Abstract
İmmünohistokimya (İHK) son derece özgün, güvenilir ve çekici protein görselleştirme sağlar. Bir IHC tabanlı renkli etiketleme doğru performans ve yorumlama gibi merkezi sinir sistemi (MSS) gibi yüksek yağ içeriğine sahip dokusunda hedef proteinler arasındaki ilişkileri değerlendirmek için kullanılan, özellikle zordur.
Bizim protokol, özellikle fare sinir sistemi ve nöro etkilenen periferal lenf düğümleri (LN), hem de yapısal ve çözünebilir proteinlerin tespiti için düzeltilmiş standart immün tekniğinin bir arıtma temsil eder. Bununla birlikte, daha fazla değişiklik olan veya olmayan, protokol olasılıkla da burada sunulan başka organ ve türlerde, diğer ilgili protein hedeflerinin tespiti için kullanılabilir.
Introduction
methylome, transcriptome hatta proteom düzeyde yapılan analizler gelişmiş yüksek verimlilik kullanımı rağmen, immün doku numunesi, hücre kültürü doğrudan protein tespiti veya bir hücre smear için altın standart olmaya devam etmektedir. yerelleştirme / dağıtım modelini ortaya çıkararak, immünhistokimya (İHK) göreli oranları ve hedef proteinlerin topografik ilişkileri değerlendirmek, ve hatta onların biyolojik aktiviteleri gösterebilir. Bu nedenle, IHC yaygın klinik ve araştırma tanı amacıyla, örneğin, tedavi değerlendirmeleri, hastalık mekanizmaları, hayvan modellerinde fonksiyonel ve fenotipik değişiklikler, vb çalışma için kullanılır
Esasen histoloji, patoloji, biyokimya ve immünoloji oluşan İHK anlamlı floresan etiketli antikorlar enfekte dokuda 1 Pnömokok antijenleri tespit etmek ilk kez kullanıldı 1941 yılından bu yana ilerlemiştir. Vselüler ürünlere ve IHC bileşenlerin isualization spesifik antijen (Ag) antikorlar (ABS) bağlanması üzerine dayanır. Fluorofor etiketli antikorlar kullanılarak Bunun yanı sıra, bağışıklık tepkisi de peroksidaz 2,3 ya da alkalin fosfataz 4 gibi enzimler kullanılarak görüntülenebilir. Radyoaktif etiketler otoradyografi ile görselleştirilmektedir ve daha ileri koloidal altın-etiketli antikorlar 5, ışık ve elektron mikroskopi hem spesifik bir antijen-antikor etkileşimi saptamak için kullanılır.
Ag-Ab immünreaksiyon doğrudan ve dolaylı yöntemlerle tespit edilebilir. Direkt yöntem doğrudan birincil Abs 6 etiketli kullanır gibi esasen daha hızlı ve basittir. Bununla birlikte, duyarlılık önemli olmadığı için, direkt ve indirekt yöntemler olanlar tercih edilir. İki aşamalı indirekt algılama prosedürleri, ikinci kat 7 olarak, birincil Abs yönelik ikincil Abs ilk olarak, birincil Abs etiketsiz ve etiketli gerektirir.Sinyal büyütme daha dahil ederek elde edilebilir, enzime bağlanmış üçüncül antikor (üç aşamalı bir dolaylı yöntem) orta Ab bağlar. Yaygın olarak kullanılan dolaylı saptama yöntemleri avidin-biotin ve peroksidaz antiperoxidase (PAP) bulunmaktadır. Seçenek olarak ise, alkalin fosfataz antialkaline fosfataz (APAAP) kompleksi yerine PAP yöntemi kullanılabilir. Özellikle, alkalik fosfataz (AP) yöntemleri immunperoksidaz yöntemle 4 daha fazla hassas gibi görünmektedir. Avidin-biyotin kompleksi (ABC) yöntemi işaretlenen avidin-biyotin kompleksi (LAB) ile kombinasyon halinde biyotinlenmiş sekonder Ab kullanan, ya da streptavidin-biyotin kompleksi (levha) etiketli. Algılama duyarlılık da peroksidaz veya alkalin fosfataz 8 ile etiketlenmiş avidin dahil ederek arttırılabilir. Kullanılan diğer saptama yöntemleri polimerik etiketleme, tiramin büyütmesi ve bağışıklık haddeleme daire 9 vardır. Özellikle, farklı tespit yöntemleri, aynı dokuda çok Ag tespiti için birleştirilebilirBurada yer alan 1978 4. eşzamanlı yapılan olarak çift immün ilk kez bildirilmiştir örneği sırasıyla peroksidaz-bağlı AP-konjuge sekonder antikor ile formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş sıçan CNS LN doku kesitlerinde uygulandı. sinyalleri sırasıyla, (FB) APAAP kompleksi 3,3'-diaminobencidine (DAB) kromojen ve Fast Blue kullanılarak görselleştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
etik Beyanı
Bu çalışma Laboratuvar Hayvanları için İsveç Ulusal Kurulu ve Avrupa Topluluğu Konsey Direktifi gelen kurallarına uygun olarak yapılır etik izinler altında (86/609 / EEC) N338 / 09, N15 / 10 ve N65 / 10, onaylı edildiği Kuzey Stockholm Hayvan Etik Komitesi.
1. Doku Hazırlanması
- Perfüzyon ve fiksasyon
- sol ventrikül aracılığıyla transcardial perfüzyon gerçekleştirmek için izofluran ile hayvan anestezisi. 0.1 M PBS (PFA) içinde% 4 paraformaldehit ve ardından kan bileşiklerinin ayrılması için fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile damar durulama başlatın.
- PFA içine batırılarak disseke beyinleri, omurilik ve periferik LN doku sabitleşmek. 4 ° C'de 24 saat sonra, daha fazla işlem kadar 4 ° C 'de PBS içine PFA doku ve mağaza aktarın. Alternatif ticari PBS, 250 ml S & 9 gr NaCl çözülür# 246; rensen tampon ve 750 ml deiyonize su ekleyin (dH 2 O); 2.5 L dH 2 O. HPO 2 PO 4 x 2H 2 O 4 x 1 H H2O ve 71.2 g 2 Na 0.2 M Sörensen tamponu (pH 7.4) çözülür 13.8 gr NaH hazırlamak
- Dehidrasyon ve gömme
- Bir ustura kullanılarak yaklaşık 5 mm kalınlığında parçalar halinde doku kesilir.
- Ksilen ve nihayet parafin (Tablo 1) takip Tissue-Tek VIP Vakum Sızma İşlemci (etanol konsantrasyonları artan içine dalma dayalı standart bir prosedür kullanılarak doku sertleşmesi işlemi (dehidratasyon) başlatın.
- bir kalıpta doku yerleştirin ve "parafin blok" oluşturmak için numune etrafında sıvı parafin dökün. Uzun süreli saklama, oda sıcaklığına (RT) gerektirir. Bununla birlikte, kesit önce, gece boyunca, örneğin, 4 ° C'de (O / N) blokları soğumaya tavsiye edilir.
2. Kesit
- bıçak boyunca ileri ve geri hareket edebilen kızak mikrotom sabit tutucu, içine parafin blok yerleştirin. blok ve mikrotom bıçak (o bıçak geometrisine bağlı değil, aynı zamanda kesme hızı ve tekniği) arasında optimum açısını ayarlayın.
- parafin blok 5 mikron kalınlığında kesitler - 3 kesin.
- bir su kabına sadece kesilmiş bölümü aktarın ve cam slayt üzerine su sonradan monte edin.
- kalan suyu ve potansiyel hava kabarcıklarını çıkarmak için kağıt havlu karşı dikkatli monte bölümü basın. Ticari olarak önceden kaplanmış yapışkan cam slaytlar tavsiye ediyoruz.
- 60 ° C - Kuru 50 bir sobada birkaç saat için slaytlar monte edilebilir.
3. Parafinden arındırma lamların (Rehidratasyon & Engelleme Endojen Peroksidaz)
- slaytlar ksilen içine 2x daldırın (alternatif ksilen yerineXEM-200), her zaman 15-20 '.
- % 99 etanol içinde durulayın.
- Endojen peroksidaz aktivitesi engellemek için,% 0.25 hidrojen peroksit içeren metanol çözeltisi içinde "30 için bölümler inkübe edin.
- Su içeriği (% 99,% 70 artış damıtılmış su içine biten etanol kullanılarak rehidrasyon devam edin.
- Kapağın montajı kadar bu noktadan sonra bölümler nemli tutulması gerekir kayar.
4. Antijen Alma
- Çalışma hazırlamak, 60 '' (bu durumda EDTA pH 8.5 tamponu içinde), bir antijen alma çözeltisi slaytlar kaynamaya bir gıda gemi kullanarak (EDTA tampon stok çözeltisi DH 2 O 50 ml, 1.21 g Tris ve 0.37 g EDTA içerir 47.5 ml dH 2 O) çözelti seyreltik 2.5ml EDTA stok solüsyonu.
- yaklaşık RT slaytlar soğumasını. 1 saat karıştırıldı ve daha sonra 3 yıkayın - Tris 5x tuz (TBS, kullanımı, alternatif olarak, PBS), 0.05 M Tris ve 0.15 M NaCl içeren tampon; pH 7.5 ayarlanır, wiinci HCI. Alternatif ticari TBS kullanın.
5. belirsiz Cilt Siteleri Engelleme
- , Spesifik olmayan arka plan reaksiyonları önlemek% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve% 90 DAKO tampon içeren bloke edici çözelti içinde "30, oda sıcaklığında ilgili bölümleri kuluçkalanması.
6. Çift ile immün: Primer Abs ile eş zamanlı Kuluçka
- bloke çözeltisi içinde birincil antikor gerekli miktarda seyreltilir ve O / N 4 ° C'de inkübe edin. (; 1 ED1: 1,000) α-CD68 ile veya α-Iba1 (Aif1, 1: 1000) ya da α-Cd8α (Ox-8; 1: 200):; çift immün için α-eotaksin (300 1 Ccl11) birleştirmek .
- slaytlar TBS tamponu ile 3-5x Durulama (alternatif 10x seyreltilmiş DAKO tampon kullanın).
- bloke çözeltisi içinde ve oda ile 1 saat inkübe edilir: sekonder antikor miktarı (200 biyotinlenmiş anti-keçi, AP-konjüge edilmiş anti-fare, her ikisi de 1) ile seyreltilir.
- (Bizi TBS tamponu ile 5x - slaytlar 3 durulayıne, alternatif olarak 10 x) DAKO tampon seyreltilmiştir.
- RT, 1 saat boyunca bloke çözeltisi içinde seyreltilmiş Avidin-yaban turpu peroksidaz kompleksi (HRP) ile slaytlar inkübe edin.
- slaytlar 3 durulayın - TBS tamponu (alternatif 10x seyreltilmiş DAKO tampon kullanın) ile 5 kat.
7. Görselleştirme
- Bağlı AP-etiketli ikincil antikor Görselleştirme
- 1 L dH 2 O 12.1 g Tris çözülmesiyle 0.1 M Tris-HCl tamponu hazırlayın ve HCl ile pH ayarlanır. 1 M levamisol solüsyonu hazırlamak için, aynı Tris-HCl tampon kullanın. DH 2 O. taze% 4 NaNO 2 çözüm hazırlayın
- (37 (bir standart cam küvet için gerekli hacim) Hızlı Mavi (FB) alt-tabaka bir cam tüp içinde 312.5 ul DMF içinde 6.25 mg Naftol-AS-MX-fosfat çözülür ve önceden ısıtılmış 50 ml ilave edin, 50 ml elde etmek için C) Tris-HCI tampon maddesi. 312,5 ul 2 N HCI içinde 12.5 mg FB RR Tuz çözmek için prepa önce bir 312,5 ul% 4 NaNO 2 çözeltisi, kırmızı ve önceden ısıtılmış Tris-HCI tampon maddesi, aynı 50 ml karıştırın. sarı sıvı berrak hale gelinceye kadar hafifçe çalkalayın ve nihayet önceden hazırlanmış 1 M Levamisole solüsyonu 77 ul ekleyin. Süzüntü karışım elde edilmiş ve bir cam küvet içinde yer slaytlar üzerine dökün.
- 37 ° C'de inkübasyon başlatmak ve yaklaşık ışık mikroskobu altında geliştirme sürecinde kontrol eder. her 15 - 30 dk. bulanık dönüm Eğer taze karışımı ile FB çözümü değiştirin.
- PBS tamponu içine sonradan TBS tamponu ve transfer 5x - slaytlar 3 durulayın.
- Bağlı biotinlenmiş sekonder antikor görselleştirme
- DAB / H2O 2 49 mi, PBS içinde 1 mi DAB stok solüsyonu (1 mi PBS başına 25 mg DAB) seyreltilerek solüsyon geliştirilmesi hazırlayın. Dökme önceki bölümlerde üzerine 16.5 ul H 2 O 2 ve süzüntü ekleyin.
- tetikleyici kaş içine kromojen DAB Dönüşümn pigment hemen olabilir. (Yüksek arka plan yükseltmek ve belirli bir sinyal maskeleyebilir saniye daha uzun inkübasyon bile birkaç) ışık mikroskobu altında gelişen süreci kontrol.
- Kahverengi pigment çökelti yoğunluğu, alternatif olarak 5 '% 2 bakır sülfat ve% 0.9 NaCl'den oluşan çözelti içinde inkübe edilerek artırılabilir.
- Slaytlar 3 durulayın - PBS ile 5x ve nihayet dH 2 O ile, alternatif olarak musluk suyu kullanın.
- Kapak sulu GelTol montaj orta kullanarak sudan doğrudan fişleri ile slaytlar monte edin. hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
- Montaj orta tam kurutma, örneğin, O / N 4 ° C'de izin verin. Mağaza RT slaytlar kurutulmuştur.
| 1. | % Etanol | 20 ' | 40 ° C |
| 2. | % Etanol | 60# 39; | 40 ° C |
| 3.. | % Etanol | 90 ' | 40 ° C |
| 4. | % Etanol | 60 ' | 40 ° C |
| 5. | % Etanol | 90 ' | 40 ° C |
| 6. | % Etanol | 60 ' | 40 ° C |
| 7. | % Etanol | 90 ' | 40 ° C |
| 8. | % Etanol | 120 ' | 40 ° C |
| 9. | ksilol | 30 ' | 40 ° C |
| 10. | ksilol | 60 ' | 40 ° C |
| 11. | Parafin | 60 ' | 60 ° C |
| 12. | Parafin | 60 ' | 60 ° C |
| 13.. | Parafin | 60 ' | 60 ° C |
| 14. | Parafin | 120 ' | 60 ° C |
Doku Tek VIP Vakum Sızma İşlemci Tablo 1. Doku İşleme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çift immunostainings (ko-boyama) formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş sıçan CNS LN bölümlerinde gerçekleştirilmiştir. 3-5 mikron kalınlığında doku dilimleri önceden kaplanmış yapışkan cam slaytlar üzerine sonradan monte edilmiş ve daha önce 10,11,12 tarif edildiği gibi muamele, bir kızak mikrotom kullanılarak kesilmiştir. Kısaca, deparaffinizing doku rehidrasyon ve endojen peroksidaz inaktivasyonu ardından bölümler, spesifik olmayan bağlama merkezlerini ortadan kaldırmak için bir bloke etme aşamasına ve ardından bir antijen alma işlemine tabi tutulur. CO-renklendirmeler aşağıdaki kombinasyonlarda gerçekleştirilmiştir: i) Ccl11 / IBA-1, ii) Ccl11 / Ed1 iii) Ccl11 / CD8. Her ortak boyanması için kullanılan birincil Abs onların eşzamanlı inkübasyon etkin iki farklı türün (sırasıyla keçi ve fare), büyüdü bulundu. IBA-1, Ed1 ve CD8 mavi AP sinyali ile görselleştirilmiştir ise Ccl11, kahverengi bir peroksidaz reaksiyon ürünü ile görselleştirilmiştir.
10 benzeri multipl skleroz (MS) Ccl11 kemokin rolü hakkında bizim son çalışmada daha geniş bir bağlamda tarif edilmiştir. İHK sıçan MSS yapılan analizler göre, Ccl11 pericarya, dendrit ve omurilik gri madde (Şekil 1A ve B) ventral boynuz bulunan nöronların akson mevcuttu. Üstelik, tek Ccl11 + plazma hücreleri, aynı doku bölümleri (Şekil 1A) saptanabilir gibi olduğu bir Ccl11 + / Ed1 + enflamasyon sahasında gözlenen makrofajlar ve beyin ikamet mikroglia (veriler gösterilmemiştir; Ed1 lızozomal proteinin bir belirtecidir aktive edilmiş makrofajlar ve mikroglia 13) yerleştirilmiştir. Özellikle, Ccl11 kemokin Iba-1 + makrofajlar ve beyin ikamet mikroglia (1A ile birlikte lokalize bulunamadı, Iba-1 Ca 2 + -bindi iyonize tespit etmek için bir belirtecidir ng proteini 14).
IHC bazlı protein ED1 (Şekil 2B) olan Ccl11 proteini ko-lokalizasyon sergiledi periferal sıçan LN gerçekleştirilen hedefleme. Bununla birlikte, herhangi bir Ccl11 salgılayan, CD8 + T lenfositlerinin (Şekil 2A; CD8 + hücreleri, anti-Cd8α, MHC sınıf bağlanma baskın olarak sitotoksik T hücreleri için işaretleyici I 15 molekülleri kullanılarak tespit edildi) aynı doku kesitlerinde tespit edilebilmiştir. protokolde tarif edildiği gibi blokaj çözeltisi içinde O / N inkübasyon sırasında birincil Abs atlama dışında, kontrol bölümleri tedavi edildi. Hedef proteinlerin Resim algılama sinyalleri (Şekil 1A, B ve 2A'da gösterildiği gibi, B) merkezi sinir sistemi ve LN kontrol bölümleri (sırasıyla Şekil 1C ve 2C) gözlendi.
s / ftp_upload / 50.425 / 50425fig1.jpg "/>
Şekil 1. A, B: Çift immün Sıçan LN. Ya da a-CD8 (A) ya da ED1 (B) ile kombinasyon halinde Ccl11 kemokin karşı birincil antikor. . Ccl11 algılama sinyali (kahverengi) makrofajlarda lizozomal proteini markeri (Ed1, mavi) ile birlikte lokalize: Aynı hücre içinde Resim eş localisation Ccl11 + (kahverengi) ve CD8 + hücreleri (mavi) B için gözlendi. C: Negatif kontrol; Periferik LN etiketsiz ikamet hücrelerini gösteren bir detay. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. A, B: Çift immün Rat Spinal Kordon. Nöronal pericarya, dendrit ve akson olarak Ccl11 sergileyen gri cevher ventral boynuz (kahverengi) ile birlikte lekeli ya Iba-1 + (A; mavi) ya da ED1 + (B; mavi) makrofajlar / mikroglia hücreleri C:. Negatif kontrol; Omurilik gri cevher ventral boynuzunda etiketsiz ikamet hücrelerini gösteren bir detay. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standart İHK prosedürleri genellikle yaygın geniş deneyime değil, aynı zamanda "deneme yanılma" yaklaşımı ima optimal bir sonuç elde etmek özel ayarlamalar gerektirir. Doku hazırlık hedef görselleştirme kadar protokolde neredeyse her adımı tek tek nihai sonucu iyileştirmek için değişiklik tasarlanmış tabi tutulabilir. Burada sunulan Çift boyama protokolü, özellikle nöro etkilenen formalin ile fikse, parafine gömülü sıçan MSS ve LN doku kesitlerinde bizim ilgi hedef proteinleri arasındaki ilişkileri değerlendirmek için ayarlanmış hedefleme IHC tabanlı protein örneğidir. Bunun gibi, aynı zamanda daha gelişmiş araştırmalar için bir ilham kaynağı olarak, İHK tekniğini öğrenmek için bir öğretici olarak kullanılabilir. Ancak, unutulmaması gerektiğini / veya burada optimal sonuçlar verebilir sunulan dışındaki dokularda ve diğer proteinleri hedef için bu protokolün sadece üreme.
Ccl11 congenic sıçan suşu 10 MSS ilgili mRNA seviyelerinin yükselişini sergiledi karşı> In situ hibridizasyon kilitli nükleik asit (LNA) riboprob'un kullanarak. qPCR doğrulandı Bu bulgu analizleri. Bundan başka, qPCR yabani tip (wt) suşu ile karşılaştırıldığında konjenik periferal LN da Ccl11 regülasyonunu ortaya çıkardı. Son olarak, Western Blot (WB) hastalığı korunan konjenik fare suşu 10 her iki hedef dokularda Ccl11 proteininin önemli bir yukarı regülasyon sergilemiştir. Bu nedenle, biz hedef dokularda doğrudan bu kemokin kökenini araştırmayı amaçladık ve bu amaç için burada anlatılan çift boyama protokolü geliştirdi.
postmortem diseksiyon ve post-fiksasyon yumuşatma sırasında doku mekanik zarar kaçınarak yanı sıra, doku kesit oldukça zor görünebilir. kesit genellikle beceriler ve pratik gerektirir. dilim kalitesi çok yönü s bağlıdırUCH kesme sırasında numune üzerine uygulanan basıncı azaltmak için doku bloğu ve bıçak arasında bir dik açı ayarlama gibi, kızak mikrotom ile üretilen parafine gömülmüş doku dilimleri kesme hızı, vb kalınlığı 2 ila 50 um değişebilir. parafın doku dilimleri talep lekeleme prosedürü esnasında daha iyi bir tutuş sağlamak için tercihen ticari olarak, poli-L-lisin ya da aminopropiltrietoksisilan (APTS) gibi bir yapıştırıcı ile kaplanmış cam slaytlar üzerine ılık su banyosundan monte edilmiştir kesin. boyamadan önce cryomicrotome kullanılarak -20 ° C'de, yaklaşık kesilir ve oda sıcaklığında kurutulur doku bölümleri kriyo aksine, parafin blokları oda sıcaklığında dilimlenmiş ve daha sonra Parafinden arındırmadan önce 50- 60 ° C de kurutulur, soğutulur.
Son derece korunmuş mimari dokusu, hücre morfolojisi ve hedef epitopları hedef proteinlerin lokalizasyonu ve ilişkiyi değerlendirmek için gereklidir. uygun doku preser elde etmek içinkoyar ve numuneler düzgün soğutucu ya da çapraz bağlama fiksatif kullanılarak, sabit olması gerekir. etanol gibi Pıhtılaştırıcı sabitleyiciler, daha sık dondurulması için kullanılır. Etanol kullanılarak protein denatürasyonu doku dehidratasyon 9 yoluyla elde edilir; vasat hücresel koruma 16. neden olabilir. Soğutucu fiksatif aksine, formaldehid en sık rutin histoloji ve IHC 9'da kullanılan bir çapraz bağlama fiksatif hem kriyo ve parafin doku korunması için. Önceden yumuşatma ve daha sonra parafine 4 ° C'de 24 saat süre ile formaldehid çözeltisi içine daldırılması sıçan CNS LN için optimum bir tespit elde ettik. Makromoleküllerin konformasyonunda derin değişiklikler neden olmasına rağmen, bu yarı-geri, kovalent reaktif Qual yüksek içerir (formaldehit, yani proteinlerin çapraz ve dolayısıyla antikor spesifik bağlayıcı engelleyebilir antijenleri, maske metilen köprüsü oluşturur)Sığ doku korunması. Özellikle, çapraz-bağlama maddeleri ile birlikte sıcaklık ve tespitin süresi gibi, kesit epitop algılama ve hatta çapraz reaktivitesi gibi IHC çeşitli yönlerini etkileyebilir. Böylece hem sırasıyla öncelikle autolysis veya aşırı çapraz bağlantıları 17 olan eserler neden olabilir formaldehit gibi aldehit bazlı reaktifler kullanılarak sabitleme-altı ve aşırı tespitin. Bununla birlikte, hidrofobik protein overfixation tarafından gözlemlenen bağlanma nedeniyle bir spesifik bir arka plan boyama ya da poliklonal Abs 18 kullanıldığında seyreltme tamponu pH yükseltilerek iyonik olmayan deterjanlar içeren, düşük tuzlu tampon kullanılarak azaltılabilir. Bununla birlikte, iyonik ve elektrostatik protein etkileşimleri neden olduğu spesifik bir arka plan boyama (gürültü), aynı zamanda, hidrofobik bir protein 18'i bağlama neden olduğu gürültüyü kötüleştirebilir yüksek iyonik gücü ile inceltici tamponlar kullanılarak azaltılabilir. Hedef epitoplarının saptanması söz konusu olduğunda, formaldehit-ıtamamen Antijen geri alımı 19 tarafından geri değil, ancak proteinin tersiyer yapısının nduced değiştirilmesi olabilir: çeşitli pH değerleri (ısı etkisiyle epitop (HIER) ile tampon içinde ısıtılarak i), ii) bozunacak (proteaz indüklenen epitop (iskele; 20)), iii) güçlü bir alkalin ya da asit çözeltisi, ya da sukroz 21 inkübasyon, 22 veya IIII), konsantre formik asit 23 ile muamele etmek suretiyle. Hedefin büyük çoğunluğu 19 epitoplar için HIER uygun görünüyor. Isıtma süresi yanında, örneğin EDTA (pH 5.5, 8.5 veya 9.0) ya da sodyum sitrat tampon maddesi (pH 6.0- 6.2) halinde çözeltilerin pH değeri, HIER sonuçları için gerekli olabilir. Özellikle, bizim çalışmamızda en tatmin edici sonuç pH değeri 8.5 ile EDTA çözeltisi içinde 1 saat süreyle örnekleri buharda sağlandı.
antikorlar, tercihen kendi özel epitoplarını, spesifik olmayan cazibe bağlanan, ancak aynı kökenli Ag benzer bağlamaYer tamamen göz ardı edilemez. Özellikle, arka plan boyama azaltmak için belki de en etkili yöntem öncesinde primer antikorların 9 uygulanmasına (Çalışmamızda kullanılan örneğin FCS gibi) proteinleri bloke kuluçka olduğunu. Monoklonal primer Abs zaten nedeniyle yüksek özgüllük ve böylece azaltılmış spesifik olmayan arka plan sinyaline poliklonal Abs tercih edilir. Monoklonal antikorlara yaygın bir başka (spesifik) proteinin 24 bir parçası olabilen amino asitlerin küçük bir sayıda, aşağıdakilerden oluşan epitoplarına karşı yönlendirilmiş Buna rağmen, çapraz reaktivite hala görünebilir. monoklonal aksine, poliklonal Abs hedef proteinin birden izoformlara tanıma olasılığı daha yüksektir. i) bir poliklonal keçi büyüdü ve ii) bir monoklonal fare kaldırdı: Biz başlangıçta Ccl11 algılamak için iki farklı temel Abs kullanılır. Bizim ellerde, her iki ürün hedef kemokin için aynı boyanma paterni sergiledi. Aynı anda birlikte boyama yapabilmek için, keçi-anti-sıçan Ccl1 kullanılanTüm fare üretildi sırasıyla IBA-1, ED1 ve CD8 karşı antikorlar ile kombinasyon halinde 1 Ab. Aynı türden üretilen primer antikorların eş etiketlenmesi için gerekli Yine de, yanı sıra eş zamanlı olarak, çift immün da sırayla 25 gerçekleştirilebilir.
Çalışmada kullanılan antikorların en uygun çalışma konsantrasyonu belirli bir sinyal yoğunluğu ve arka plan gürültüsünü arasında optimal oranı olarak test seyreltme serisi ile tahmin edilmiştir. Ancak, aynı antikor optimal çalışma konsantrasyonu, bazen organların, türler, arka plan patoloji, vb Özellikle, Permeabilization parafin yapılan bizim boyama prosedüründe gerekli değildi arasında değişebilir akılda tutulmalıdır, 3-5 mikron kalın doku kesitleri, ancak, Triton X-100 gibi deterjanlar de yüzey gerilimini azaltmak için kullanılabilir olabilirdi ve bu nedenle antijen ve antikor arasında bağlanmasını kolaylaştırmak için. ÜzerindeAb penetrasyon aksine, aracılı permeabilization- iyileşme yaygın (immünsitokimya (ICC)) hücreler veya hücre süspansiyonları kültür protein tespiti için gerekli olan, immünofloresans için kriyo bölümlerde ve (IF) IHK / IF taze (kalın, vibratome-cut) 'de serbest doku dilimleri yüzer.
Çoklu kontroller belirli / güvenilir immunotargeting üretmek için temelde önemlidir. Pozitif kontrol olarak, biz Ccl11 + eozinofil tespit olabilir astım sıçan modelinde, akciğerleri kullanılır. Negatif kontroller, birincil antikorların yokluğunda sadece Bloklama çözeltisi, o inkübe / N 4 ° C'de yapıldı.
Biz zaten bir arka plan sinyali azaltılması için bazı nedenleri ve olası ilaçlar belirtmiştik. Bir spesifik immün ürünü, miyeloid hücreler 26 DAB arasındaki reaksiyon ve pseudoperoxidase kırmızı kan hücreleri ve peroksidaz gibi ortaya çıkabilir. Bu enzimlerin aktivitesi, sadece gürültü Caus olarakendojen biotin tarafından ed veya AP zaten formalin fiksasyonu sırasında düşürüldü. Bununla birlikte, metanol / H2O 2 ön-muamele kendi Başka veya tamamen inaktive 27, 28., Memeli dokularında AP aktivitesinin sebep olduğu fonu boyama daha levamizol 29 tarafından inhibe ya da asetik asit 29 ile gerçekleştirilebilir için gereklidir. Avidin ve zıt yüklü hücre moleküllerinin 30 arasındaki iyonik çekim sonucu Spesifik olmayan bağlanma, Streptomyces 31 avidinii gelen streptavidin yumurta beyazından avidin ikame edilmesiyle önlenebilir.
DAB muhtemelen İHK en sık kullanılan kromojen olduğunu. DAB (kahverengi reaksiyon ürünü) yanı sıra, kullanılan diğer peroksidaz kromojenleri 3-amino-9-etilkarbazol (AEC; kırmızı) vardır, 4-Klor-1-naftol (CN, mavi) ve tetrametilbenzidin (TMB, mavi). Genel olarak seçilen AP kromojenleri FB, Fast Red (FR) için yeni Fuchsin ile, 5-bromo-4-kloro-3-indolylphosphate / nitro BLUE tetrazolyum klorit (BCIP / NBT). Enzim ve kromojenler seçimi bu tür lokalizasyonu, sentezleme Desenin hedef özellikleri tarafından yönlendirilir, ama aynı zamanda endojen pigmentler (melanin hemosiderin) 32 varlığı ile olabilir, ancak, esas olarak tek tek bir tercih meselesidir. Counterstain İHK prosedürü son, fakültatif adım genellikle hematoksilin, nükleer fast red veya metil 18 yeşil kullanılarak yapılan olduğunu. Genellikle daha uygun tek etiketlenmesi için, counterstain doku morfolojisi yorumlanmasını kolaylaştırır ve kurnazca kromojen çökelti ile herhangi bir girişimi engellemek için geliştirilmelidir.
boyama işlemi doku kesitlerinde tamamlanması üzerine dikkatli bir şekilde bir montaj ortamı kullanılarak bir lamel ile monte edilmelidir. hava kabarcıklarının oluşumu kaçınılmalıdır. Fiziksel koruma yanında, orta montaj görselleştirme ve görüntüleme kalitesini yükseltir. Ya / organik hidrofobik veya sulu / hidrofilik, CHmontaj orta Ses Bildirim organik çözücü içinde, son ürünün çözünürlüğüne bağlıdır. Bir tolüen göre montaj orta DAB için, örneğin, uygun olacaktır birlikte, sulu bir montaj orta flüoresan etiketleme dahil olmak üzere tüm enzimatik kromojenler uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 | ||
References
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
- Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
- Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
- Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
- Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
- Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
- Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
- Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
- Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
- Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
- Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , Kluwer Academic. New York. (2002).
- Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
- Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
- Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
- Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
- Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
- Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
- Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , ASCP Press. Chicago. (2003).
- Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
- Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
- Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
- Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
- Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
