Ed1, blauw). C: Negatieve controle; een detail toont ongelabelde inwoner cellen in het perifere LN. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. A, B: Double Immunokleuring in Rat Spinal Cord. Ventrale hoorn van de grijze stof vertoont Ccl11 in neuronale pericarya, dendrieten en axonen (bruin) co-gekleurd met ofwel Iba-1 + (A; blauw) of ED1 + (B; blauw) macrofagen / microglia cellen C:. Negatieve controle; een detail toont ongelabelde inwoner cellen in het ventrale hoorn van het ruggenmerg grijze massa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IHC standaard procedures vereisen vaak specifieke aanpassingen van een optimaal resultaat, dat gewoonlijk inhoudt ruime ervaring maar ook "trial and error" benadering te verkrijgen. Uit weefsel preparaat tot doel visualisatie kan bijna elke stap in het protocol onderworpen individueel ontwerp modificaties om het uiteindelijke resultaat te verbeteren. Dubbele kleuring protocol hier gepresenteerde voorbeeld IHC-eiwitten richt bijzonder aangepast voor het beoordelen onderlinge relaties tussen de eiwitten van het belang in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde rat CNS en LN weefselsecties beïnvloed door inflammatoire processen. Als zodanig kan het worden gebruikt als een handleiding voor het leren van de techniek van IHC, maar ook als een bron van inspiratie voor geavanceerdere processen. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat een loutere reproductie van dit protocol voor het richten van andere eiwitten en / of in andere weefsels dan hier gepresenteerde kan suboptimale resultaten te genereren.
In situ hybridisatie onder toepassing vergrendeld nucleïnezuur (LNA) riboprobe tegen Ccl11 vertoonde opregeling van de respectievelijke mRNA niveaus in CNS van de congenische rattenstam 10. Deze bevinding werd bevestigd door qPCR analyse. Verder qPCR bleek Ccl11 opregulatie ook in de perifere congenic LN vergelijking met het wildtype (wt) stam. Tot slot, Western Blot (WB) toonde significante opregulatie van de Ccl11 eiwit in beide doelweefsels van de ziekte beschermd congenic rat stam 10. Daarom willen wij aan de oorsprong van deze chemokine direct een onderzoek in de te onderzoeken weefsels, en voor dat doel ontwikkelden we de hier beschreven dubbele kleuring protocol.
Naast het vermijden van mechanische beschadiging van het weefsel tijdens de post-mortem dissectie en post-fixatie ontkalking, kunnen weefsel snijden verschijnen heel uitdagend. Het snijden vereist meestal vaardigheid en oefening. Kwaliteit van de slice is afhankelijk van vele aspecten such het aanpassen van een rechte hoek tussen het weefsel blok en het mes om de druk toegepast monster tijdens het snijden te reduceren, snijsnelheid, etc. De dikte van de in paraffine ingebedde weefselcoupes door slede microtoom kan variëren van 2 tot 50 pm. Snijd paraffine weefselcoupes worden aangebracht vanuit een warmwaterbad op glasplaatjes voorkeur commercieel bekleed met een kleefstof zoals poly-L-lysine of aminopropyltriethoxysilaan (APTS) meer grip tijdens de veeleisende kleuring te waarborgen. In tegenstelling tot weefselsecties die bij ongeveer gesneden -20 ° C met behulp cryomicrotoom en gedroogd bij kamertemperatuur voorafgaand aan de kleuring cryogene gekoeld paraffineblokken worden gesneden bij kamertemperatuur en vervolgens bij 50- 60 ° C gedroogd voordat deparaffinisatie.
Hoogst bewaarde weefsel architectuur, celmorfologie en target epitopen zijn van essentieel belang voor de beoordeling van de lokalisatie en de onderlinge verhoudingen van de doeleiwitten. Om een optimale weefsel preser bereikenvatie, monsters moeten goed worden bevestigd, met behulp van coagulatie of cross-linking fixatieven. Coagulerende fixatieven, zoals ethanol, worden vaker gebruikt voor cryopreservatie. Eiwitdenaturatie behulp van ethanol wordt bereikt door weefseldehydratatie 9; hetgeen kan leiden tot onvoldoende cellulaire conservering 16. In tegenstelling tot coaguleren fixatieven, formaldehyde een verknopend fixatief dat meestal gebruikt in routine histologie en IHC 9 voor zowel cryo- en paraffine weefsel bewaring. We hebben een optimale fixatie van de rat CNS en LN bereikt door onderdompeling in formaline oplossing gedurende 24 uur bij 4 ° C voorafgaand aan ontkalking en daaropvolgende paraffine inbedding. Ondanks waardoor diepgaande veranderingen in de conformatie van macromoleculen (formaldehyde vormt namelijk methyleenbruggen dat eiwitten verknopen en daardoor masker antigenen, die specifieke binding van antilichamen kan voorkomen), deze semi-omkeerbare covalente reagens levert hoge kwateit weefsel bewaring. Met name kunnen de temperatuur en de duur van de fixatie met verknopingsmiddelen verschillende aspecten van IHC zoals snijden, epitoop detectie en zelfs kruisreactiviteit beïnvloeden. Dus zowel onder-fixatie en over-fixatie met behulp van aldehyde-gebaseerde reagentia zoals formaldehyde kunnen artefacten die zijn voornamelijk te wijten aan autolyse of overmatig cross-links 17 veroorzaken, respectievelijk. Niettemin kan een niet-specifieke achtergrondkleuring door hydrofobe eiwitbinding waargenomen door overfixation worden gereduceerd onder lage gezouten buffers bevattende ionogene detergentia, of door de pH van de verdunningsbuffer bij gebruik van polyklonale Abs 18. Echter kan een niet-specifieke achtergrondkleuring (ruis), veroorzaakt door ionische en elektrostatische eiwitinteracties worden gereduceerd onder toepassing verdunningsmiddel buffers met hoge ionsterkte, die tegelijkertijd het geluid veroorzaakt door hydrofobe eiwitbinding 18 verergeren. Als het gaat om detectie van de doelgroep epitopen, formaldehyde-induced verandering van de tertiaire structuur van eiwitten kunnen zijn, hoewel niet volledig, omgekeerd door antigeenterugtrekking 19: i) door verwarmen in buffers met verschillende pH-waarden (door warmte geïnduceerde epitoop (HIER), ii) van enzymatische afbraak (protease-geïnduceerde epitoop (PIER; 20)), iii) door incubatie in sterk alkalische of zure oplossing, of sucrose 21, 22 of iiii) door behandeling met geconcentreerd mierenzuur 23. HIER lijkt handig voor de meerderheid van de doelgroep epitopen 19. Naast verwarmingsduur kan pH van de oplossingen zoals EDTA (pH 5,5, 8,5 of 9,0) of natriumcitraat buffer (pH 6.0- 6.2) essentieel zijn voor het resultaat van Hier worden. Met name het meest bevredigende resultaat in onze studie werd verkregen door het stomen de monsters gedurende 1 uur in de EDTA oplossing met pH 8,5.
Hoewel antilichamen voorkeur binden aan hun specifieke epitopen, aantrekking aspecifieke, vergelijkbaar met de verwante Ag bindingplaatsen, kan niet volledig worden uitgesloten. Met name, waarschijnlijk de meest efficiënte werkwijze voor het verminderen van de achtergrondkleuring is incubatie in blokkerende eiwitten (zoals FCS in onze studie) voor het aanbrengen van primaire Abs 9. Monoklonale primaire Abs zijn hoe dan ook de voorkeur boven polyklonale Abs als gevolg van hogere specificiteit en daardoor verminderde niet-specifieke achtergrond signaal. Niettemin kruisreactiviteit nog kunnen verschijnen, monoklonale Abs gericht tegen epitopen gewoonlijk bestaande uit een klein aantal aminozuren, die een deel van een andere (niet-specifieke) eiwit 24 kan zijn. In tegenstelling tot monoklonale, polyklonale Abs hebben een hogere kans herkennen meerdere isovormen van het doeleiwit. We aanvankelijk gebruikt twee verschillende primaire Abs naar Ccl11 detecteren: i) een polyklonaal opgegroeid in geit en ii) een monoklonaal opgegroeid in de muis. In onze handen, beide producten vertoonden hetzelfde kleuringspatroon voor de doelgroep chemokine. Met het oog op gelijktijdige co-kleuring uit te voeren, gebruikten we geit-anti rat Ccl11 Ab in combinatie met antilichamen tegen Iba-1, CD8 en Ed1 respectievelijk, die alle werden geproduceerd in muis. Niettemin naast tegelijkertijd dubbele immunokleuring kan ook worden uitgevoerd achtereenvolgens 25, zoals vereist voor co-labeling van de primaire Abs op dezelfde soort.
De optimale concentratie van de werking Abs gebruikt in onze studie werd geschat door middel van proef-verdunningsreeks een optimale verhouding tussen de intensiteit van het specifieke signaal en de achtergrondruis. Er moet echter worden bedacht dat een optimale werking concentratie van hetzelfde antilichaam soms verschillen tussen organen, species, achtergrond pathologie, enz name permeabilisatie niet vereist onze kleuringsprocedure uitgevoerd in paraffine ingebedde, 3-5 um dikke weefselcoupes echter detergentia zoals Triton X-100 nog steeds zijn gebruikt om de oppervlaktespanning verminderen en aldus de binding tussen antigeen en antilichaam te vergemakkelijken. Op deIntegendeel, permeabilization- gemedieerde verbetering van Ab penetratie is algemeen vereist zijn voor proteïne detectie in gekweekte cellen of celsuspensies (immunocytochemie (ICC)), voor immunofluorescentie (IF) in de cryo secties en IHC / IF in vers (dikke, vibratome-cut) gratis- drijvende weefsel plakjes.
Meerdere controles zijn essentieel belang voor het genereren van specifieke / betrouwbaar immunotargeting. Als positieve controle werd gebruik gemaakt longen een rattenmodel van astma, waar we Ccl11 + eosinofielen kan detecteren. De negatieve controles werden geïncubeerd alleen in de blokkeeroplossing o / n bij 4 ° C bij afwezigheid van de primaire Abs.
We hebben al gezegd enkele oorzaken en mogelijke oplossingen voor de vermindering van een achtergrond signaal. Een niet-specifieke immunokleuring product zijn ook zuiver reactie tussen DAB en pseudoperoxidase van de rode bloedcellen en peroxidase van de myeloïde cellen 26. Activiteit van deze enzymen, zoals het geluid caused door endogene biotine of AP al verlaagd gedurende formaline-fixatie. De voorbehandeling met methanol / H 2 O 2 noodzakelijk is voor de verdere en volledige inactivering 27, 28. Achtergrondkleuring veroorzaakt door AP-activiteit in zoogdierlijke weefsels kan verder worden geremd door levamisool 29, of 29 azijnzuur. Aspecifieke binding als gevolg van ionische aantrekking tussen avidine en tegengesteld geladen cellulaire moleculen 30 kan worden voorkomen door het substitueren avidine van eiwit met streptavidine uit Streptomyces avidinii 31.
DAB is waarschijnlijk het meest gebruikte chromogene IHC. Naast DAB (bruin reactieproduct), andere peroxidase chromogenen in gebruik zijn 3-amino-9-ethylcarbazool (AEC, rood), 4-chloor-1-naftol (CN, blauw) en tetramethylbenzidine (TMB; blauw). Gewoonlijk gekozen AP chromogenen zijn FB, Fast Red (FR), nieuwe fuchsine en 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat / nitro blue tetrazolium chloride (BCIP / NBT). De keuze van enzymen en chromogenen is eigenlijk een kwestie van persoonlijke voorkeur, maar het kan worden gestuurd door de beoogde functies zoals lokalisatie, expressiepatroon, maar ook door de aanwezigheid van endogeen pigment (melanine, hemosiderin) 32. Tegenkleuring is de laatste, facultatieve stap in de IHC procedure meestal uitgevoerd met behulp van hematoxyline, nucleaire snel rood of methyl groen 18. Algemeen geschikter voor het gemeenschappelijke kenmerken, tegenkleuring vergemakkelijkt de interpretatie van weefselmorfologie en moet subtiele wijze ontwikkeld om interferentie met het chromogeen neerslag voorkomen.
Na voltooiing van de kleuring procedure weefselcoupes zorgvuldig worden bevestigd met een dekglaasje met een fixeermiddel. Vorming van luchtbellen te vermijden. Naast fysieke bescherming, montage medium verbetert de visualisatie en de kwaliteit van de beeldvorming. Ofwel organische / hydrofoob of waterig / hydrofiele, de chOICE van het fixeermiddel, afhankelijk van de oplosbaarheid van het eindprodukt in het organische oplosmiddel. Terwijl een tolueen- gebaseerd fixeermiddel geschikt, bijvoorbeeld voor DAB zou kunnen waterig fixeermiddel worden toegepast op alle enzymatische chromogenen, waaronder fluorescentie labeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 | ||
References
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
- Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
- Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
- Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
- Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
- Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
- Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
- Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
- Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
- Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
- Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , Kluwer Academic. New York. (2002).
- Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
- Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
- Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
- Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
- Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
- Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
- Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , ASCP Press. Chicago. (2003).
- Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
- Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
- Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
- Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
- Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
