Abstract
Immunhistochemie (IHC) bietet hochspezifische, zuverlässige und attraktive Protein-Visualisierung. Korrekte Durchführung und Interpretation einer IHC-basierten Mehrfarbenkennzeichnung ist anspruchsvoll, insbesondere dann, wenn für die Beurteilung der Zusammenhänge zwischen Zielproteine in das Gewebe mit einem hohen Fettgehalt, wie beispielsweise das zentrale Nervensystem (ZNS) verwendet.
Unser Protokoll stellt eine Weiterbildung der Standard Immunomarkierung Technik besonders angepasst für den Nachweis von sowohl strukturelle als auch lösliche Proteine in der Ratte ZNS und peripheren Lymphknoten (LN) durch Neuroinflammation betroffen. Dennoch mit oder ohne weitere Modifikationen, könnte unser Protokoll wahrscheinlich für die Erkennung von anderen verwandten Protein-Targets verwendet werden, auch in anderen Organen und Arten als hier dargestellt.
Introduction
Trotz Nutzung moderner Hochdurchsatzanalysen auf der Methylom, Transkriptom oder sogar Proteom-Ebene durchgeführt, Immunfärbung bleibt der Goldstandard für die Proteindetektion direkt in der Gewebeprobe, Zellkultur oder einer Zellabstrich. Durch die Offenlegung der Lokalisierung / Verteilungsmuster, Immunhistochemie (IHC) beurteilen kann relativen Verhältnisse und topographischen Zusammenhänge der Zielproteine und sogar zeigen ihre biologischen Aktivitäten. Daher wird IHC breit für klinische und Forschungszwecke verwendet, beispielsweise zur Diagnose, Behandlung Evaluationen Untersuchung von Krankheitsmechanismen, funktionale und phänotypische Veränderungen in Tiermodellen, usw.
Im wesentlichen Histologie, Pathologie, Biochemie und Immunologie umfasst, hat IHC signifikant seit 1941 fortgeschritten, wenn fluoreszierend markierte Antikörper zum ersten Mal verwendet wurden 1 Pneumokokken - Antigene in infizierten Gewebe zu identifizieren. Visualisierung von zellulären Produkten und Komponenten durch IHC basiert von Antikörpern (Abs) zu ihrem spezifischen Antigen (Ag) auf die Bindung. Neben der Verwendung von Fluorophor markierten Antikörper können Immunreaktionen auch unter Verwendung von Enzymen wie Peroxidase 2,3 oder alkalische Phosphatase 4 sichtbar gemacht werden. Ferner werden zum Nachweis spezifischer Antigen-Antikörper - Wechselwirkung von Licht und Elektronenmikroskopie, während radioaktive Markierungen sichtbar gemacht werden durch Autoradiographie kolloidales Gold-markiertem Antikörper 5 verwendet.
Die Ag-Ab-Immunreaktion kann über direkte und indirekte Methoden erfasst werden. Die direkte Methode ist wesentlich schneller und einfacher, da es direkt primäre Abs 6 beschriftet verwendet. Jedoch aufgrund erheblicher Mangel an Empfindlichkeit, sind indirekte Methoden der direkten diejenigen bevorzugt. Zweischritt indirekten Nachweisverfahren unmarkiert erfordern primäre Abs, wie die erste, und markierten sekundären Abs gegen den primären Abs, als die zweite Schicht 7.Signalverstärkung kann durch die Einbeziehung weiterer, enzymgekoppelter tertiären Ab (dreistufigen indirekten Methode), das bindet an den sekundären Ab erreicht werden. Üblicherweise verwendete indirekte Nachweismethoden sind und Avidin-Biotin-Peroxidase-Antiperoxidase (PAP). Alternativ können alkalische Phosphatase-antialkaline Phosphatase (APAAP) -Komplex anstelle des PAP-Methode verwendet werden. Bemerkenswerterweise scheinen alkalischer Phosphatase (AP) Verfahren sogar als 4 Immunperoxidase Methoden empfindlicher zu sein. Avidin-Biotin-Komplex (ABC) -Methode verwendet biotinylierten sekundären Ab in Kombination mit entweder markiertem Avidin-Biotin-Komplex (LAB) oder Streptavidin-Biotin-Komplex (SLAB) markiert. Nachweisempfindlichkeit kann durch Avidin beteiligt mit Peroxidase oder alkalischer Phosphatase markiertem 8 erhöht werden. Andere Nachweisverfahren im Einsatz sind polymere Kennzeichnung, Tyramin - Amplifikation und Immuno-Rolling - Circle - 9. Bemerkenswerterweise können verschiedene Detektionsverfahren für mehrere Ag Detektions in demselben Gewebe kombiniert werden,Probe, die zum ersten Mal im Jahr 1978 4. Simultaneous Doppelimmunfärbungs präsentiert die hier berichtet wurde , wurde in Formalin fixierten, in Paraffin eingebettete Ratten CNS und LN Gewebeschnitten unter Verwendung von Peroxidase-gebundenen und AP-konjugiertem Sekundärantikörper jeweils durchgeführt. Die Signale wurden 3,3'-diaminobencidine (DAB) Chromogen und die Fast Blue (FB) APAAP-Komplex sichtbar gemacht sind.
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Protocol
Ethische Erklärung
Vorliegenden Studie ist es in Übereinstimmung mit den Richtlinien des schwedischen National Board für Versuchstiere und der Europäischen Gemeinschaft Richtlinie (86/609 / EWG) unter den ethischen Genehmigungen durchgeführt N338 / 09, N15 / 10 und N65 / 10, die durch die genehmigt Nord Stockholm Tierethikkommission.
1. Gewebepräparation
- Perfusions & Fixierung
- Anesthetize das Tier mit Isofluran transkardialer Perfusion über linken Ventrikels durchzuführen. Initiieren Spülen von Gefäßen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), um die Blutbestandteile zu entfernen, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (PFA).
- Fixieren Sie seziert Gehirn, Rückenmark und periphere LN Gewebe durch in PFA eingetaucht wird. Nach 24 Stunden bei 4 ° C, übertragen das Gewebe aus PFA in PBS und lagern bei 4 ° C bis zur Weiterverarbeitung. Alternativ zu kommerziellen PBS, lösen sich 9 g NaCl in 250 ml der S &# 246; rensen Puffer und 750 ml VE - Wasser (dH 2 O) hinzuzufügen; 0,2 M Sörensen - Puffer (pH 7,4) lösen sich 13,8 g NaH 2 PO 4 x 1 H 2 O und 71,2 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O in 2,5 l dH 2 O. vorzubereiten
- Dehydration & Einbetten
- Schneiden Sie das Gewebe in etwa 5 mm dicke Abschnitte mit einer Rasierklinge.
- Initiieren des Gewebes Härtungsprozess (Dehydratisierung) , indem das Tissue-Tek VIP Vakuuminfiltrationsprozessor verwendet (Standardverfahren basierend auf Eintauchen in aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol, gefolgt von Xylol und schließlich Paraffin (Tabelle 1).
- Legen Sie das Gewebe in eine Form und gießen in dem flüssigen Paraffin um die Probe eine "Paraffinblock" zu bilden. Langzeitlagerung erfordert Raumtemperatur (RT). Jedoch vor dem Schneiden ist es empfehlenswert , die Blöcke zu kühlen, beispielsweise über Nacht (o / n) bei 4 ° C.
2. Sectioning
- Platzieren Sie den Paraffinblock in eine feste Halterung des Schlittens Mikrotom, die hin und her über das Messer bewegen kann. Stellen Sie den optimalen Winkel zwischen dem Block und dem Mikrotom-Messer (das hängt von Messergeometrie, sondern auch auf der Schnittgeschwindigkeit und Technik).
- Schneiden Sie 3 bis 5 um dicke Querschnitte aus dem Paraffinblock.
- Übertragen Sie einfach schneiden Abschnitt in einen Wasserbehälter und montieren Sie ihn anschließend aus dem Wasser auf den Glasträger.
- Drücken Sie die montierten Abschnitt sorgfältig gegen ein Papiertuch Restwasser und mögliche Luftblasen zu entfernen. Im Handel vorbeschichteten sind Klebstoff Glasobjektträger zu empfehlen.
- Trocken gerahmte Dias für ein paar Stunden in einem Ofen 50 - 60 ° C.
3. Entparaffinierung (Rehydrierung & Blockierung der Endogene Peroxidase)
- Tauchen Sie die Dias 2x in Xylol (alternativ XylolersatzXEM-200), jedes Mal 15 bis 20 '.
- Spülen in 99% Ethanol.
- Um die endogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren, inkubiere die Abschnitte 30 'in Methanollösung, die 0,25% Wasserstoffperoxid.
- Weiter Rückfettung durch Ethanol mit steigendem Wassergehalt unter Verwendung von (99%, 70%, endet in destilliertem Wasser.
- Von diesem Punkt der Abdeckung bis Montage schlüpft Abschnitte feucht gehalten werden müssen.
4. Antigen Retrieval
- Verwenden Sie einen Dampfgarer zum Kochen Sie die Folien in einer Antigen - Retrieval - Lösung (in diesem Fall EDTA pH 8,5 - Puffer) für 60 '(EDTA Puffer - Stammlösung enthält 1,21 g Tris und 0,37 g gelöst EDTA in 50 ml dH 2 O; zur Herstellung des Arbeits Lösung verdünnte 2,5 ml EDTA - Stammlösung in 47,5 ml dH 2 O).
- Das Abkühlen der die Folien auf RT ca. 1 Stunde und dann spülen 3 - 5-fach mit Tris-gepufferte Salzlösung (TBS, verwenden Sie alternativ PBS), bestehend aus 0,05 M Tris und 0,15 M NaCl; pH-Wert 7,5 eingestellt with HCl. Alternativ kommerzielle TBS verwenden.
5. Das Blockieren der unspezifischer Bindungsstellen
- Zur Vermeidung von unspezifischen Hintergrundreaktionen, inkubiere die Abschnitte auf RT für 30 'in der blockierenden Lösung, die 10% fötales Kälberserum (FCS) und 90% DAKO Puffer enthält.
6. Doppelimmunmarkierung: Die gleichzeitige Inkubation mit dem primären Abs
- Verdünnte erforderliche Menge an primären Antikörper in der Blockierungslösung und Inkubieren o / n bei 4 ° C. Für die Doppelimmunfärbungs kombinieren α-Eotaxin (CCL11; 1: 300) mit α-CD68 (Ed1; 1: 1000) oder α-Iba1 (AIF1, 1: 1000) oder α-CD8a (Ox-8; 1: 200) .
- Spülen Sie die Folien 3-5x mit TBS-Puffer (verwenden Sie alternativ 10x verdünnt DAKO-Puffer).
- Verdünnte erforderliche Menge an sekundärem Antikörper (biotinylierter anti-Ziege und AP-konjugiertem Anti-Maus, die beide 1: 200) in der Blockierungslösung und inkubiere 1 h bei RT.
- Spülen Sie die Folien 3 - 5-fach mit TBS-Puffer (use alternativ 10x verdünnt DAKO-Puffer).
- Inkubieren der Objektträger mit Avidin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex (HRP) in der Blockierungslösung für 1 Stunde bei RT verdünnt.
- Spülen Sie die Folien 3 - 5x mit TBS-Puffer (verwenden Sie alternativ 10x verdünnt DAKO-Puffer).
7. Visualisierung
- Visualisierung des gebundenen AP-markierten sekundären Antikörper
- Bereiten 0,1 M Tris-HCl - Puffer durch Lösen von 12,1 g Tris in 1 l dH 2 O und pH - Wert auf HCl unter Verwendung von . Verwenden Sie die gleiche Tris-HCl-Puffer 1 M levamisole Lösung herzustellen. Bereiten Sie frisch 4% NaNO 2 -Lösung in dH 2 O.
- Zur Erzielung 50 ml des Fast Blue (FB) Substrat (Volumen erforderlich für eine Standard-Glasküvette) auflösen 6,25 mg Naphtol-AS-MX-Phosphat in 312,5 ul DMF in der Glasröhre und rühren in 50 ml vorgewärmten (37 ° C) Tris-HCl-Puffer. in 312,5 ul 2 N HCl hinzufügen 312,5 ul zuvor 12,5 mg FB RR Salz zu lösen preparot 4% NaNO 2 Lösung und rühren Sie die Mischung in den gleichen 50 ml vorgewärmtes Tris-HCl - Puffer. Schütteln Sie leicht, bis die gelbe Flüssigkeit klar wird, und fügen Sie schließlich 77 ul zuvor hergestellten 1 M Levamisol Lösung. Das Filtrat erhaltene Mischung und gieße auf platziert Folien in der Glasküvetten.
- Initiieren Sie die Inkubation bei 37 ° C und Kontrollprozess unter dem Lichtmikroskop zu entwickeln ca.. alle 15 - 30 min. Wenn Fuzzy-Drehen, ersetzen Sie die FB-Lösung mit der frischen Mischung.
- Spülen Sie die Folien 3 - 5-fach mit TBS-Puffer und Transfer anschließend in PBS-Puffer.
- Visualisierung des gebundenen biotinylierten sekundären Antikörper
- Bereiten DAB / H 2 O 2 Entwicklungslösung , die durch Verdünnen von 1 ml DAB - Stammlösung (25 mg DAB pro 1 ml PBS) in 49 ml PBS. Fügen 16,5 & mgr; l H 2 O 2 und das Filtrat vor Gießen auf Abschnitte.
- Die Umwandlung des Chromogens DAB in Ausfällen Stirnn Pigment kann sofort erfolgen. Steuern Sie den Entwicklungsprozess unter dem Lichtmikroskop (sogar einige Sekunden längere Inkubationszeit kann einen hohen Hintergrund erhöhen und die Maske das spezifische Signal).
- Die Intensität des braunen Pigmentes Niederschlag kann alternativ durch Inkubation in 2% Kupfersulfat und 0,9% NaCl für 5 ', die aus Lösung verbessert werden.
- Spülen Sie die Folien 3 - 5x mit PBS und schließlich mit dH 2 O, verwenden Sie alternativ Leitungswasser.
- Montieren Sie die Folien mit Deckel direkt aus dem Wasser gleitet durch die Verwendung wässriger GelTol Eindeckmediums. Vermeiden Sie Luftblasen zu schaffen.
- Ermöglichen eine vollständige Trocknung des Befestigungsmedium, beispielsweise o / n bei 4 ° C. Shop getrockneten Folien auf RT.
| 1. | % Ethanol | 20 ' | 40 ° C |
| 2. | % Ethanol | 60 &# 39; | 40 ° C |
| 3. | % Ethanol | 90 ' | 40 ° C |
| 4. | % Ethanol | 60 ' | 40 ° C |
| 5. | % Ethanol | 90 ' | 40 ° C |
| 6. | % Ethanol | 60 ' | 40 ° C |
| 7. | % Ethanol | 90 ' | 40 ° C |
| 8. | % Ethanol | 120 ' | 40 ° C |
| 9. | Xylol | 30 ' | 40 ° C |
| 10. | Xylol | 60 ' | 40 ° C |
| 11. | Paraffin | 60 ' | 60 ° C |
| 12. | Paraffin | 60 ' | 60 ° C |
| 13. | Paraffin | 60 ' | 60 ° C |
| 14. | Paraffin | 120 ' | 60 ° C |
Tabelle 1 Gewebeverarbeitung von Tissue-Tek VIP Vakuuminfiltrationsprozessor.
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Representative Results
Doppelimmunfärbungen (co-Anfärbungen) wurden in Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete Ratten CNS und LN Abschnitten durchgeführt. 3-5 um dicke Gewebeschnitte wurden mit einem Schlitten Mikrotom geschnitten, vorbeschichtete Klebeglasobjektträger aufgebracht anschließend auf und behandelt wie zuvor 10,11,12 beschrieben. Kurz gesagt, nach deparaffinizing, Gewebe Rehydratation und endogene Peroxidase Inaktivierung wurden die Schnitte auf den Antigen-Retrieval-Verfahren unterzogen wird, durch ein Blockierungsschritt folgen unspezifische Bindungsstellen zu beseitigen. i) CCL11 / Iba-1, ii) CCL11 / Ed1 und iii) CCL11 / Cd8: Die Co-Anfärbungen wurden in den folgenden Kombinationen durchgeführt. Der primäre Abs für jeden Co-Färbung verwendet wurden in zwei verschiedenen Arten (Ziege und Maus bezeichnet) erhöht, wodurch ihre gleichzeitige Inkubation aktiviert. CCL11 wurde durch die braune Peroxidase Reaktionsprodukt sichtbar gemacht, während Iba-1, Ed1 und Cd8, durch das blaue AP Signal sichtbar gemacht wurden.
10 beschrieben. Gemäß der IHC in der Ratte durchgeführten Analysen CNS war CCL11 in pericarya, Dendriten und Axone der Neuronen in den ventralen Hörnern des Rückenmarks grauen Substanz (1A und B) angeordnet sind . Außerdem wurden einzelne CCL11 + Plasmazellen nachweisbar in den gleichen Gewebeabschnitten (1A), sowie einzelne CCL11 + / Ed1 + Makrophagen und Gehirn resident Mikroglia an der Entzündungsstelle beobachtet (Daten nicht gezeigt; Ed1 ist ein Marker von lysosomalen Proteins in aktivierten Makrophagen und Mikroglia 13). Bemerkenswerterweise wurde CCL11 Chemokin nicht co-lokalisierenden mit Iba-1 + Makrophagen und Mikroglia Gehirn resident (1A gefunden; Iba-1 ist ein Marker für das Erfassen ionisiert Ca 2+ -bindi ng Protein 14).
IHC-basierten Protein - Targeting in Umfangs Ratte LN ausgeführt CCL11 Protein Kolokalisation mit Ed1 (2B) gezeigt. Es wurden jedoch keine CCL11-sezernierenden CD8 + T - Lymphozyten nachweisbar in den gleichen Gewebeabschnitte (2A; CD8 + -Zellen wurden nachgewiesen unter Verwendung von anti-CD8a, Marker für überwiegend zytotoxische T - Zellen , die an MHC - Klasse - I - Moleküle binden , 15). Mit Ausnahme der Weglassung Primär Abs während o / n Inkubation in der Blockierungslösung wurden die Steuerabschnitte in dem Protokoll beschrieben behandelt. Keine Erfassungssignale der Zielproteine (wie in der 1A dargestellt, B und 2A, B) wurden in das ZNS und LN Steuerabschnitten (1C bzw. 2C) beobachtet.
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Abbildung 1 : A, B: Doppel Immunostaining in der Ratte LN. Primäre Antikörper , der gegen das Chemokin CCL11 in Kombination mit entweder α-CD8 (A) oder Ed1 (B). . CCL11 Detektionssignal (braun) co-lokalisierenden mit dem Marker für eine lysosomale Protein in Makrophagen (Ed1, blau): keine Co-Lokalisierung innerhalb der gleichen Zelle wurde für CCL11 + (braun) und CD8 + Zellen (blau) B beobachtet. C: Negativkontrolle; ein Detail unmarkierten resident Zellen im peripheren LN zeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. A, B: Doppel Immunostaining in der Ratte Spinal Cord. Ventralhorn der grauen Substanz ausstellenden CCL11 in neuronalen pericarya, Dendriten und Axone (braun) co-gefärbt mit entweder Iba-1 + (A; blau) oder ED1 + (B; blau) Makrophagen / Mikroglia - Zellen . C: Negativkontrolle; ein Detail unmarkierten residenten Zellen im Vorderhorn des Rückenmarks grauen Substanz zeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Standard-immunhistochemischen Verfahren erfordern häufig spezifische Anpassungen ein optimales Ergebnis zu erzielen, die häufig umfangreiche Erfahrung beinhaltet, sondern auch "trial and error" -Ansatz. Von Gewebeaufbereitung bis Target-Visualisierung, fast jeder Schritt in dem Protokoll können einzeln unterzogen werden, um entworfen Modifikationen, um das Endergebnis zu verbessern. Doppelfärbung Protokoll hier vorgestellten Beispiel für IHC-basierte Protein besonders angepasst Targeting durch neuroinflammation betroffen Wechselbeziehungen zwischen den Zielproteinen unserer Beteiligung an Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Ratten CNS und LN Gewebeschnitten zu beurteilen. Als solches kann es als ein Tutorial für das Erlernen der Technik der IHC verwendet werden, sondern auch als Quelle der Inspiration für fortgeschrittene Studien. Allerdings ist zu beachten, dass eine bloße Reproduktion dieses Protokolls für die Ausrichtung anderer Proteine und / oder in anderen Geweben gehalten werden, als hier können suboptimale Ergebnisse erzeugen präsentiert.
In - situ - Hybridisierung unter Verwendung gesperrt Nukleinsäure (LNA) Ribosonde gegen CCL11 upregulation der jeweiligen mRNA - Spiegel in CNS des congenic Rattenstamm 10 ausgestellt. Dieser Befund wurde durch qPCR Analysen bestätigt. Ferner ergab qPCR CCL11 upregulation auch im congenic peripheren LN im Vergleich zum Wildtyp (wt) Stamm. Schließlich, Western Blot (WB) zeigte signifikant erhöhte Expression des CCL11 Protein in beiden Zielgeweben der Krankheit geschützten congenic Rattenstamm 10. Daher richtet man den Ursprung dieses Chemokin direkt in den Zielgeweben zu untersuchen, und zu diesem Zweck entwickelten wir das hier Doppelfärbungsprotokoll beschrieben.
Neben der Vermeidung mechanischer Beschädigung des Gewebes während der Post-mortem-Dissektion und Postfixierung Entkalkung, Gewebeschneide könnte ziemlich schwierig erscheinen. Die Aufteilung erfordert in der Regel Geschick und Übung. Die Qualität der Scheibe hängt von vielen Aspekten such als einen rechten Winkel zwischen dem Gewebeblock und dem Messer , um Einstellen des Drucks aufgebracht auf Probe während des Schneidens, Schnittgeschwindigkeit, usw. Die Dicke der in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten hergestellt von Schlitten - Mikrotom kann von 2 bis 50 um variieren zu reduzieren. Schneiden Paraffingewebescheiben aus einem warmen Wasserbad auf Glasobjektträger vorzugsweise mit einem Klebstoff, wie Poly-L-Lysin oder Aminopropyltriethoxysilan (APTS) beschichtet kommerziell montiert sind einen besseren Halt bei der anspruchsvollen Färbeverfahren zu gewährleisten. Im Gegensatz zu Gewebeschnitten cryo die bei etwa geschnitten -20 ° C Kryoschnittmaschinen gewaschen und bei RT vor der Anfärbung unter Verwendung von gekühlten Paraffinblöcke werden bei RT in Scheiben geschnitten und anschließend getrocknet bei 50- 60 ° C vor der Entparaffinierung.
Hochkonservierten Gewebearchitektur, Zellmorphologie und Zielepitope sind essentiell für Proteine Lokalisation und Wechselwirkung der Ziel zu bewerten. Um eine optimale Gewebe preser zu erreichenvierung, haben Proben richtig befestigt werden, entweder Koagulieren oder Vernetzungs Fixative verwendet. Koagulieren Fixiermitteln, wie Ethanol, sind häufiger für die Kryokonservierung verwendet. Proteindenaturierung unter Verwendung von Ethanol 9 durch das Gewebe Entwässerung erreicht; die 16 in unzureichender Zell Erhaltung führen kann. Im Gegensatz zu koagulierenden Fixiermitteln ist Formaldehyd ein Vernetzungs Fixiermittel , die am häufigsten in Routine - Histologie und IHC 9 verwendet wird sowohl für Kryo- und Paraffingewebekonservierung. Wir haben eine optimale Fixierung für die Ratte CNS und LN durch Eintauchen in die Formaldehyd-Lösung für 24 h bei 4 ° C vor der Entkalkung und anschließender Paraffineinbettung erreicht. Trotz verursacht grundlegende Veränderungen in der Konformation von Makromolekülen (Formaldehyd bildet nämlich Methylenbrücken, die Proteine vernetzen und dadurch Antigene maskieren, die spezifische Bindung von Antikörpern zu verhindern kann), ist diese halb reversible kovalente Reagens liefert hohe Quakeit Gewebeerhaltung. Bemerkenswert ist, Temperatur und Dauer der Fixierung mit Vernetzungsreagenzien können verschiedene Aspekte der IHC wie Schneiden, Epitop-Erkennung beeinflussen und sogar Kreuzreaktivität. Also sowohl Unter Fixierung und Über Fixierung unter Verwendung von Aldehyd-basierten Reagenzien wie Formaldehyd verursachen können Artefakte, die in erster Linie sind aufgrund der Autolyse oder übermäßige Querverbindungen 17, respectively. Trotzdem durch eine unspezifische Hintergrundfärbung zu hydrophobem Protein durch overfixation beobachtete Bindung kann unter Verwendung niedriger gesalzen Puffer enthaltend nichtionische Detergentien verringert werden, oder indem der pH - Wert des Verdünnungspuffers erhöht , wenn polyklonale Abs 18 verwendet wird . Jedoch eine unspezifische Hintergrundfärbung (Rauschen) verursacht durch ionische und elektrostatische Protein - Wechselwirkungen könnten unter Verwendung Verdünnungspuffer mit hoher Ionenstärke verringert, was zugleich das Rauschen durch hydrophobe Proteinbindung 18 verursacht verschlimmern. Wenn es um die Detektion der Ziel Epitope kommt, Formaldehyd-induced Veränderung der Tertiärstruktur von Proteinen sein kann, obwohl nicht vollständig, 19 durch Antigen - Retrieval umgekehrt: i) durch Erhitzen in Puffern mit verschiedenen pH - Werten (wärmeinduzierte Epitopdemaskierung (HIER), ii) durch enzymatischen Abbau (Protease-induzierte Epitopdemaskierung (PIER; 20)), iii) durch Inkubation in stark alkalischen oder sauren Lösung oder Saccharose 21, 22 oder iiii) durch mit konzentrierter Ameisensäure 23 zu behandeln. HIER erscheint praktisch für Mehrheit der Ziel - 19 - Epitope. Neben Erwärmungsdauer, pH-Wert der Lösungen wie EDTA (pH 5,5, 8,5 oder 9,0) oder Natriumcitratpuffer (pH 6.0- 6.2) kann für das Ergebnis von HIER wesentlich sein. Bemerkenswerterweise wurde das befriedigendste Ergebnis in unserer Studie durch Dämpfen, die Proben für 1 Stunde in der EDTA-Lösung mit dem pH-Wert 8,5 erreicht.
Obwohl Antikörper gegen die spezifischen Epitope bevorzugt binden, Anziehungs unspezifisch, ähnlich der verwandten Ag BindungsSeiten können nicht ganz ausgeschlossen werden. Bemerkenswert ist , wahrscheinlich die effizienteste Methode für die Hintergrundfärbung zu reduzieren , ist die Inkubation in (in unserer Studie verwendet , wie beispielsweise FCS) Proteine Blockierung vor der Anwendung der primären Abs 9. Monoklonale primäre Abs sind ohnehin über polyklonalen Abs bevorzugt aufgrund höherer Spezifität und dadurch reduziert unspezifische Hintergrundsignal. Trotzdem noch Kreuzreaktivität erscheinen mag, wie monoklonale Abs gegen Epitope gerichtet sind üblicherweise aus einer kleinen Anzahl von Aminosäuren besteht, die 24 ist ein Teil einer anderen (unspezifisch) Protein sein kann. Anders als monoklonale, polyklonale haben Abs eine höhere Chance multiple Isoformen des Zielproteins zu erkennen. Wir haben zunächst zwei verschiedene Primär Abs CCL11 zu erfassen: i) ein polyklonaler Ziege in angehoben und ii) ein monoklonaler Maus in angehoben. In unseren Händen, zeigten beide Produkte die gleiche Färbungsmuster für das Ziel Chemokin. Um die gleichzeitige Co-Färbung durchzuführen, haben wir Ziege-anti Ratte CCL11 Ab in Kombination mit den Antikörpern gegen Iba-1, Ed1 und CD8 verbunden, die alle in der Maus erzeugt wurden. Dennoch neben gleichzeitig können Doppelimmunfärbungs auch nacheinander 25 durchgeführt werden, wie es für die Co-Markierung des primären Abs in der gleichen Art hergestellt erforderlich.
Die optimale Arbeitskonzentration der ABS in unserer Studie verwendet wurde, durch Testverdünnungsreihe als ein optimales Verhältnis zwischen der Intensität des spezifischen Signals und des Hintergrundrauschens geschätzt. Es sollte jedoch bedacht werden , dass eine optimale Arbeitskonzentration von dem gleichen Antikörper manchmal zwischen Organen variieren kann, Spezies, Hintergrund Pathologie usw. Insbesondere Permeabilisierung nicht in unserem Färbeverfahren erforderlich wurde in Paraffin eingebettet ausgeführt, 3-5 & mgr; m dicke Gewebeschnitte jedoch Detergentien wie Triton X-100 immer noch verwendet werden könnte Oberflächenspannung zu verringern und somit die Bindung zwischen Antigen und Antikörper zu erleichtern. Auf demVielmehr wird permeabilization- vermittelte Verbesserung der Ab Penetration häufig zum Proteinnachweis erforderlich in kultivierten Zellen oder Zellsuspensionen (Immunzytochemie (ICC)), für die Immunfluoreszenz (IF) in den Kryo-Abschnitte und IHC / IF in frisch (dick, Vibratom-cut) frei schwebenden Gewebeschnitten.
Mehrere Kontrollen sind im Wesentlichen wichtig für spezifische / zuverlässige immunotargeting zu erzeugen. Als positive Kontrolle verwendeten wir Lungen aus einem Rattenmodell von Asthma, wo wir CCL11 + Eosinophilen erkennen konnten. Die negativen Kontrollen wurden nur in der Blockierungslösung o / n bei 4 ° C in Abwesenheit des primären Abs inkubiert.
Wir haben bereits erwähnt, einige Ursachen und mögliche Abhilfemaßnahmen zur Reduzierung des Hintergrundsignals. Eine unspezifische Immunfärbungs Produkt kann als Reaktions zwischen DAB und Pseudoperoxidase der roten Blutzellen und Peroxidase der myeloischen Zellen treten auch 26. Aktivität dieser Enzyme, ebenso wie die Rausch caused durch endogene Biotin oder AP bereits während Formalin-Fixierung reduziert. Jedoch ist die Vorbehandlung mit Methanol / H 2 O 2 , die für ihre weiteren oder vollständigen Inaktivierung 27, 28 auf . Die Hintergrundfärbung durch die AP - Aktivität in Säugetiergewebe verursacht wird, kann weiter durch Levamisol inhibiert werden 29 oder durch Essigsäure 29. Unspezifische Bindung als Ergebnis ionischer Anziehung zwischen Avidin und entgegengesetzt geladenen zellulären Molekülen 30 können durch Substituieren Avidin aus Eiweiß mit Streptavidin vermieden werden aus Streptomyces avidinii 31.
DAB ist wahrscheinlich die am häufigsten verwendete Chromogen in IHC. Neben DAB (braun Reaktionsprodukt), andere Peroxidase Chromogene in Gebrauch sind 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC, rot), 4-Chlor-1-Naphthol (CN, blau) und Tetramethylbenzidin (TMB; blau). Häufigsten gewählten AP Chromogene sind FB, Fast Red (FR), New Fuchsin und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat / Nitro blue Tetrazoliumchlorid (BCIP / NBT). Die Wahl von Enzymen und Chromogenen ist im Allgemeinen eine Sache der individuellen Präferenz, jedoch kann es durch die Zielfunktionen wie Lokalisierung, Expressionsmuster, sondern auch durch die Anwesenheit von endogenen Pigmente (Melanin, Hämosiderin) 32 gesteuert werden. Counterstain ist das letzte, fakultativer Schritt in der IHC Verfahren in der Regel Hämatoxylin unter Verwendung, Kernechtrot oder Methylgrün 18. Im Allgemeinen besser geeignet für die Einzelkennzeichnung erleichtert counterstain die Auslegung der Gewebemorphologie und es sollte auf subtile Weise eine Beeinträchtigung der Chromogen Niederschlag zu vermeiden, entwickelt werden.
Nach Abschluss der Färbeverfahren Gewebeschnitten vorsichtig mit einem Deckglas montiert werden sollten ein Befestigungsmedium. Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Neben den physischen Schutz, Eindeckmediums verbessert die Visualisierung und die Qualität der Bildgebung. Entweder organisch / hydrophob oder wässrig / hydrophilen, die choice- des Befestigungsmediums wird in Abhängigkeit von der Löslichkeit des Endprodukts in dem organischen Lösungsmittel. Während eine Toluol- basierend Eindeckmediums geeignet wäre, beispielsweise für DAB, wässrige Befestigungsmedium kann auf alle enzymatischen Chromogene angewendet werden, einschließlich Fluoreszenzmarkierung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 | ||
References
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