Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إنتاج Published: June 27, 2013 doi: 10.3791/50434
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Genetics, Harvard Medical School

Summary

وصفنا جمع غير مخصبة

Abstract

العديد من الكائنات الحية توطين التحت خلوية mRNAs وإلى وجهات محددة لمراقبة المكان والزمان التعبير الجيني. وقد أثبتت الدراسات الحديثة أن الغالبية العظمى من Transcriptome على المترجمة إلى موضع اعشوائي في الخلايا والأجنة. نهج واحد لتحديد mRNAs والمترجمة هو لتنقية كيميائيا بنية الخلوية من الفائدة والتعرف على جميع النصوص المرتبطة بها. باستخدام تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية وضعت مؤخرا هو عليه الآن واضحة لتحديد جميع الرنا المرتبطة بنية التحت خلوية. لتسهيل التعرف نسخة من الضروري العمل مع كائن حي مع تسلسل الجينوم الكامل. واحد نظام جذاب للتنقية الحيوية في الهياكل التحت خلوية مقتطفات البيض المنتجة من الضفدع القيطم المورق. ومع ذلك، X. المورق حاليا لايوجد تسلسل الجينوم بالكامل، الأمر الذي يعيق تحديد النص. في هذه المادة ونحن تصف طريقةلإنتاج البيض مقتطفات من الضفادع ذات الصلة، X. مداري، التي لديها تسلسل الجينوم الكامل. ونحن نقدم تفاصيل عن البلمرة أنيبيب وتنقية والعزلة نص. في حين توضح هذه المقالة طريقة محددة لتحديد النصوص أنيبيب المرتبطة بها، ونحن نعتقد أنه سيتم تطبيقها بسهولة على هياكل التحت خلوية أخرى، وسوف توفر وسيلة قوية لتحديد الرنا المترجمة.

Introduction

السيطرة المكانية والزمانية في التعبير الجيني هو المهم بالنسبة لجميع الخلايا، ويكتسي أهمية خاصة من أجل السيطرة على الجنينية المبكرة كلام بسرعة 1. ويتحقق التحكم المكاني في التعبير الجيني من خلال توطين بالموقع من mRNAs وإلى وجهات معينة داخل الخلايا أو الأجنة. في العديد من أنواع الخلايا كبيرة جدا، (على سبيل المثال البويضات والأجنة، والخلايا العصبية) يستخدم توطين مرنا لتقييد التعبير البروتين إلى موقع العمل من البروتين المشفرة. منذ مرنا المترجمة يمكن أن تحفز عدة جولات من إنتاج بروتين وهو أكثر فعالية في توطين مرنا من لتوطين جزيئات البروتين الفردية. وعادة ما يتم قمعها mRNAs والمترجمة translationally حتى تصل إلى وجهتها، والذي يعمل على زيادة الحد توطين البروتين المشفرة 2. بالإضافة إلى العديد من الحالات الموثقة توثيقا جيدا من توطين RNA للسيطرة الزخرفة الجنينية، وقد وثقت العديد من الدراسات mRNAs وأن تكون مترجمةإلى موقع العمل من البروتين المشفرة. ومن الأمثلة البارزة توطين β-الأكتين 3 و Arp2 / 3 4 mRNAs وإلى حافة الرائدة في مجال الخلايا الليفية متحركة وتوطين mRNAs وبالنسبة للعديد من المنظمين الإنقسامية إلى الانتصافي والإنقسامية مغزل 5-7.

وقد تم تحديد العديد من الأمثلة الكلاسيكية من mRNAs والمترجمة من خلال شاشات الوراثية للطفرات تأثير الأمهات وبعد ذلك تم تحديد لترميز الرنا المترجمة. ومع ذلك، فقد بدأت الدراسات الحديثة على نطاق الجينوم لتوفير رؤية أوسع في نطاق الرنا المترجمة. أظهرت دراسة حديثة الشاشة في الموقع التهجين أجنة ذبابة الفاكهة في أن ~ 70٪ من جميع mRNAs ويكون توطين محددة، بما في ذلك العديد من الوجهات رواية 8. حددت تنقية أقدام كاذبة من الخلايا الليفية الماوس مجموعة متنوعة من mRNAs والمترجمة 9. العمل من مجموعتنا باستخدام تنقية البيوكيميائية من الأنابيب الدقيقة من الانتصافي كرهصديد البيض مقتطفات التعرف على مئات mRNAs والتي copurify مع المغزل 5،7. أظهر عملنا أن غالبية mRNAs وأنيبيب المترجمة ترميز البروتينات التي تعمل في السيطرة على الانقسام، ودعم فكرة أن mRNAs وتكون مترجمة إلى موقع العمل من البروتين المشفرة. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على كشف تخصيب مرنا في جزء التحت خلوية من خلال تنقية البيوكيميائية يسلط الضوء على قوة هذا النهج لتحديد mRNAs والمترجمة.

الرنا معظم المترجمة استخدام وسائل النقل النشط على الهيكل الخلوي، إما الأكتين أو الأنابيب الدقيقة، لتحقيق النقل إلى وجهتهم النهائية 10. للحصول على فهم أفضل لمدى وأنواع الرنا أن تكون مترجمة إلى وجهات محددة باستخدام نهج البيوكيميائية فمن الضروري أن يكون هناك نظام في المختبر يمكن أن ألخص العمليات هيكل الخلية. أحد أنظمة رئيس الوزراء لدراسة البيولوجيا هيكل الخلية هي مقتطفات البيض المنتجةمن بويضة غير مخصبة من الضفدع القيطم المورق. X. وقد استخدمت المورق مقتطفات البيض لعقود لدراسة مجموعة واسعة من العمليات هيكل الخلية وساهمت كثيرا في فهمنا للآليات والجزيئات التي تتحكم في الجمعية هيكل الخلية وديناميكية 11. وعلاوة على ذلك، X. المورق مقتطفات بيضة قابلة للالتنقيات على نطاق واسع من الأنابيب الدقيقة والبروتينات المرتبطة 12،13 وهناك أساليب مصممة تصميما جيدا لإنتاج أنواع مختلفة من مقتطفات البيض 14-16. ومع ذلك، للدراسات الجينية وهناك العديد من المآخذ على استخدام X. المورق كنظام نموذج.

على مدى عقود كانت القيطم المورق الضفادع نظام قوي لدراسة البيولوجيا التطورية والخلية، نظرا لحجم البويضة كبيرة والتنمية خارجي قوي 17. وعلاوة على ذلك، وتطوير أنظمة استخراج البيض التي يمكن أن ألخص العديد من بروكيسي الخلويةجعلت ليالي في أنبوب اختبار هذا الضفدع نموذج تجريبي قوي. ومع ذلك، فقد أعيقت القيطم المورق من عدم وجود تسلسل الجينوم الكامل، الذي تباطأ بسبب طبيعة متغاير الترابيع الصبغية من التباين genome.In، وهي من الأنواع ترتبط ارتباطا وثيقا، القيطم مداري، لديه الجينوم مضاعفا التي كانت متسلسلة في عام 2010 18. بينما X. مداري ليس كما لين العريكة تجريبيا باسم اكس. المورق 17 توافر الجينوم التسلسل يجعل من نظام نموذجا جذابا لإجراء تحاليل واسعة الجينوم.

في هذا التقرير ونحن تصف طريقة لجعل الانقسام الاختزالي الثاني، تثبيط الخلايا مقتطفات اعتقال عامل (CSF) من X. مداري 19. نحن ثم تصف طريقة بسيطة لتنقية الأنابيب الدقيقة والرنا يرتبط بها من هذا المقتطف. ويمكن بعد ذلك تحويل الرنا إلى مكتبات قابلة للتسلسل باستخدام تقنيات التسلسل الإنتاجية العالية وضعت مؤخرا. مرة واحدة في المكتباتوالتسلسل أنها يمكن أن تكون محاذاة إلى جينوم الضفدع لتحديد mRNAs والمحددة التي هي المخصب في عينة أنيبيب مقارنة بإجمالي استخراج. هذا يوفر وسيلة قوية للكشف توطين مرنا أنيبيب المستهدفة على نطاق الجينوم واسعة. بالإضافة إلى كونها قادرة على الكشف عن mRNAs والمترجمة، واستخدام التسلسل عالية الإنتاجية وتسلسل الجينوم توفر إمكانية اكتشاف النصوص الرواية التي ليست موجودة حاليا في الشروح قاعدة بيانات عامة.

Protocol

1. جيل من X. مداري بيض

تنظم كل الضفادع مداري القيطم من شركة ناسكو. ويعيش لدينا الضفادع في الموائل المائية أبقى إعادة تدوير نظام توزيع المياه في 27 درجة مئوية. هناك العديد من الخيارات لأنظمة المياه للعناية X. مداري. بعض المعلومات العامة جيدة على هذا أنواع الضفادع ويمكن الاطلاع على المواقع على شبكة الإنترنت من مختبرات هارلاند وغرينجر ( http://tropicalis.berkeley.edu/home/ ، http://www.faculty.virginia.edu/xtropicalis / ). يتم الاحتفاظ بها الضفادع في tankwater تتكون من (0.4 غرام Ciclid بحيرة أملاح، 0.6 غرام من الملح البحري، 0.625 غرام NaHCO 3 لكل لتر من الماء، ودرجة الحموضة 7.0) 20. هذه النتائج وصفة في موصلية ~ 1800 ميكروثانية، وهي الملوحة العالية للX. مداري. ومع ذلك، فقد وجدنا أن الضفادع لدينا تزدهر في ثيتم تحسين و البيئة وجودة البويضة. وصفات tankwater بديلة يمكن العثور على أعلاه في الموارد المدرجة لX. العام الرعاية مداري.

  1. يتم حقن الضفادع مع الإنسان gonadotropin المشيمي (قوات حرس السواحل الهايتية) في ثلاثة أيام متتالية لتحفيز وضع البيض: أولا، إعداد اثنين من تركيزات حل قوات حرس السواحل الهايتية. Resuspend 10،000 U من مسحوق مجفف بالتجميد قوات حرس السواحل الهايتية في 10 مل العقيمة، منزوع الأيونات H 2 O لتركيز النهائي من 1،000 U / مل. ثم، تمييع 1 مل من 1،000 U / مل حل قوات حرس السواحل الهايتية في 9 مل H 2 O لتركيز النهائي من 100 U / مل. تخزين كل الحلول في 4 درجات مئوية.
  2. في يوم 1، وإعداد 4-6 الضفادع لوضع البيض عن طريق حقن مع قوات حرس السواحل الهايتية بين 2:00 حتي 15:00. حقن كل ضفدع في كيس الليمفاوية الظهرية قرب مجرور مع 0.2 مل 100 U / مل حل قوات حرس السواحل الهايتية. وجود الضفادع سريع خلال حقنتين اللاحقة تقليل كمية النفايات الحالي ضفدع خلال وضع البيض، ولكن هو اختياري.
  3. في يوم 2، وضخ نفس الضفادعمع 0.2 مل 100 U / مل حل قوات حرس السواحل الهايتية بين 2:00 حتي 03:00.
  4. في اليوم 3، وضخ نفس الضفادع مع 0.2 مل 1،000 U / مل حل قوات حرس السواحل الهايتية، بين 7:00 حتي 10:00. إعداد الضفادع لوضع البيض: ملء دلو من البلاستيك 6 الكوارت مع tankwater الطازجة، إضافة الضفادع والمكان في الظلام في 25 ° C. بعد هذه الحقن، وسوف تبدأ وضع البيض بعد 4 ساعات وسوف تكون كاملة بنسبة 7 ساعة. يجب أن الضفادع تضع بيضها في بيئة التي يتم الاحتفاظ بحد أدنى 25 درجة مئوية.
  5. جعل استخراج الحلول والمعدات لديهم استعداد على الفور قبل جمع البيض.

20X MMR: 100 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.8، 2 مم EDTA الرقم الهيدروجيني 7.8، 2 M كلوريد الصوديوم، و 40 ملي بوكل، 20 ملي MgCl 2 و 40 مم CaCl 2. الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. تحضير 1 لتر من 1X MMR قبل فقط لاستخراج التحضير.

XB 10X: 100 HEPES ملي، pH7.7، و 10 ملي MgCl 2، 1 مم CaCl 2، 1 M بوكل؛ 500 ملي السكروز. الأوتوكلاف وتخزينها في 4 درجات مئوية. تحضير 1 لتر من 1X XB يأوست قبل لاستخراج التحضير. حل Dejelly: تحضير 250 مل 3٪ حل السيستين في منزوع الأيونات H 2 O ودرجة الحموضة إلى 7،8-8،0 مع 10 N هيدروكسيد الصوديوم. إعداد مسبق فقط لاستخراج التحضير.

CSF-XB: تأخذ 200 مل من 1X XB وإضافة 2 مل 0.5 M EGTA درجة الحموضة 7.7 و 200 ميكرولتر 1 M MgCl 2. إعداد مسبق فقط لاستخراج التحضير.

CSF-XB +: تأخذ 50 مل من CSF-XB وإضافة 50 ميكرولتر من LPC (10 ملغ / مل لكل سهم من Leupeptin، Pepstatin، وChymostatin في DMSO). إضافة 50 ميكرولتر مثبط حركة الخلايا D (10 ملغ / مل في DMSO). إعداد مسبق فقط لاستخراج التحضير.

إعداد محلول الجيلاتين 0.2٪ في منزوع الأيونات H 2 O، والموجات الدقيقة إلى حل وتصفية تعقيم. تخزين في درجة حرارة الغرفة.

احتياطي 2 بيكمان 2 × ½ بوصة أنابيب نابذة فائقة السرعة.

إعداد اثنين من 15 مل أنابيب الطرد المركزي الزجاج جولة القاع مع 0.5 مل من H 2 O في كل لتخفيفمنبذة فائقة أنبوب.

جعل النار مصقول الزجاج ماصات باستور. المفاجئة نهاية الخروج من 5 ¾ الماصات الزجاج بوصة لفضح فتحة واسعة، وتعرض للهب لضمان سلاسة جديدة غيض ماصة عرضة للخطر.

  1. إعداد 500 مل دورق زجاجي لتخزين البيض بنسبة يحوم حل الجيلاتين 0.2٪ في جميع أنحاء لمعطف جدران الدورق. تجاهل حل الجيلاتين من الدورق بعد الاستعمال.
  2. جمع البيض من دلو من البلاستيك المستخدمة لوضع الموارد البشرية 6-7 بعد الحقن الثالثة في اليوم 3. إذا رغبت في ذلك، الضغط بلطف كل ضفدع مرة واحدة للحصول على أي البيض المتبقية. غسل البيض مرة واحدة مع tankwater الطازجة ونقل إلى 500 مل دورق زجاج المغلفة مع محلول الجيلاتين 0.2٪.

2. إعداد مستخلصات من X. بيض مداري

جميع خطوات إعداد مستخلص لا يمكن أن يؤديها في درجة حرارة الغرفة، ما يقرب من 25 درجة مئوية. في جميع أنحاء يغسل، فمن المهم للحفاظ على البيضق المغمورة تحت السائل بحيث تظل رطبة. التعرض للهواء يمكن أن يسبب البيض هربا من الاعتقال دورة الخلية أو ليز.

  1. صب قدر tankwater ممكن مع الاحتفاظ السائل بما فيه الكفاية للحفاظ على البيض الرطب. إمالة دورق يحتوي على البيض إلى الجانب وإضافة ~ 300 مل 1X MMR ببطء على جدار الدورق، يتم تصغير بحيث الانفعالات المادية للبيض. اسمحوا البيض يستقر، ثم صب قبالة الحطام المحتوية طاف. X. البيض مداري هي مفتول العضلات في هذه الخطوة، لذلك يتم إزالة البيض المنشط بعد dejellying. تكرار لما مجموعه ثلاثة يغسل 1X MMR.
  2. Dejelly البيض. صب قبالة بقدر MMR ممكن، وإضافة نصف من الحل dejelly. دوامة مستمر لمدة حوالي 5 دقائق. سوف حل المعاطف هلام تكون مرئية في طاف بعد بضع دقائق. صب قبالة وإضافة محلول dejelly المتبقية. الاستمرار في دوامة مستمرة حتى البيض حزمة بإحكام جدا وجميع المشرق مع القطب بهم نباتية (القطبمع صبغة بيضاء) نحو الجزء السفلي من الطبق. صب قبالة بسرعة بقدر حل dejelly ممكن. مرة واحدة يتم dejellied البيض فهي حساسة جدا للتلاعب الميكانيكية.
  3. بعناية إضافة XB إلى البيض. في أول غسل XB، وإزالة البيض الذي قد نجا اعتقال CSF عن طريق إزالة هي lysed، منتفخ، والأبيض، وpseudocleavage البيض. تنشيط اكس. البيض مداري تميل إلى تسوية في مركز أعلى، وذلك باستخدام ماصة نقل البلاستيك لسحب هذه المغادرة. أيضا إزالة قطعة من الجلد والنفايات ضفدع. غسل البيض ما مجموعه ثلاث مرات مع ~ 300 مل 1X حل XB، يحوم بلطف البيض بين يغسل والسماح لهم ليستقر على الجزء السفلي من الكأس. كما كان من قبل، صب قدر من كل محلول الغسيل ممكن مع الحفاظ البيض الرطب.
  4. غسل البيض مرتين مع CSF-XB وصب.
  5. إضافة CSF-XB + إلى البيض. باستخدام المعالجة الجيلاتين النار مصقول ماصة باستير، والبيض إلى أنابيب الطرد المركزي فائقة نقل مع CSF-XB +، مع الحرص على عدم فضح هGGS إلى الهواء. مكان داخل 15 مل أنابيب الطرد المركزي الزجاج مع وسادة الماء.
  6. تدور البيض في جهاز للطرد المركزي السريرية في 200 x ج لمدة 1 دقيقة، وزيادة السرعة إلى 800 XG وتدور لمدة 30 ثانية.
  7. استخدام الشافطة لإزالة أكبر قدر ممكن من العازلة البيض. وينبغي أن تكون جافة تقريبا على القمة. التحرك بسرعة البيض إلى Sorvall RC-6 أجهزة الطرد المركزي مجهزة الدوار HB-6 (أو ما يعادلها)، وتدور 17،000 XG لمدة 15 دقيقة عند 20 درجة مئوية.
  8. إزالة طبقة حشوية الصفراء بين الصباغ وطبقات الدهون باستخدام إبرة قياس 18 تعلق على حقنة 1 مل. ثقب الجانب من الأنبوب وسحب برميل حقنة ببطء للحصول على طبقة استخراج حشوية. تجنب حبيبات الصباغ قدر الإمكان.
  9. نقل السيتوبلازم إلى أنبوب تنبيذ فائق جديدة. فمن الطبيعي لاستخراج لتظهر غائم قليلا في هذه الخطوة. مكان داخل 15 مل زجاج أنبوب الطرد المركزي مع وسادة الماء. تدور مرة أخرى 17،000 XG لمدة 10 دقيقة عند 20 درجة مئوية. كرر تحويلةraction مع إبرة قياس 18.
  10. نقل السيتوبلازم إلى 1.5 مل microfuge أنبوب. تقدير حجم استخراج وتمييع مثبط حركة الخلايا D وLPC 1:1،000 في استخراج. تخلط جيدا مع 1 مل ماصة، pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات دون إدخال فقاعات الهواء. A العائد نموذجي من مستعمرة الضفدع صحية ما يقرب من 300-500 ميكرولتر من استخراج / ضفدع. للحفاظ على أقصى قدر من النشاط، فمن الضروري لتخزين استخراج وتأدية معالجات تجريبية في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية).

3. تنقية تاكسول استقرت ميكروتثبول من X. مداري استخراج

  1. إضافة إلى تاكسول 100-200 قسامة ميكرولتر من استخراج في تركيز النهائي من 10 ميكرومتر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. لتفاعلات السيطرة، وعلاج ما يعادل حجم استخراج مع المخدرات نوكودازول أنيبيب destablilzing (10 ميكرومتر). الاحتياطي 100 ميكرولتر من استخراج علاج للتحليل.
  2. تمييع المعالجة المخدرات فياستخراج مع 10 مجلدات BRB-80 (80 ملم أنابيب درجة الحموضة 6.8، 1 ملم MgCl 2، 1 ملم EGTA) + 30٪ الجلسرين. تجميع 14 مل أنابيب البولي بروبلين جولة القاع تحتوي على 10 مل من BRB-80 + 60٪ سادة الجلسرين. باستخدام مجموعة واسعة تتحمل ماصة، طبقة استخراج رد فعل المعاملة المخدرات بلطف على أعلى من BRB-80 + 60٪ سادة الجلسرين. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في XG 17،000 عند 20 درجة مئوية في Sorvall RC-6 أجهزة الطرد المركزي مجهزة الدوار HB-6 (أو ما يعادلها)، ومحولات أنبوب.
  3. نضح طاف تحتوي على مواد unsedimented استخراج، وغسل واجهة مرتين مع منزوع الأيونات H 2 O. نضح حجم وسادة المتبقية ببطء، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه مثل هلام يحتوي على الأنابيب الدقيقة، والبروتينات أنيبيب المرتبطة بها، والرنا أنيبيب المرتبطة في العينة المعالجة تاكسول. لا يحتوي على عينة المعالجة نوكودازول المواد مرئية. Resuspend الكرية في 1 مل TRIzol والمضي قدما مع تعليمات الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الريبي. Untrاستخراج عتيد (تصل إلى 100 ميكرولتر) يمكن معلق مباشرة في 1 مل TRIzol.
  4. هناك الآن مجموعات المتاحة تجاريا لإعداد مكتبات Transcriptome على مناسبة لRNA وما يليها. ويمكن شراء هذه من خلال http://www.illumina.com/ و http://www.454.com/ .

Representative Results

لتحديد X. النصوص مداري المرتبطة الأنابيب الدقيقة، ونحن نستعد لاستخراج عصاري خلوي من بويضة غير مخصبة اعتقل في الطورية من الانقسام الاختزالي الثاني (CSF). العلاج من هذا المقتطف مع التاكسول يسمح تشكيل الأنابيب الدقيقة المستقرة التي يمكن تنقية بالترسيب من خلال وسادة الجلسرين (الشكل 1A). يؤكد تحليل هلام Coomassie أن الرواسب α / β-تويولين في الطريقة التي تعتمد على التاكسول، وتمثل الأنواع الرئيسية بروتين تعافى في هذه الاستعدادات (1B الشكل). انخفاض مستويات البروتينات الأخرى موجودة أيضا في التاكسول بيليه، ولكن ليس في التحضيرات تعامل مع أنيبيب depolymerizing المخدرات نوكودازول، مشيرا إلى أن البروتينات في جزء التاكسول المنتسبين على وجه التحديد مع الأنابيب الدقيقة (خرائط).

يتم استخدام اجيلنت Bioanalyzer لدراسة تكوين الحمض النووي الريبي العامة في جميع X. الكسور استخراج مداري (الشكل 1C X. المورق البيض استخراج 5،21. تتبع خط الإسقاط هلام يكشف إشارة مرنا هو أقل بشكل ملحوظ في أنيبيب التي تحتوي على التاكسول بيليه، وعلى الأخص في منطقة المهاجرة فوق 28S الرنا الريباسي، مشيرا إلى أن مجموعة فرعية من mRNAs وcosediment مع الأنابيب الدقيقة في X. مداري. عزل الحمض النووي الريبي في هذه الطريقة هو مناسبة لتجارب الحمض النووي الريبي وما يليها باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا.

الشكل 1
الشكل 1. تنقية MT-RNA لRNA وما يليها. (A) نظام تنقية لعزل MT-RNA. ويتم حصاد البيض من الإناث X. ترومانالضفادع picalis. بعد إعداد استخراج حشوية، يضاف التاكسول للحث على البلمرة أنيبيب. ويجري تنقية الأنابيب الدقيقة وMT-RNA بالترسيب من خلال وسادة الجلسرين. (ب) تحليل Coomassie هلام من البروتينات المعزولة باستخدام نظام الموصوفة في الفقرة (أ). مجموع CSF استخراج مقارنة مع البروتينات الرسوبية في وجود التاكسول أو نوكودازول. (C) Bioanalyzer هلام تحليل الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام نظام الموصوفة في الفقرة (أ). عزل الحمض النووي الريبي من CSF استخراج مقارنة الحمض النووي الريبي الرسوبية في وجود التاكسول أو نوكودازول. وتظهر كل من الإسقاط جل وآثار خط. أعيد طبعها بإذن من شارب، وآخرون، (2011). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Discussion

في هذا التقرير وصفناها طريقة بسيطة لإنتاج البيض مقتطفات CSF اعتقال من X. مداري 19 واستخدام هذا المقتطف لدراسة الرنا أنيبيب المرتبطة 7. الإجراء الأساسية لإنتاج البيض مقتطفات CSF اعتقال من X. مداري هو نفس المستخدمة لX. المورق مع عدد قليل من الاختلافات الرئيسية. واحد من الجوانب الأكثر تحديا للعمل مع X. الضفادع مداري هو الحصول على البيض جودة عالية بما يكفي لجعل مقتطف مع التنوي أنيبيب أو نشاط الجمعية المغزل مماثلة لX. المورق البيض مقتطفات. لتحقيق ظروف وضع البيض الأمثل في حين منع انزلاق من الانقسام الاختزالي الثاني الخلية اعتقال دورة، والفاصل الزمني بين الحقن الهرمونية للX. مداري أقصر من تلك المستخدمة لX. المورق، وتوقيت الحقن من قوات حرس السواحل الهايتية الثالث إلى بداية وضع البيض هي أيضا أقصر من ذلك بكثير. مع X. المورق توقيت من حقن قوات حرس السواحل الهايتية إلى Tانه بداية وضع البيض هو من النوع الذي هو مريحة وفعالة للحصول على البيض لتكون وضعت بين عشية وضحاها إلى المخزن المؤقت. ومع ذلك، ونظرا للوقت أقصر بين قوات حرس السواحل الهايتية الحقن ووضع البيض مع X. مداري فمن الضروري في كثير من الأحيان للتعبير عن البيض من الضفادع يدويا. آخر فرق كبير بين صنع استخراج البيض من اثنين من الضفادع المختلفة هو الخطوة dejellying. مع X. المورق البيض هي من الضخامة بحيث أنه من السهل تحديد متى قد حلت معطف هلام من خلال مراقبة عن كثب كيف متباعدة البيض في الدورق. كما يبدأ رد الفعل dejellying، البيض تبدأ في حزمة أكثر كثافة. ومع ذلك، X. البيض مداري هي أصغر بكثير، وأنه يمكن أن يكون من الصعب جدا تحديد متى قد حلت معطف هلام من قبل البيض التعبئة الكثافة وحدها. لقد وجدنا أن الأسلوب الأكثر موثوقية لتحديد متى قد حلت معطف هلام هو رصد التوجه للحيوان (أسود) ونباتية (أبيض) القطبين. عندما تكون جميع نباتية أقطاب أوريوالأنف والحنجرة نحو الجزء السفلي من الكأس تمت إزالة هلام معطف بما فيه الكفاية للمضي قدما في استخراج. وأخيرا، في حين اكس. ويمكن تخزين البيض المورق استخراج في درجات حرارة باردة (4-12 درجة مئوية) لاحظنا أن فمن الأهمية بمكان للحفاظ على X. مداري استخراج البيض في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) أثناء إعداد والتلاعب التجريبية للحفاظ على النشاط البيوكيميائية. بسبب الاختلافات في سهولة الاستخدام ونحن نفضل استخدام X. الضفادع المورق لإنتاج استخراج البيض. ومع ذلك، لإجراء التجارب التي تتطلب أو يتم تسهيل من قبل كائن حي مع التسلسل الجينوم، X. مداري هو نظام بديل ممتاز.

الطريقة التي وصفناها في هذا التقرير يستخدم التاكسول كعامل أنيبيب استقرار للحث على البلمرة أنيبيب. لقد اخترنا هذا الأسلوب لأن التاكسول هو عامل استقرار قوي أنيبيب التي تسهل العزلة على نطاق واسع من المنقى الأنابيب الدقيقة. طريقة الفي وصفنا يمكن المرجح أن تتحسن من خلال مقارنة البروتينات والرنا المرتبطة الأنابيب الدقيقة باستخدام طرق بديلة البلمرة أنيبيب. ويمكن أن تشمل بدائل البلمرة باستخدام GTP التي يسببها البلمرة (وهي تقنية كلاسيكية)، 22 أو باستخدام ران-GTP باعتبارها polymerizer أنيبيب لتقليد الأنابيب الدقيقة التي تحدثها الجمعية المغزل يحركها لونين 23. وأخيرا، واستخدام تنقيته نوى الحيوانات المنوية للحث على أن البلمرة أنيبيب تكون أقرب تقليد لأنواع من الأنابيب الدقيقة التي يتم الأنوية أثناء الانقسام (الجسيم المركزي، لونين، والحيز الحركي بوساطة). المآخذ على هذه المصادر البديلة من التنوي أنيبيب هي أن وكلاء nucleating إليها ليست متوفرة بسهولة كما التاكسول وأنها لا nucleate أو استقرار الأنابيب الدقيقة بكفاءة كما التاكسول. ولذلك، فإن كل من هذه الأساليب تكون أكثر صعوبة لاستخدامها لتنقية واسعة النطاق. ميزة مقارنة العديد من أنواع مختلفة من nucleators أنيبيبغير أنه قد يكون من الممكن تحديد البروتينات و / أو الرنا التي هي محددة لكل مسار من التنوي أنيبيب.

الطريقة التي وصفناها هنا يستفيد من مقتطفات حشوية من البرمائيات. ومع ذلك، يمكن توسيع نطاق هذا النهج لاستخدام نظام مقتطف من الكائنات الحية الأخرى. وقد وصفت مقتطفات الإنقسامية من الخلايا البشرية متزامنة زراعة الأنسجة 24 أن ألخص بأمانة جوانب كثيرة من الجمعية أنيبيب. لقد استخدمت بنجاح هذه المقتطفات لتحديد الرنا أنيبيب المرتبطة من خلايا هيلا 5. وقد وصفت مخططات مماثلة تنقية أنيبيب لكثير من الكائنات الحية المختلفة 25،26، على الرغم من أن لم يتم فحص أنيبيب الرنا المرتبطة بها. النهج الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم مع أي كائن التي يمكن أن تنتج استخراج حشوية مركزة قادرة على nucleating الأنابيب الدقيقة.

وأخيرا، على الرغم من أن النهج الذي نحن ديالكاتب هنا يناقش تنقية الأنابيب الدقيقة والبروتينات والرنا المرتبطة بها، يمكن لهذا النهج تعميمها على الهياكل التحت خلوية أخرى. في حين لم يتم تحديد mRNAs ومعظم المترجمة باستخدام أساليب الكيمياء الحيوية التطورات الحديثة في الحمض النووي والتكنولوجيات تسلسل الحمض النووي الريبي جعل هذا النهج وسيلة جذابة لتحديد الرنا المترجمة. في هذا النهج أي بنية التحت خلوية أو الجنين الفرعية من الفائدة يمكن أن تكون معزولة أو تنقيته. ثم يمكن التعرف على البروتينات والرنا المرتبطة بها على نطاق واسع الجينوم. ويمكن بعد ذلك مقارنة الرنا RNA إلى المحتوى من الخلية الكلي أو الجنين لتحديد الرنا المترجمة المخصب. هذا النهج يمكن أن تستخدم مع البيض كله (الحيوانية والنباتية الانفصال، على غرار النهج الذي حدد أول الرنا المترجمة في القيطم 27)، الأكتين الرنا المرتبطة بها، الرنا ER-المرتبطة بها، الرنا الميتوكوندريا المرتبطة، أو إلى أي هيكل التحت خلوية التي يمكن أن يمكن تنقيته مع الرنا المرتبطة سليمة. على أساسعملنا على الحمض النووي الريبي أنيبيب المرتبطة نتوقع أن هذا من شأنه أن يكون وسيلة ممتازة لاكتشاف البروتينات الجديدة التي وظيفة في مكان معين. وعلاوة على ذلك، سوف تحديد موقع ومدى جميع الرنا المترجمة توفير نظرة ثاقبة كيفية استخدام خلايا الأجنة وتوطين مرنا للسيطرة على التعبير الجيني.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Xenopus tropicalis NASCO LM00823MX
human Chorionic Gonadotropin Sigma-Aldrich CG10
HEPES Sigma-Aldrich H4034
EDTA Sigma-Aldrich E5134
NaCl Sigma-Aldrich S3014
KCl Sigma-Aldrich P9541
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
CaCl2 Sigma-Aldrich C8106
sucrose Sigma-Aldrich S0389
NaOH Sigma-Aldrich S5881
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Leupeptin Sigma-Aldrich L9783
Pepstatin Sigma-Aldrich P5318
Chymostatin Sigma-Aldrich C7268
Cytochalasin D Sigma-Aldrich C8273
Gelatin, porcine skin Sigma-Aldrich G1890
PIPES Sigma-Aldrich P6757
Taxol Sigma-Aldrich T7191
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
Trizol Invitrogen 15596-026
L-Cysteine, free base USB Corporation 14030
Cichlid Lake Salt Seachem 47894
Marine salt Seachem SC7111
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6014
EQUIPMENT
1 ml syringes BD Biosciences 309659
18 gauge needles BD Biosciences 305195
30 gauge needles BD Biosciences 305106
Rubbermaid Plastic bucket Amazon 6306
Beckman Polyallomer 2 x ½ inch Ultracentrifuge tubes Beckman 326819
15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes Fisher Scientific 45500-15
Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes Kimble-Chase 45550-15
5 ¾ inch glass Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20A
14 ml polypropylene round-bottom tube BD Biosciences 352059
Sorvall HB-6 rotor Thermo Scientific 11860
Sorvall RC-6 centrifuge Thermo Scientific 46910

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martin, K. C., Ephrussi, A. mRNA localization: gene expression in the spatial dimension. Cell. 136, 719-730 (2009).
  2. Besse, F., Ephrussi, A. Translational control of localized mRNAs: restricting protein synthesis in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 971-980 (2008).
  3. Lawrence, J. B., Singer, R. H. Intracellular localization of messenger RNAs for cytoskeletal proteins. Cell. 45, 407-415 (1986).
  4. Mingle, L. A., et al. Localization of all seven messenger RNAs for the actin-polymerization nucleator Arp2/3 complex in the protrusions of fibroblasts. J. Cell Sci. 118, 2425-2433 (2005).
  5. Blower, M. D., Feric, E., Weis, K., Heald, R. Genome-wide analysis demonstrates conserved localization of messenger RNAs to mitotic microtubules. J. Cell Biol. 179, 1365-1373 (2007).
  6. Eliscovich, C., Peset, I., Vernos, I., Mendez, R. Spindle-localized CPE-mediated translation controls meiotic chromosome segregation. Nat. Cell Biol. 10, 858-865 (2008).
  7. Sharp, J. A., Plant, J. J., Ohsumi, T. K., Borowsky, M., Blower, M. D. Functional analysis of the microtubule-interacting transcriptome. Mol. Biol Cell. 22, 4312-4323 (2011).
  8. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  9. Mili, S., Moissoglu, K., Macara, I. G. Genome-wide screen reveals APC-associated RNAs enriched in cell protrusions. Nature. 453, 115-119 (2008).
  10. Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
  11. Desai, A., Murray, A., Mitchison, T. J., Walczak, C. E. The use of Xenopus egg extracts to study mitotic spindle assembly and function in vitro. Methods Cell Biol. 61, 385-412 (1999).
  12. Gache, V., Waridel, P., Luche, S., Shevchenko, A., Popov, A. V. Purification and mass spectrometry identification of microtubule-binding proteins from Xenopus egg extracts. Methods Mol. Med. 137, 29-43 (2007).
  13. Gache, V., et al. Xenopus meiotic microtubule-associated interactome. PLoS One. 5, e9248 (2010).
  14. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).
  15. Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).
  16. Cross, M., Powers, M. In vitro nuclear assembly using fractionated Xenopus egg extracts. J. Vis. Exp. (19), e908 (2008).
  17. Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
  18. Hellsten, U. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328, 633-636 (2010).
  19. Brown, K. S. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
  20. Godfrey, E. W., Sanders, G. E. Effect of water hardness on oocyte quality and embryo development in the African clawed frog (Xenopus laevis). Comp. Med. 54, 170-175 (2004).
  21. Groisman, I., et al. CPEB, maskin, and cyclin B1 mRNA at the mitotic apparatus: implications for local translational control of cell division. Cell. 103, 435-447 (2000).
  22. Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Methods. 38, 29-34 (2006).
  23. Kalab, P., Pu, R. T., Dasso, M. The ran GTPase regulates mitotic spindle assembly. Curr. Biol. 9, 481-484 (1999).
  24. Gaglio, T., Saredi, A., Compton, D. A. NuMA is required for the organization of microtubules into aster-like mitotic arrays. J. Cell Biol. 131, 693-708 (1995).
  25. Hughes, J. R., et al. A microtubule interactome: complexes with roles in cell cycle and mitosis. PLoS Biol. 6, e98 (2008).
  26. Suprenant, K. A., Tempero, L. B., Hammer, L. E. Association of ribosomes with in vitro assembled microtubules. Cell Motil. Cytoskeleton. 14, 401-415 (1002).
  27. Rebagliati, M. R., Weeks, D. L., Harvey, R. P., Melton, D. A. Identification and cloning of localized maternal RNAs from Xenopus eggs. Cell. 42, 769-777 (1985).

Tags

علم الأحياء الجزيئية، العدد 76، علم الوراثة، علم الأحياء التنموي، الكيمياء الحيوية، الهندسة الحيوية، RNA التحميل، آخر بعد النسخي،
إنتاج<em&gt; القيطم مداري</em&gt; البيض مقتطفات من التعرف على الرنا أنيبيب المرتبطة بها
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharp, J. A., Blower, M. D.… More

Sharp, J. A., Blower, M. D. Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs. J. Vis. Exp. (76), e50434, doi:10.3791/50434 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter