Tilberedning av en Kv Channel i lipid membraner for strukturelle og funksjonelle studier

Summary

Prosedyrer for fullstendig rekonstituering av en prototyp spenningsstyrte kaliumkanaler inn i lipidmembraner, er beskrevet. De rekonstituerte kanaler er egnet for biokjemiske analyser, elektriske innspillinger, ligand screening og elektron krystallografisk studier. Disse metodene kan ha generell anvendelse til de strukturelle og funksjonelle studier av andre membranproteiner.

Abstract

For å studere lipid og protein i en reductionistic måte, er det nødvendig å innlemme membran proteiner inn i membraner av veldefinerte lipidsammensetning. Vi studerer lipid-avhengige gating effekter i en prototype spenning-gated potassium (Kv) kanal, og har jobbet ut detaljerte prosedyrer for å gjeninnføre kanalene i ulike membransystemer. Våre reconstitution prosedyrer tar hensyn til både vaskemiddel-indusert fusjon av blemmer og sammensmeltingen av protein / vaskemiddel micelles med lipid / vaskemiddel blandet micelles samt betydningen av å nå en likevekt fordeling av lipider mellom protein / vaskemiddel / lipid og vaskemiddel / lipid blandet micelles. Våre data antyder at innsetting av kanalene i de lipidvesikler er forholdsvis slumpmessig i orienteringer, og rekonstituering virkningsgrad er så høy at ingen påviselige protein aggregater ble observert i eksperimenter fraksjonering. Vi har benyttet rekonstituererd kanaler for å bestemme de konformasjonsforandringer statene kanalene i ulike lipider, registrere elektriske aktiviteter av et lite antall kanaler som inngår i planar lipid bilayers, skjerm for eksteriør-spesifikke ligander fra en fag-displayed peptid bibliotek og støtte veksten av 2D krystaller av kanalene i membranene. Tilberedning beskrevet her kan tilpasses for å studere andre membran proteiner i lipid bilayers, spesielt for undersøkelse av lipid effekter på eukaryote spenningsstyrte ionekanaler.

Introduction

Celler utveksle materiale og informasjon med sine omgivelser gjennom funksjonene til spesifikke membran proteiner ^en. Membran proteiner i cellemembraner fungere som pumper, kanaler, reseptorer, intramembrane enzymer, linkers og strukturelle støttespillere over membraner. Mutasjoner som påvirker membran proteiner har vært knyttet til mange menneskelige sykdommer. Faktisk har mange membranproteiner vært de primære stoff mål fordi de er viktige og lett tilgjengelig i cellemembraner. Det er derfor svært viktig å forstå strukturen og funksjonen til ulike membran proteiner i membraner, og gjøre det mulig å utvikle nye metoder for å lindre skadevirkningene fra den muterte proteiner i menneskelige sykdommer.

Lipider surround alle membran proteiner integrert i ^{to bilayers, tre.} I eukaryote membraner, vises de forskjellige ulike typer av lipider kjent for å være organisert i mikroområder ^{4, 5.}Mange membranproteiner ble vist å bli distribuert blant disse mikroområder samt voluminøse fluidfase av membranene ^{3, 6.} Mekanismen bak organiseringen av mikroområder og levering av membran proteiner inn i dem og den fysiologiske betydningen av slike utdelinger er helt klart viktig, men er fortsatt dårlig forstått. En stor tekniske problemer i å studere lipid effekter på membran proteiner er pålitelig rekonstituering av biokjemisk renset membran proteiner i membraner av godt kontrollert lipid sammensetning, slik at nesten alle rekonstituert proteiner er funksjonelle ^7. I de siste årene, har vi utviklet metoder for å rekonstruere prototypen spenning gated kalium kanal fra A. pernix (KvAP) i ulike membransystemer for strukturelle og funksjonelle studier ^8-10. Dataene fra andre og oss sammen viste at lipidene er sannsynligvis en determinant i konformasjonsendringer i spennings-sensingdomener av et spenningsstyrte ionekanal og kan forme strukturer av noen av disse kanalene ^11. I den neste, vil vi gi en detaljert beskrivelse av våre metoder og vil tilby kritiske tekniske tips som trolig vil sikre en vellykket reproduksjon av våre resultater, samt utvidelse av våre metoder til studier av andre membran proteiner.

Protocol

En. Uttrykk og rensing av KvAP Channel (Figur 1)

1. Forberedelse Work - Dag 0
   1. Skyll glass kolber for bakteriekultur med avionisert vann (Dih ₂ O) og MilliQ H ₂ O (MQH ₂ O) for å fjerne spor av vaskemiddel fra generell oppvask.
   2. Autoklav 1000 ml LB-medium i 2,8 l Erlenmeyer-kolber (totalt to-liters kultur som et eksempel her). Lav hardhet av vannet ble funnet å være viktig for en vellykket kultur av de transformerte bakterier.
   3. Autoklav 100 ml LB medium i 500 ml kolber
   4. Transform 60 ul av XL1-Blå kompetente celler med 200 ng av pQE60 plasmid som inneholder genet for KvAP med trombin cutting nettsted og en hans ₆ tag på sitt C-terminalen, plate bakteriene på to LB-agar plater som inneholder 100 mikrogram / ml ampicillin, og inkubere dem i 14-16 timer i en 37 ° C inkubator.
2. Expression of KvAP - Dag 1
   1. Kontroller appearance av de bakterielle kolonier på platene etter inkubasjon over natten. Koloniene var vanligvis bare ca 0,2-0,5 mm i diameter, og det var mange av dem. Vi ønsker ikke platene som bærer på store kolonier omgitt av en rekke satellitt-kolonier.
   2. Legg 5,0 ml LB medium til hver LB-agar plate inkubert over natten og skrap av koloniene. Overfør bakterier suspensjon i 100 ml LB-medium autoklavert i en 500 ml kolbe. Legg ampicillin til en endelig konsentrasjon på 100 pg / ml, inkuberes den lille kulturen for ~ 1 t ved 37 ° C eller inntil OD600 oppnår 0,60.
   3. I mellomtiden sted to flasker med 1,0 L medium i en 37 ° C rysteinkubator å varme opp mediet, og forberede 20 ml bacl ₂ (1,0 M, 10 mM endelig konsentrasjon på hver 1,0 L kultur), 2,0 ml 0,4 M IPTG (isopropyl-tio-β-galaktosid) og 2,0 ml 100 mg / ml ampicillin lager i vann.
   4. Når den lille kulturen er klar, tilsett 10 ml bacl _2, ble 1,0 ml ampiciLLIN lager, og 50 ml av små kultur fra trinn 1.2.2 til pre-varmet LB media. OD600 bør være rundt 0,05. Se for mulig ventet på grunn av høy hardhet av vannet og de mot-ioner i LB-medium. Ba ^{2 +} er kjent for å binde til den pore domene av den kaliumkanal-og blokkerer den ioniske strøm, og dette reduserer toksisiteten av det høye ekspresjonsnivåer av kanalene til bakterier.
   5. Ta OD600 hver time før den når 0,70, og hvert kvarter til den når 0,8 til 0,9. I vår set-up, tar det vanligvis ~ 5 hr å nå 0,8.
   6. Legg 0,40 mM IPTG for å starte den induserte ekspresjon av kanal protein, og inkubere kulturen for en annen 4,0 time ved 37 ° C med 225 rpm risting.
   7. Høste bakteriene i 1,0 liter Sentrifugeflasker ved sentrifugering ved 4000 x g, 4,0 ° C i 15 min. Dekanter supernatanten så mye som mulig i en avfallsbeholder begerglass, tilsett 10 ml 1,0 M Na-fosfat-buffer for å utfelle alt Ba ^{2 +,} og deretter legge til enlite volum av blekemiddel til å drepe bakterier. Hold høstet bakterier i sentrifuger flasker begravet i isen i en 4,0 ° C kaldt rom over natten.
3. Rensing av KvAP protein (dag 2 og 3, figur 1B)
   1. Resuspender bakteriene pellet i 15 ml IMAC lysis buffer per 1,0 L kultur. Legg ~ 1,0 U DNase I, og tre protease-inhibitorer av leupeptin, pepstatin og aprotinin A ved 1,0 ug / ml. Det totale volumet for to-liters kultur var ~ 35 ml.
   2. Sonicate resuspendert bakterier i et metall-beger begravet i is i et totalt 10 min av PÅ-tid. Den mikrosonde sonicator ble satt i en 5 sek ON / 10 sek OFF syklus med en 40% utgangseffekt i en 4,0 ° C kaldt rom. Utgangen effektinnstilling ble bestemt empirisk, slik at de fleste av bakterier ble lysert uten mye oppvarming i løsning.
   3. Legg 0,50 g N-decyl-β-D-maltoside (DM; Sol-Grade fra Anatrace) i tørt pulver til den sonikeres cellelysat og inkubere blandingen i tre0,5 time ved romtemperatur (RT) med konstant horisontal risting (~ 100 rpm) for å trekke ut så mye kanalproteiner som mulig. Det er viktig å sørge for at vaskemiddel pulveret er helt oppløst i løpet av 30-50 min.
   4. Etter ekstraksjon vaskemiddel, fjerne celleavfall fra lysatet ved sentrifugering ved 20.000 xg i 30 min ved RT. Mens du venter på sentrifugering til slutt, forberede en His-tag-basert LC (lav-væskekromatografi) kolonnen som beskrevet i boks 1.
   5. Laste supernatanten fra trinn 1.3.4 på ferdigpakket IMAC (I mmobilized m etal ion en ffinity hromatography c) kolonnen med en strømningshastighet på 1-2 ml / min, som er drevet av en peristaltisk pumpe. Alternativt kan det ekstraheres His-merket protein kan bli inkubert med IMAC harpiks for satsvis binding.
   6. Vask IMAC harpiks ved å kjøre 5 sjiktvolumer av IMAC vask buffer, og 10 sjiktvolumer av IMAC vask buffeh pluss 20 mM imidazol. En in-line UV skjermen brukes til å sørge for at tøyet er rent.
   7. Eluer KvAP protein ved å bruke IMAC elueringsbuffer inneholder 300 mM imidazol. Mesteparten av det bundne KvAP elueres innen 6 ml elueringsbuffer gjennom kolonnen. Legg trombin (1,0 U per 2-3 mg protein) inn i de sammenslåtte eluering fraksjoner og ruge proteinet overnatter på benken for å spalte Hans ₆ tag.
   8. På neste dag, konsentrere den trombin-fordøyd proteinløsningen i en Centricon (MWCO = 30K) ned til 600 pl for størrelsesutelukkelses-FPLC (rask protein-væskekromatografi). Under sentrifugering, bland prøven hvert femte minutt for å minimere protein aggregering. Som proteinet konsentreres, blir den lokale konsentrasjon på membranfilteret høyere, og at det enkelte ganger er klare hvite utfellinger som ellers kunne tette til filteret membran. Også den høye konsentrasjonen av proteiner (~ 5-10 mg / ml) i bunnen av konsentratoren fører til en pannenish farge og miksing virkelig bidrar til å minimere prøvetap.
   9. Kjør konsentrert KvAP gjennom en Superdex 200 kolonne som er pre-likevekt med FPLC likevektsbufferen. Vanligvis er det meste av den tetramere KvAP kanal i DM elueres med en oppholdstid volum på 12,3 ml. Det er en liten etterfølgende hale på rundt 13,6 ml, som har en liten mengde av monomerisk KvAP. Tomrommet i kolonnen brukte vi står til 7,0 ml, og vanligvis prøven gir opphav til en liten topp ved tomrommet, som inneholder meget lite KvAP protein. Den imidazol kommer ved slutten av elueringen (~ 24 ml). Pool fraksjonene som inneholder KvAP tetramers sammen og konsentrerer protein løsning ned til 0,5 ml. Bestem konsentrasjonen i prøven ved bruk av estimert ekstinksjonskoeffisient (~ 1.2e-5,0 M ^-1 cm ^-1, som ble beregnet basert på antallet av aromatiske rester) av KvAP ved 280 nm [Ref ^12; URL: http:// web.expasyorg / protparam /].
      Ved romtemperatur er det rensede KvAP i DM stabilt i minst en uke uten betydelig tap av protein. Ved 4 ° C, kan det vare enda lenger. Aldri fryse proteinet i vaskemidler. Det kan anbefales å proteinet i DM ved 4 ° C, og proteinet i β-og ved romtemperatur. Men vi normalt ikke vent, og gå videre til tilberedning steg umiddelbart etter at proteiner er klar.
   10. Assay prøvene i en 12% reduserende SDS-PAGE-gel.
       Prøvene fra hvert trinn som er beskrevet ovenfor ble fremstilt ved blanding av 20 mikroliter av prøvene med 5 x SDS-prøvebuffer (tabell 3 for bufferne) supplert med 1,0% β-ME. Prøvene ble ikke kokte. Etter geler var klar, prøvene vanligvis hadde vært i SDS-buffer i mer enn 10 min ved romtemperatur. Etter at gelen ble kjørt, og farget med Coomassie blå, viste villtype KvAP opp som et enkelt bånd på rundt 26 kDa (figur 1B

2. Ion Channel Rekonstituering

2.1. Liposompreparatet og vaskemiddel-indusert fusjon av vesikler

Før lipidpreparatet, vaske en 14 ml engangs-glass reagensrør, et skrulokk glassrør, og en 250 pl glassprøyte med kloroform. Hell ut ~ 10 ml kloroform inn i testtube.

1. Utarbeidelse av Palmitoyl-oleoyl-phosphatidyl-ethanolamine (POPE) og palmitoyl-oleoyl-phosphatidyl-glycerol (POPG) liposomer.
   1. Overfør 3,75 mg POPE og 1,25 mg av POPG (POPE: POPG = 03:01 vektforhold) i kloroform i den på forhånd renset med skrulokk glassrør og tørk lipidene under en kontinuerlig strøm av argongass. Når ingen synlig kloroform er igjen, tørk det lipid ytterligere henhold rom vakuum i en time.
   2. Legg 440 mL av lav salt-buffer (10 mM HEPES, pH 7.4) Eller vann inn i det tørkede lipidet og vortex-røret for å hydrat lipidene. Lipid suspensjonen ser hvitaktig og grumset.
   3. Sonicate lipid suspensjon i en iskald bad sonicator til vesikkelen løsningen blir gjennomskinnelig (OD410 <0,2).
      Typisk for 10 mg / ml POPE / POPG oppløsning i vann eller i lav saltbuffer, drives vi den sonicator med 30 sek 30 sek PÅ og AV (på is) for totalt 15-20 min. På grunn av varmen som dannes under sonikering, er det tilrådelig å legge til 1,0 mM DTT i lipidsystemet løsning for å minimalisere oksidasjon og til å kjøle ned på vann-bad av den sonicator til 10 ° C eller under. Den endelige OD410 er lipid-avhengig. For visse lipider kan det være svært vanskelig å oppnå en så lav OD. Hvis det skjer, vi vanligvis bruker vaskemidler til å fullstendig oppløse lipider og tillate lange inkubasjonstiden for å nå god fordeling av lipider rundt protein-holdige micelles (se neste).
      En høykapasitets bad sonicator er viktig i ordeh å nå OD410 <0,2. Vi har brukt et system laget av Laboratory rekvisita Co, Inc (Model # G112SPIG, Hicksville, NY). Nøkkelen for riktig sonikator av vesiklene er å sørge for at den resonante sentrum i midten av røret har sterk vibrasjon. Vibrasjonen varierer med vannvolumet og dermed kan justeres. Også er det empirisk funnet at øket viskositeten av vann ved tilsetning av en liten mengde glycerol kan øke effekten av sonikering.
      Alternativt har vi funnet at ved hjelp av en mikrosonde sonikator i kontakt med lipid suspensjon i et plast-eller metallrør kan gi de samme resultatene. Den mikrosonde må rengjøres og bare spissen er dyppe i lipid løsning. Fordi lipidpartikler er brutt opp i små stykker på overflaten av mikrosonde, er det meget viktig å holde prøven avkjølt, og har noen reduksjonsmidler rundt for å hindre oksydasjon av de umettede lipider.
      Under Cryo-elektron microscopy, de fleste av sonicated unilamillære vesikler er 30-50 nm i diameter (data ikke vist). Krumningen av de små SUVer er så høy at en liten forstyrrelse er nok til å fremkalle den pulserende blanding av disse blemmer i større funn som er 80-200 nm i diameter (se neste).
   4. Tilsett 50 pl av 3,0 M KCl, og 10 ul av 0,50 M DM til blandingen slik at det endelige lipid suspensjon har 300 mM KCl og 10 mM DM. Inkuber løsning med horisontal rotasjon i 2 timer ved RT for å danne lipid / vaskemiddel blandede miceller. Etter inkuberingen, bør suspensjonen bli litt turbide (figur 2A), som er på grunn av vaskemiddel-indusert fusjon av de små unilamellære vesikler.
   5. Når proteinet er konsentrert til mer enn 2,0 mg / ml, tilsett 0,50 mg KvAP protein, 50 pl 3,0 M KCl, 16 pl av 0,50 M DM lager i vann, og 10 mM HEPES, pH 7,4 til lipid / vaskemiddel til blandingen lage 1 ml sluttvolum. Den endelige lipid: protein vekt er 10:1og sluttkonsentrasjonen av DM er 18 mm (figur 2A). Inkuber protein / lipid / vaskemiddel-blanding i glassrør med horisontal rotasjon i ytterligere 2 timer.
      Utvelgelsen av vaskemiddelkonsentrasjonen er styrt av vaskemiddel-indusert vesikkelfusjon og vesikkel solubilisering ^13.. Når vesiklene er dannet av sterk sonikering, er deres midlere diameter i området 30-50 nm henhold EM. Disse vesikler har meget lav spredning ved 410 nm. Ved lave konsentrasjoner, er vaskemidler først satt inn i vesikler, destabilisere blemmer, og indusere fusjon av vaskemiddel-mettet vesikler (OD410 går opp, se figur 2A). Vesikkelfusjon fører til økningen av OD410 nm. For 10 mg / ml POPE / POPG blemmer, de OD410 topper på rundt 15 mm DM. Når flere vaskemidler er innført, vesikler begynner å bryte i stykker og lipider blir partisjonert i vaskemiddel / lipid blandet micellene. Denne sistnevnte prosess er ledsaget avreduksjon av OD410 ned til et endelig lavt nivå (<0,1).
      På grunn av de aktive fusjonsproteiner hendelser i den stigende fasen av den optiske tettheten på grunn av vaskemiddel-indusert fusjon av små blærer, er det høyst sannsynlig at protein / vaskemiddel miceller vil være aktivt smeltet med vaskemiddel-mettede lipidvesikler. Det er grunnen bak valget av 18 mM DM på tidspunktet for utarbeidelsen av protein / lipid / vaskemiddel blandingen. Dersom vaskemiddel blir konsentrert ved mer enn fire folder, til mengden av DM behov justeres slik at den endelige konsentrasjonen er fortsatt rundt 18-20 mm. Når protein avkastningen er svært lav, er det vanskelig å vurdere hvor mye konsentrerte vaskemidler er i prøven, vil vi i stedet blande protein med fullt oppløseliggjort lipider, og bruke den fullt likevekt blanding for tilberedning. I våre hender, hvis det ikke nok tid ble tillatt for å nå en god likevekt fordeling av lipidene mellom protein-holdige og protein-frie miceller, det reconstitution effektivitet falt betydelig. Vi vanligvis teste effektiviteten rekonstituering av to eksperimenter: 1) undersøke den ko-migrering av proteinet med vesikkel-fraksjonen i en sukrose-tetthetsgradient-ultrasentrifugering, 2) ekstrakt av proteiner ut av de rekonstituerte vesikler, og fraksjonerer dem i en gel- filtrering kolonne for å finne hvor mye protein (KvAP i vårt tilfelle) gjenstår å være tetramerisk. Minimum tid av inkubering av protein / lipid / vaskemidler er et par timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 grader.
      For en ny membran protein som er stabil i et annet vaskemiddel, er det første trinnet for å finne ut av oppløsningen egenskapen av lipidene ved et slikt vaskemiddel, lik det som er vist i figur 2A. Deretter er det lurt å starte med PC-ekstrakter, som for eksempel E. coli polar ekstrakt-PC, soyabønne PC-ekstrakt etc, slik at hvis den spesifikke protein trenger visse fosfolipid for dens funksjon, kan den allerede inkludert i utsuted Lipidblandingen.
2. Fremstilling av KvAP i blanding med vaskemiddel-oppløseliggjort 1,2-dioleoyl-3-trimetylammonium-propan (DOTAP) eller 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-succinat (DOGS) --- et eksempel på lipid fullstendig solubilisering for tilberedning
   1. Den lipidpreparatet er den samme som for POPE / POPG vesikler. Sonication av hydrert lipider i små unilamillære blemmer trenger lengre tid (vanligvis 45-60 min) enn for pave / POPG lipider (vanligvis 5-10 min). Hundene blemmer kan sakte smelter sammen med hverandre og danne små fet dråper.
      På grunn av vanskeligheter med å lage høykvalitets SUV ut av DOTAP og HUNDER reproduserbart, vi vanligvis oppløse disse to lipider helt før blanding med proteiner.
   2. For å solubilisere den DOTAP eller hunder fullstendig, blir de sonicated vesikler blandet med 10 mM DM og 40 mM N-oktyl-β-D-glukosid (β-OG). Den lipid / vaskemiddel Blandingen inkuberes over natten (> 15 timer)ved romtemperatur, og blandingen ikke bør ha noen små partikler eller dråper. Men i stedet er det ganske klart. Unnlatelse av å oppnå fullstendig likevekt i dette trinnet vil føre til dannelsen av en betydelig brøkdel av multilamellære vesikler.
   3. Bland KvAP protein med vaskemiddel-solubi DOTAP eller hunder i et protein: lipidforhold som er mindre enn eller lik 1:10. Proteinet / vaskemiddel / lipid-blandingen får inkuberes ved romtemperatur i 2-3 timer med ende-over-ende rotasjon.

2.2. Fjerning av vaskemidler til å danne proteoliposomes

1. Dialyse --- langsom fjerning av detergenter, for eksempel DM og β-OG, som har relativt høye kritiske micelle-konsentrasjoner (CMC ≥ 1,0 mM)
   Forbered 2-liters dialysebuffer (tabell 3) for hver 1,0 ml blanding.
   Skjær ut en passende lengde på dialyse tubing (MWCO = 10K, 0,70 cm bred), og vaske den med DI vann. Det er viktig å sjekke og gjøresikker på at det ikke er noen lekkasje i slangen. For følsomme prøver, kan slangen bli først behandles med en buffer av 10 mM Tris-HCl pH8.0 og 2,0 mM EDTA, og deretter renses i kokende vann i 3-5 min. Slangen blir deretter fastklemt ved en ende og skylt med dialysebuffer.
   Laste protein-lipid-vaskemiddel blandingen i en dialyse tubing. Spenn begge endene av slangen med minimal plass igjen over løsningen. Sett den lastede motsvarende rør i dialysebuffer, og bruke en omrørt plate så at slangen roterer langsomt i oppløsning. Endre dialysebuffer gang hver 8. time. Etter den første bufferen endring, bør oppløsningen bli uklar hvis protein-lipid-vaskemiddel blanding var helt klart. Dersom dialyse er for høy, kan det være fast hvitt bunnfall på bunnen av dialyse-ledningen. Det anbefales at ved tidspunktet for buffer endring, bør slangen gnis, og vendes flere ganger. Etter fem endringer av dialysebuffer, vesikler er vanligvis klar.
   Vi sjekker restbeløpet av vaskemidler ved å skyte blemmer på lipidbilag. Når det er fortsatt betydelig mengde vaskemidler igjen, blir bilaget brutt nesten umiddelbart. Det er også mulig å måle den gjenværende vaskemiddel ved hjelp av kolorimetrisk metode eller ved måling av overflatespenningen i vesikkelsuspensjon.
2. Bruk av isopor perler for å fjerne vaskemidler som har lav CMC
   I mange tilfeller må vi bruke lave CMC vaskemidler, for eksempel DDM (CMC ~ 0,17 mM i vann). Perler med ørsmå porer hydrofobe brukes til å fjerne disse vaskemidler ^14..
   1. Fremstilling av kulene. Vekt ut 0,5 g tørre perler og sette dem inn i en 50 ml Corning rør, tilsett 20 ml metanol, sonicate løsningen i et badekar sonicator for 5 min for å fjerne fanget bobler, spinner ned perlene på 5000 rpm i 5 min, og deretter dekanter mest metanol. Gjenta vask med etanol og MilliQ vann. De vaskede perlene blir lagret i 20% etanol ved 4 ° C, ogmå endres til en vaskemiddel-fri buffer før bruk.
   2. Anslår mengden av vaske-og rengjøringsmidler i protein / lipid / vaskemiddel blanding som skal behandles, og beregner mengden av perler som trengs for å fjerne vaskemidler. For DDM og DM, er bindingskapasiteten omtrent 100 mg perler for 10 mg vaskemidler. De våte kuler uten overskytende vann blir veid ut, og tilsettes direkte til den proteinblandingen. Minst 15-20 minutter er nødvendig for at perlene bli fullt ut effektiv, og den reduksjon av vaskemiddelkonsentrasjonen når et stabilt nivå ^14-16. For å fjerne 8,7 mg av DDM (dodecyl-maltoside) i 1,0 ml oppløsning, ekvivalent med ~ 18 mm, totalt 87 mg av polystyren-perler, for eksempel Bio-Beads SM2, brukes i fem like store fraksjoner. Bland protein / lipid / vaskemiddel blanding med hver fraksjon etter 20-30 min med kontinuerlig ende-over-ende rotasjon ved romtemperatur, spinne ned perlene, Overfør supernatanten til det neste fraksjon av perler, og gjenta til slutten.
      Når vaskemiddel konsentrasjonerasjon når sitt CMC, vi forsettlig forlenge tidsperioden for at en time, slik at den lille mengden av vaskemidler i løsningen vil lette fusjon av små blærer i store.
   3. For å fjerne spor mengde vaskemidler etter siste trinnet, legger 35 mg Bio-Rad SM2 perler og ruge med blemmer for 4 hr.
      Når fremgangsmåten for fjerning av detergent som beskrevet ovenfor, skal anvendes i et nytt protein, er det generelt tilrådelig å starte med protein / lipid-forhold (vekt / vekt) av ~ 1:10. Lipid / vaskemiddel blandingen må være nøye forberedt slik at nok vaskemidler er lagt til helt oppløse lipider (Figur 2A). Det er viktig å inkubere lipid-vaskemiddel blanding i mer enn 2 timer ved romtemperatur (med 1-2 mM DTT) med konstant risting (400 rpm) eller ende-over-ende rotasjon. Når proteinet blandes med lipider, bør protein / lipid / vaskemiddel blandingen inkuberes lenge nok (over natten om proteinet er stable) på enten romtemperatur eller i et kaldt rom, slik at fordelingen av vaskemidler og lipider mellom protein-holdige micelles og protein-free miceller er relativt jevn. I tillegg, hvis hurtig fjerning av vaske-og rengjøringsmidler ved hjelp BioBeads anvendes, er det viktig å finne ut den vaskemiddel-bindingskapasiteten av kulene. Den langsomme fjerning av vaskemidler sikrer sannsynlig at proteinene vil ha nok lipider for å opprettholde sin integritet og bli satt inn relativt betydelig blemmer.

2.3. Lagring av den proteoliposome og kvalitetskontrollen

1. Når blemmer er klar, forberede dem til 50 pl aliquoter og flash-fryse alikvotene ved direkte stuper i flytende nitrogen. De frosne vesikler blir deretter lagret i en -80 ° C fryser. For biokjemiske analyser, har vi ikke bruker frosne blemmer fordi fryse-tine syklus noen ganger ble funnet å introdusere gjenstander inn i vår cys-spesifikk reaksjon. For elektriske opptaks bruker vi bare vesikler som er lagret i -80 ° C i mindre enn 6 måneder.
2. Floatation av vesikler i et tettshetsgradient (figur 2B)
   1. Last 50 ul av vesikkelsuspensjon på toppen av lagene av sukrose gradient inneholdende 0,3 ml hver av 10, 35 og 55% sukrose laget i 10 mM HEPES og sentrifugering ved 200.000 g i 4 timer ved 4 ° C. Akselerere og retardere langsomt for å unngå avbrudd i grenseflaten mellom lagene.
   2. Samle 100 ul fraksjoner fra topp til bunn og kjøre dem på en ikke-reduserende SDS-PAGE (figur 2B). Den KvAP er farget godt med Coomassie blå slik at et band av 0,5-1,0 mikrogram protein er godt synlig. Den KvAP protein bør finnes i skjæringspunktet mellom 10 og 35% sukrose. Ingen tunge aggregater av proteiner er sett ved den høye tetthet område, noe som indikerer at nesten alle proteiner er i membranene.
3. Sjekk riktig konformasjon av KvAP kanal i blemmer. <br /> Våre tidligere data fastslått at en enkelt cystein mutant (L125C/C247S) KvAP, når den skal integreres i bilayers, er fullt begravet i membraner, og kan ikke nås av cystein-spesifikke reagenser ^åtte. Tilberedning prosedyrer ble testet med denne mutant kanal, og sjekket av en Cys-spesifikt reagens, MTS-PEG5000. Modifikasjonen på L125C med 1,0 mikrometer MTS reagens ved romtemperatur introduserer en 5kDa skift til KvAP bandet i en nonreducing SDS-PAGE gel. Vellykket gjennomføring av våre rekonstitueringsprosesser prosedyrer bør føre til noen merkbar reaksjon for de L125C muterte kanaler i fosfolipid membraner, noe som tyder nesten komplett innsetting av alle kanaler i bilayers. Som en positiv kontroll av reaksjonen er 5,0 mM DM innført for å gjengi nesten alle L125C rester i den muterte kanaler tilgjengelige for MTS reagens.
   Alternativt kan en pore-bindende toksin, slik som chrybdotoxin, anvendes for å telle de tetramere kanaler. Et antistoffbasert binding somsier (se boks 2, hvor Fv er utarbeidet som en bekreftelse-spesifikk ligand for KvAP) kan brukes til å kvantifisere de tilgjengelige bindende områder i de rekonstituerte blemmer. Disse bindingsanalysene kan så sammenlignes med en kvantitativ analyse som måler det totale protein for å finne ut hvor stor andel av de rekonstituerte kanalene er tetramerer og hvilken fraksjon av proteinet har de spennings-sensor åre (S3/S4 av den spenningssensor) ordentlig foldet.
   For andre proteiner som skal rekonstitueres, er det tilrådelig å innføre en kvantitativ metode for å vurdere hvor stor andel av de rekonstituerte proteiner er brettet skikkelig. Nøye funksjonell undersøkelse er dermed en forutsetning for å utvikle god kvalitetskontroll for vellykket tilberedning.

3. Søknader for rekonstituert Channel-holdige Blemmer

3.1. Funksjonell studie av ionekanalsykdommer aktiviteter i svart lipid membraner.

Fremstilling av Needed materialer.

1. Lipidpreparatet
   1. Renhet en glass reagensrør, en amber ampulle med Teflon-dukket skrukork, og et sett med glassprøyter med kloroform. Tørk rav ampulle under en strøm av argongass.
   2. Overføring 0,75 mg og 0,25 mg POPE POPG i kloroform i rav ampulle og fordamp kloroform med argongass.
   3. Vask de tørkede lipidene med 0,20 ml pentan, og tørke helt å fjerne gjenværende kloroform. Til slutt oppløse lipider i 50 ul dekan. Lipidene i dekan (20 mg / ml) vil bli benyttet for å male et lipidbilag over en 150-250 mikron hull (figur 3B) boret i tynnet parti på en side av en eksperimentell bilagsmembran kopp (figur 3A).
2. Løsning forberedelse
   1. Intracellulær løsning (trans): 10 mM HEPES / KOH, pH 7,4, 15 mM KCl
   2. Ekstracellulær løsning (cis): 10 mM HEPES / KOH, pH 7,4, 150 mM KCl
   3. Salt bro: Bend glass kapillærerinn i U-formede broer, og fylle dem med 1,0% smeltet agar oppløst i ekstracellulær løsning.
      Det osmotiske gradient etablert mellom trans-og cis-løsninger ble funnet å være den viktigste drivkraften for vesikkelfusjon på lipidbilag ^17.. For negativt ladede lipider, ble 15 mM CaCl ₂ eller positivt ladede poly-arginin peptider funnet å være i stand til å indusere fusjon arrangementer. Fusogenic lipider, slik som DOTAP og hunder, osv., kan bli introdusert i lipidvesikler, slik at sjansen for fusjonsproteiner hendelser er høyere.

Elektriske opptak fra KvAP kanaler i lipid bilayers

1. Pre-male det runde hull (diameter 0,25 mm ~) som er boret på den sylindriske overflate av dobbeltlaget koppen (figur 3B). Lipider overføres med en kapillær stampe som er laget i laboratoriet. Den runde hode i kapillarrøret stampe er polert og ikke riper i overflaten av koppen. The liten mengde lipider som føres med kapillær stampe er spredt rundt hullet i den kopp-dobbeltlag, og luft-tørket.
2. Vent i 1-2 min, slik at dekan vil fordampe fullstendig. Forsiktighet bør utvises for å unngå lipidoppløsningen fra å komme inn i hullet.
3. Sett koppen i opptaket kammer, og satt i salt broer og kobler elektrodene til de to sidene av opptaket cup (Figur 4A). Tilsett cis-og trans-løsning på de to sider av hullet. En osmotisk gradient blir etablert for å lette fusjon av vesiklene inn i lipidbilag.
4. Juster potensialet forskyvningen mellom to sider av koppen til ~ 0 (vanligvis <2 millivolt). Bruk kapillær stampe å overføre en liten mengde av lipid i blandingen dekan, og male lipidet over hullet inntil en dobbeltlag-membran-former. Dannelsen av dobbeltlaget detekteres ved å registrere sitansstrømmen under leveringen av en rampe puls.
5. Vent til membranentynner ut og blir relativt stabil. Vi venter til det ikke er mer endring i membranen kapasitans i 3-5 min.
   Den generelle tenke på den plane sjikts dannet over et stort hull er at selve midtre parti av membranen er nær være ~ 4,0 nm tykk som en vanlig-dobbeltlag, og membranen blir tykkere når det kommer i nærheten av kanten av hullet, hvor det er et ringformet rom rundt og mesteparten av oppløsningsmidlet er dekan ^{18, 19..} Det er uunngåelig at det er gjenværende dekan igjen i den sentrale delen dobbeltlag av membranen. Past estimering av volumforhold på n-dekan versus PC var 0,35 til 0,45 etter tynning av dobbeltlaget ^{18, 20-22.} EM undersøkelse av tynnet dobbeltsjiktdannende viste at det var linser av dekan klemt mellom de to flygeblader av et dobbeltlag ^22. Disse data antyder at membranproteiner satt inn i lipidbilagsmembraner eksistere sammen med små øyer (opp til 50 nm i diameter) av dekan. Den gjenværende dekan in bilaget minsker også den elektriske kapasiteten til konstant 0,4-0,5 mF / ² cm, som kan anvendes for å oppnå et grovt estimat av størrelsen på den tynnet dobbeltsjiktdannende basert på den målte kapasitans. En dobbeltlag av 100 pF kondensatoren kommer fra en sirkulær dobbeltlag-membran på ~ 180 mikrometer i diameter.
   For KvAP, gjorde den gjenværende dekan ikke svekke dens spenningsavhengige gating, selv om kanalen funksjonen ikke har blitt nøye undersøkt i en løsemiddelfri bilayer. Det samme syntes å være sant for de NaChBac kanaler og Kv1.2 kanaler satt inn i BLMs ^23. Det er fortsatt uklart om den betydelige venstre forskyvning av GV kurve målt fra Kv1.2 kanaler i dekan-lipidbilag forhold til kanaler i ubefruktede egg har noe å gjøre med den gjenværende decane ^23. Avhengig av lipider som benyttes til å danne dobbeltlag, kan mengden av rest-dekan i dobbeltlaget variere. For eksempel ble det rapportert at dannelsen av plane lipid MEMBRanes av MGDG (mono-galactosyl-diacylglycerol) krever dekan, muligens på grunn av sprekkene mellom den koniske MGDG blir fylt med dekan-molekyler. Enten den gjenværende dekan har effekt på proteinene som skal studeres er rent empirisk, og den eksperimentelle prøve er nødvendig for å finne ut om effekten er vesentlig eller ikke.
6. Så snart membranen blir stabil, skyter 0,5-1,0 mL kanal-holdige vesikler ved å posisjonere den fine enden av en P2-pipettespissen rett ovenfor hullet. De vesikler falle ned over hullet til bunnen av koppen.
   Under denne prosessen flere vesikler blir festet til membranen over hullet. Gitt tilstrekkelig tid er omlag smeltet inn i dobbeltlag delen slik at et lite antall kanaler KvAP er skikkelig satt inn i den plane dobbeltlag i den midtre delen av membranen. Både osmotisk gradient og elektrostatisk samhandling er viktige i fusjon av blemmer i lipid ^{17 bilayers, 24.}
7. For å testede KvAP kanaler i dobbeltlaget, er en kort puls på 80 mV levert fra holdepotensial på -80 mV. På grunn av den raske og langsomme inaktivering utvinning fra inaktivering, et langt intervall (~ 120 s for kanaler i PE / PG membraner) er angitt mellom to pulser. En typisk aktuelle opptaket fra kanalene i en pave / POPG membranen er vist i figur 3C. Dersom strømmen er liten, skyte flere vesikler. Når strømmen ser godt i størrelse, balansere ionekonsentrasjoner i løsningene på begge sider av membranen. Kanalene er klare for elektrofysiologiske eksperimenter.

3.2. Screening for eksteriør-spesifikke ligander mot kanaler i vesikler

1. Introduksjonen av phage-displayed bibliotek.
   Den fag-displayed 20-mer peptid bibliotek er til stede ved N-enden av de fem-kopier av PIII proteiner i den ene enden av trådformede bakteriofag fd-tet ^25. Biblioteket presenterer ca. 1 x 10 ⁸ avvikeskjellige typer tilfeldige 20-mer peptidsekvensene, ble og ber gitt til oss av Dr. Kathlynn Brown laboratorium ved UT Southwestern Medical Center ^26.. Den fag-infeksjon inn i E. coli K91 gjør de bakterier som er resistente 12 ug / ml tetracyklin.
   En detaljert prosedyre for bakteriekultur, har forsterkning og titering av phages og sekvensering av fag kolonier blitt beskrevet av McGuire, et al. ^26. Vi vil gi en kort beskrivelse av de grunnleggende operasjonene i neste avsnitt. Leserne kan finne flere detaljer i McGuire papir. Vi vil i stedet fokusere på isolering av spesifikke kloner som binder tett til ionekanaler rekonstituert i vesikler (Figur 4A).
   Den grunnleggende ideen bak skjermen vårt er at phages bundet til de rekonstituerte kanalene spesifikt kan trekkes ned med vesiklene. Det bundne fage kan forsterkes og testet mot kanalene i lipidmembraner. Vår studie avde konformasjonsendringer i KvAP spennings-sensorer i forskjellige lipidmembraner ⁸ viser at det er mulig å beholde de spenningssensorer i enten "aktivert" eller "hvile" fremkommer ved utkobling av lipidene fra vanlige fosfolipider til de som ikke inneholder fosfater i headgroup regionene (DOTAP og hunder i våre eksperimenter). Disse to lipid-målbevisste conformations benyttes i vår screening av eksteriør-spesifikke ligander. Fag-bibliotek vil først bli mettet av kanalene i fosfolipid vesikler (negativ seleksjon) før han ble valgt for trange permer til kanalene i DOTAP og hunder membraner (positiv seleksjon).
2. Grunnleggende prosedyrer bak fag utvalg
   Vekst av K91 bakterier i LB medium: The doblingstid av bakteriene er ca 20 min ved 37 ° C med 200 rpm risting.
   Forsterkning av bibliotek: Bland fag løsning med bakterier K91 på OD0.4. Etter 15 min inkubasjon ved 37° C, blandinger er spredt jevnt på -9,5 x 9,5 tommer ² agarplater inneholder 12 mikrogram / ​​ml tetracyclin, hindrer bruk av store plater dominans av kultur av bakterier som har høyere vekst-rate. Når mangfoldet av biblioteket er mindre, er 10-cm petriskåler brukes til utvelgelse og småskala forsterkning.
   Storskala amplifikasjon av individuelle kloner: Inokuler en liten aliquot av fager (~ 100 millioner) i 250 ml LB pluss 5 mM MgSO ₄ og 12 ug / ml tetracyklin, vokse over natten ved 37 ° C. Samle celler ved 6000 rpm spin i 10 min. Samle supernatanten og legge inn det 0.2 vol / vol utfellingen buffer (2,5 M NaCl, 20% PEG8000). Etter inkubering på is i 1,0 timer, sentrifugeres oppløsningen ved 17 000 xg i 30 minutter for å pelletere alle fager. Fjern all supernatant, tilsett 1,0 ml PBS, inkuberes på is i 30 minutter, forsiktig resuspender pelleten (ingen virvling). Overfør suspensjonen til et nytt rør, og sentrifuger ved 14,000 opm i 2 min. Overfør supernatanten til et annet rør, og inkuberes i 65 ° C vannbad i 15 minutter for å drepe alle bakterier. Sentrifuger rør i 2 min ved 13 000 rpm. Kasser pelleten, alikvoter og lagre phage-løsning ved -80 ° C.
3. Panorering av phages mot KvAP kanaler i lipidvesiklene.
   1. De peptid-vis phages trenger å bli amplifisert og titered før våre eksperimenter, slik at antallet fager pr volumenhet er kjent. KvAP ble rekonstruert i POPE / POPG (03:01) pluss 0,50% Biotin-DOPE blemmer som negativ kontroll, og inn i HUNDER: biotin-DOPE (199:1; samme ble gjort for DOTAP blemmer) brukes som utvalget målet. Den endelige konsentrasjonen av KvAP i vesikler er 0,50 mg / ml, og lipidene er 5,0 mg / ml. Den panorering buffer inneholdt 500 mM KCl, 100 mMHEPES / KOH pH 7,4, og 0,10 mg / ml BSA.
      For første løp, var ~ 10 ¹⁰ phages (100 eksemplarer for hver type) fortynnet til 0,050 ml LB medium. For de påfølgende panorering trinn, den starting phage ble justert til å være innenfor ¹⁰ juni-10 august.
   2. Negativ seleksjon:
      Inkuber de fortynnede phages i 50 pl LB med 100 ul NeutrAvidin agarosekuler (i stand til binding 1-2 mg biotinylert BSA pr ml harpiks, Pierce) i 1,0 ml buffer panning. Etter 10 min inkubasjon skille perlene ved å spinne dem ved 100 xg for 1,0 min. Gjenta dette trinn to ganger for å fjerne eventuelle fager som binder direkte til kulene.
      Bland venstre-over phages fra forrige trinn med 50 mL tomme blærer (POPE / POPG pluss 0,5% biotin-DOPE) som ikke inneholder noen proteiner. Legg 100 mL NeutrAvidin Perler som har blitt vasket med panorering buffer til fag-vesikkelen blanding. Etter rotering av blandingen ved romtemperatur i 5 min, fjerne perlene ved 100 x g sentrifugering i 30 sek. Dette trinnet gjentas for tomme blærer av HUNDER: biotin-DOPE (199:1) samt for KvAP kanaler i POPE / POPG blemmer (med 0,5% biotin-DOPE). Supernatanten etter disse behandlingene contains fullt ryddet phages. Etter de to første skjermen sykluser, kan preclearance utføres bare mot KvAP i POPE / POPG blemmer.
   3. Positiv utvelgelse
      Inkuber fullt ryddet phages med KvAP kanaler i HUNDER: biotin-DOPE (199:1) vesikler (det samme for DOTAP blemmer) i nærvær av 100 ul NeutrAvidin perler ved romtemperatur i 10 min. Bring volumet av blandingen til 15 ml ved hjelp av panorering buffer før sentrifugering ved 100 xg i 10 min. Samle perler, og vask dem tre ganger med 45 ml panorering buffer.
   4. Resuspender perlene i 500 pl LB-medium inneholdende 5,0 ug / ml biotin, og inkubere blandingen ved romtemperatur i to timer for å slippe ut noe av de bundne fager fra NeutrAvidin, som har lavere affinitet enn native biotin. Separer kulene ved 100 x g sentrifugering i ett minutt. Samle supernatanten og perlene i to forskjellige rør for titering.
   5. Å forsterke de valgte phages, mix 200 pl av supernatanten eller de resuspenderte perlene i det siste trinnet med 500 mL K91 bakteriekultur (OD600 ~ 0,4-0,6, kultivert ~ 4 timer før den brukes). Etter inkubering ved 37 ° C i 15 minutter, ble platen 50 mL av hver på tetracyklin-plater for natten kultur.
      I de første to skjermen sykluser (figur 4A) og samle alle 500 mL supernatant og perlene fra siste trinn, blande dem med 5 ml bakteriekultur, og platen dem i 9,5 tommer firkantet platene for å utvinne og forsterke alle phage kolonier . Dette trinn er viktig for å få de fager som gjør at bakteriene vokse langsommere enn andre.
   6. De kolonier fra platene er forsterket og titered før den neste syklus av panorering og seleksjon (se McGuire et al., ^26).
   7. Undersøke aktivitetene til de positivt utvalgte phages på kanaler.
      Etter 10-12 runder med valg, teste den totale forsterkede phages på KvAP kanaler i lipid bilayers laget av Paven / POPG. Hvis det er en betydelig andel av positive kloner, bør de valgte phages på 100-500 nM blokkere en betydelig andel av kanaler i bilaget (Figur 4B) som vi skulle velge mot kanaler stabilisert i hviletilstand. De positive data tyder på at det er kloner som vil vise sterke binding til kanalene i hviletilstand. Etter 16 runder med valg, plukke 50 positive kolonier for enkelt-koloni sekvensering. De identifiserte dominerende fag-kloner er valgt fra å sammenligne sekvensene, og forsterkes og testet mot kanalene i-dobbeltlag. Når de positive kloner er bekreftet, syntetisere peptider båret av sterke positive kloner og teste dem på kanalene i tillegg til å bekrefte sine konformasjon-spesifikke aktiviteter.

3.3. Krystallisering av KvAP kanaler i membraner for strukturbestemmelse ^27-29

1. Å stabilisere konformasjon aven kanal, en konformasjon-spesifikt bindemiddel til kanalen, 33H1 Fv protein, blir brukt til å danne KvAP / Fv kompleks. Utarbeidelsen av Fv protein er beskrevet i boks 2. Rense komplekset i en Superdex 200 kolonne. Komplekset elutes på rundt 11,4 ml i vårt system.
2. For det første skjermbildet, blande protein med DMPC eller POPC som er helt oppløst i DM eller β-OG. Den protein / lipid / vaskemiddel blandingen blandes i mer enn 15 timer for å nå en termodynamisk likevekt i fordelingen av de tre komponentene blant de blandede micellene. Vanligvis er vi først teste tre ulike lipid / protein forholdstall (LPR = 0,5, 1,5, 2,5) og tre forskjellige pH-verdier (6.0, 7.0 og 8.0). Dialysen bufferen inneholder 20 mM K-fosfat-buffer, 100 mM KCl, og 3,0 mM NaN3. Den dialysebuffer skiftes hver 2-3 dager. En liten alikvot av krystallene er tatt ut hver 2-3 dager for å undersøke dannelsen av vesikler og den mulige opptreden av krystallinske gitter.
   En tabloid listeav LPR g. pH-verdien blir brukt for å bestemme oppførselen av proteinet i de to forskjellige typer av lipider. Vi ønsker å få relativt stor størrelse (mer enn 150 nm) blemmer eller membran ark når dialyse prøvene blir undersøkt av negativ-flekken EM. En liten fast mønster i membraner antyder en hit og vil bli brukt til å veilede ytterligere optimalisering.
   Negative-flekken EM: Kobber nett belagt med karbon film (~ 3-5 nm tykk) er glow-sluppet ut i luften for å gjøre karbon overflate hydrofil. Et lite volum (2-3 mikroliter) av krystaller, suspensjon lastes inn i karbon-overflate, og inkubert i 0,5-1,0 min. Blot gitrene fra siden med en revet kant av et stykke Whatman # 4 filterpapir. Flip risten og inkuberes den for ~ 15 s på toppen av en dråpe av 150 mikroliter farging løsning (2,0% PTA / KOH, pH 8,0 i vann pluss 0,5% trehalose, eller 6,0% ammonium-molybdat / KOH, pH6.3-6.5 , i vann pluss 0,5-1,0% trehalose). Blot så mye som mulig løsningen fra than grid overflaten, og la rutenettet for å tørke før du setter det inn i en TEM for undersøkelse. Bilder av vesikler iverksettes etter lavdose tilstand for å unngå skade av noe krystallinsk pakking av elektronene.
3. Skjermen blir da utvidet til å undersøke mindre trinn av LPR for å nå en riktig LPR. Hvis proteinene er egnet for krystallisering, kan et lite gitter av proteiner i membraner blir synlige. Rundt disse innledende forhold, ytterligere optimalisere krystallisering ved å variere salt typer og konsentrasjoner, temperatur, hastigheten og metoder for fjerning av vaskemiddel, toverdige kationer, rengjøringsmidler som brukes til å forberede proteiner, bunnfall, lipider komposisjon etc.
   De optimaliserte 2D krystaller av KvAPΔ36/Fv kompleks vokse til store ark som spenner fra noen få mikrometer til 20-30 my (Figur 5A). Under cryoEM forhold, krystaller viser tydelig firkantet gitter med åpenbare fire-fold symmetri som forventet fra de fire-fold symmetrisk chankanalene (figur 5B og C).

Representative Results

Den generelle strømmen av forsøkene for å rense KvAP kanal inn i biokjemisk homogenitet er beskrevet i figur 1A. Typiske eksempler under ekspresjon og rensing av proteinet er vist i SDS-PAGE-gel i figur 1B. Proteinet etter IMAC rensing er relativt ren. Utbyttet av KvAP kanalen er omtrent 1,0 mg / liter kultur.

Oppløsning av lipidvesiklene med vaskemidler må utarbeides for hvert par av lipid vs oppvaskmiddel. Av oppløsningen av små unilamillære vesikler fra pave / Pope av DM er presentert i figur 2A, resultatene fra vesikler flotasjon er vanligvis ganske grei. Typiske resultater i SDS-PAGE-analyse av fraksjonene fra gradientene er vist i figur 2B. I sukrose tettshetsgradient, de kanal-holdige POPE / POPG blemmer vanligvis er konsentrert i grenseflaten mellom 10% lag end det 35% lag. De KvAP-inneholdende DOTAP eller hunder vesikler er lettere og vanligvis ved grenseflaten mellom 5% og 10% (litt trengt inn i 10% lag). Hvis det er en betydelig andel av multilamellære blemmer, de vanligvis er hvitaktig og konsentrert under 10-35% grensesnittet. Vi har funnet at dette vanligvis skjer når protein-vaskemiddel-Lipidblandingen ble inkubert ikke lenge nok til å oppnå god fordeling av lipidene.

Elektriske opptak fra KvAP kanaler innlemmet i plane lipid-dobbeltlag er vist i figur 3.. Den typiske gjeldende kurven viser at det ved -80 mV, kanalene er stille. Bytte til +80 mV fører til en rask kapasitans peak (den ene skarpe på tidspunktet for veksling spenning). En langsom stigende fase av den strøm antyder at kanalene blir aktive og er i stand til å utføre utgående kalium-strøm. Etter at det meste av den stigende fase, begynner strøm å minke, et trinn navn inaktivering. Den inactivatipå tar et par hundre millisekunder å fullføre. Når spenningen er slått tilbake til -80 mV, er det en retur fase etter at den nedadgående kapasitans topp, noe som gjenspeiler lukking av de åpne kanaler, og kalles deaktiveringen (figur 3C).

I midten av phage-skjermen, testet vi aktiviteten av de forsterkede fager på de KvAP kanaler i dobbeltlag av POPE / POPG. Etter 12 valg sykluser, hemmet den forsterkede phages kanalen aktiviteter (Figur 4B, valgt fag). Men utgangsmaterialet phage-displayed bibliotek ikke viste noen effekt på kanalene (figur 4B, kontroll phage). Selv om aktiviteten av de utvalgte fager var ikke veldig høy fordi bare en lav konsentrasjon av de positive fager var rundt, det klare, reproduserbare effekter antydet at det er aktive, positive kloner som utviser høy-bindende affinitet, bør være selektivt anrikes i løpet av gjenværende screening cycles og en gang beriket, vil sannsynligvis ha sterke hemmende aktiviteter på kanaler i membraner.

I den tidlige fasen av screening 2D krystaller, så vi små innhegninger i mange små blærer. Med optimalisering, viste noen store ark opp med en masse små blærer rundt (Figur 5A). De cryoEM bilder av disse krystallene alltid viste en rekke lokale defekter (figur 5B), tyder på at ytterligere optimalisering er nødvendig for å oppnå bedre krystaller. Når krystallene ble godt optimalisert, viste de skarpe kantene, og dukket opp som enkle ark. Ved høy forstørrelse, er de enkelte enhetene klart mye bedre organisert (figur 5C).

Navn på Reagens / Material	Selskapet	Katalognummer	Kommentarer
Tryptone	RPI Corp	T60060
Gjærekstrakt	RPI Corp	Y20020
NaCl	Fisher	S271-3
Tris Base	RPI Corp	T60040
Kaliumklorid	Fisher	BP366-500
n-Dodecyl-β-D-maltoside	Affymetrix	D322S	Sol-klasse
n-oktyl-β-D-Glucoside	Affymetrix	O311	Ana-klasse
Aprotinin	RPI Corp	A20550-0.05
Leupeptin	RPI Corp	L22035-0.025
Pepstatin A	RPI Corp	P30100-0.025
PMSF	P7626
DNase I	Roche	13407000
Bio-Bead SM-2	Bio-Rad	152-3920
HEPES	RPI Corp	H75030
Paven	Avanti Polar Lipids	850757C
POPG	Avanti Polar Lipids	840457C
HUNDER	Avanti Polar Lipids	870314C
DMPC	Avanti Polar Lipids	850345C
Biotin-DOPE	Avanti Polar Lipids	870282C
DOTAP	Avanti Polar Lipids	890890C
NeutrAvidin agarose perler	Piercenet	29200
Dialyse Tubing	Spectrum Laboratories, Inc	132-570
Pentan	Fisher	R399-1
Dekan	TCI-Amerika	D0011
MTS-PEG5000	Toronto Kjemiske	M266501

Tabell 1. Liste av reagenser og materialer.

Bakteriekultur rysteinkubator Spektrofotometer Micro-probe sonicator Rocker Gulv-modell sentrifuge for å samle bakterier kultur og for å konsentrere prøver Tomme kolonner Superdex 200 kolonne koblet til en FPLC system

Tabell 2. Nødvendig utstyr.

Buffer navn	Innhold
IMAC lysebuffer	50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl
IMAC Wash buffer	50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, og 5,0 mM DM
IMAC elueringsbufferen	50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5,0 mM DM, og 300 mM imidazol
SDS-sample buffer (5X) (nonreducing)	60 mM Tris-HCl (pH 6,8), 25% glycerol, 2,0% SDS, 0,10% bromfenol blått. (1,0% 2-merkaptoetanol tilsatt for å gjøre den reduserende buffer).
Stabling gel buffer for SDS-PAGE (4X)	0,50 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,40% SDS
Oppløsning gel buffer for SDS-PAGE (4X)	1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,40% SDS
FPLC likevektsfukrasjon	20 mM Tris pH 8,0, 100 mM KCl, og 5,0 mM DM
Liposome dialyse	10 mM HEPES, 100 mM KCl

Tabell 3. Buffer navn og innhold.

Figur 1. Utarbeidelse av KvAP for tilberedning. A. Generelt arbeid flyt av protein uttrykk, rensing og tilberedning. B. Biokjemisk rensing av protein. Indusert kultur av E. coli XL1-blå uttrykke KvAP ble behandlet og KvAP renset. Tyve mikroliter av cellekulturer før (felt 1) eller etter (felt 2) induksjon, den vaskemiddel-ekstrakt (felt 3), gjennomstrømning fra IMAC kromatografi (søyle 4), to vasketrinnene (kolonnene 5,6), og 5,0 ug av total protein etter300 mM imidazol-eluering (søyle 7), og 5,0 ug av den KvAP tetramer ut av gelfiltrerings FPLC (søyle 8) ble utsatt for ikke-redusert 12% SDS-PAGE og Coomassie blå farging.

Figur 2. Tilberedning av KvAP i POPE / POPG blemmer. A. Vesikkelfusjon og oppløseliggjøring som en funksjon av vaskemiddelblandinger konsentrasjoner. Absorbans ved 410 nm ble brukt til å overvåke den lysspredende av vesikler (grunnlinje trekkes til ingen vaskemiddel fraksjon). Lipider (POPE / POPG 3:1) var 10 mg / ml. De små unilamellære vesikler etter sterke sonikering, blir monodispersed og har svak spredning på grunn av deres størrelse på 30-50 nm i diameter. Når vaskemidlene ble innført, fordeles mellom de løsningsfase og lipid membran-fasen. På grunn av den sterke krumning i den lille unilamellære blemmer, det innført vaskemidler trigger vesikkelfusjon og utgivelsen av kurvatur (derav lav overflaten potensiell energi). De kondenserte vesikler er større i størrelse og viser sterkere spredning ved 410 nm. Den stigende fasen av peak (grått område) gjenspeiler derfor vaskemiddel-indusert fusjon, et godt regime for protein micelle fusjon til blemmer. Konsentrasjonen av vaskemiddel (DM som et eksempel her) rett på absorpsjonstopp faktisk ble valgt på grunn av rekonstituering prosess. B. Femti mikroliter av rekonstituert KvAP vesikler (KvAP 0,5 mg / ml) ble fraskilt med sukrose-densitets-gradient. Prøver av 100 ul fraksjoner fra topp til bunn (1 ~ 9) av sukrosegradient ble analysert i en 12% reduksjon av SDS-PAGE. Gelen var Coomassie blå farget. Lane 3 inneholdt ~ 2 mikrogram KvAP.

/ Files/ftp_upload/50436/50436fig3.jpg "/>
Figur 3. Elektriske aktiviteten i KvAP kanal i rekonstituert bilayers. A. opptak oppsett inne i et Faraday-bur, en, to elektroder, to; trans side, 3; cis side, 4; saltbro. B. forstørret seksjon av tynnet parti i den ene side av to-lags koppen viser et hull ⁵ , som brukes for å lage membranene. C. elektriske aktiviteten i KvAP-kanalen som er smeltet inn i den svarte lipid membran ble registrert. Mens de blir holdt ved -80 mV, ble membranpotensialet pulses for å 80 mV etter 150 msek, og så endret tilbake til holdepotensial. Den ioniske strøm ble spilt inn i spenningen-klemme-modus bruker en Axopatch 200B forsterker.

Figur 4. Screening for conformation-spesifikke ligander fra en fag-vises bibliotek. A. Scheme bak screening mot ionekanaler rekonstituert i blemmer. De vesikler dopet med biotin-DOPE, og de kan trekkes ut av oppløsningen ved NeutrAvidin perlene. Denne konformasjon av den KvAP rennen styres av spesifikke fettsyrer. Negative valg mot perler, tomme blemmer og vesikler med kanaler i en annen bekreftelse gjort før phages inkuberes med kanaler i målet konformasjonsendring stat (i DOTAP eller HUNDER som et eksempel her). De valgte fager kan forsterkes og testet mot kanalene i dobbeltlag. B. Testing av de valgte phages i midten av skjermen. Elektriske aktiviteten KvAP i bilaget ved forskjellige tidspunkt etter tilsetning av de valgte fager: sort Trace - før tilsetningen, gul spor - 2 min etter; rød spor - 10 min etter at tilsetningen Topp: utgangs-phage bibliotek (totalt. ~ 10 ¹⁰ phages lagttil dobbeltlaget) ble testet på kanaler i dobbeltlaget, og ble funnet å ha ingen detekterbar aktivitet fordi hvert fag-klon har bare omtrent 100 kopier bunn:. valg Etter 12 sykluser, de fager var fremdeles en blanding av forskjellige kloner. Legge ca 10 ¹⁰ phages til kanalene i bilaget fører til klart hemming av aktiviteten på kanalen, noe som tyder på at det er positive kloner som skal ha høy affinitet. Klikk her for å se større figur .

Figur 5. Todimensjonal krystallisering av KvAP i membraner. A. Bilde av negativt farget ettlags 2D krystaller i midten av krystall optimalisering. Krystallene ble farget med 6,0% ammoniummolybdat, 6,4 pH pluss 0,50% trehalose. På grunn av det sukker, de noen ganger stablet opp med hverandre. Den sorte firkantet boks betegner et område som gir opphav til diffraksjonsmønsteret vist på høyre side med diffraksjon flekker kommer til ~ 20 A. B. CryoEM bilde av en 2D-krystaller fra en prøve lik den som brukes i (a). Prøven ble blandet med 3% trehalose og frosset ved direkte stuper, og avbildes under en cryoEM. Bildet ble innhentet på 50.000 x. Det var klart at det var lokale defekter i krystall pakking. C. CryoEM bilde av en ytterligere optimalisert krystall. Prøven ble innleiret i 0,75% tannin og 10% trehalose, og bildet ble tatt ved 50.000 X. De rette linjer og den tette pakking antydet at kanalene var godt organisert i denne type krystaller. De to svarte pilene markerer firkantet gitter.

Bokser:

Boks 1. Utarbeidelse av IMAC kolonne

1. Resuspender IMAC Resin grundig.
2. Umiddelbart overføre den nødvendige mengde harpiks i suspensjon i et 50 ml rør. Vi bruker 2 ml seng volumet av harpiks for rensing av KvAP fra 2 L kultur.
3. Sentrifuger rør ved 700 x g i to minutter for å pelletere ned harpiksen.
4. Fjern og kast supernatanten.
5. Legg 10 sjiktvolumer av MQH ₂ O og bland kort for å skylle harpiks.
6. Recentrifuge ved 700 xg i 2 minutter for å pelletere ned harpiksen. Kast supernatanten.
7. Legg 10 sjiktvolumer av MQH ₂ O og hell i det tomme kolonnen.
8. Vent til harpiks legger ned, og lukk kolonnen med en flyt adapter for lavt trykk væskekromatografi.
9. Løpe 5 sjiktvolumer av MQH ₂ O og 5 sjiktvolumer av likevektsbufferen gjennom kolonnen.

Boks 2. Rensing av Fv

Fv Transformation - Dag 1

1. Transform100 ng av plasmidet som inneholder Fv-his _6-60 pl JM83 kompetente celler, plate bakteriene på fire LB-agarplater inneholdende 100 ug / ml ampicillin, og inkuberes over natten i en 37 ° C inkubator.
2. Forbered 6 X 1 L LB for bakteriekultur.

Uttrykk av Fv - Dag 2

3. Skrap alle kolonier fra platene i LB medium. Legg denne suspensjon av bakterier til 6 x 1 liter LB i nærvær av ampicillin (100 mg / l) og inkuberes inntil OD600 når 0,5.
4. Da OD har nådd 0,5, reduserer temperaturen til 20 ° C og til 115 RPM. Når temperaturen falle til ca 20 ° C, tilsett anhydrotetracycline (100 mL av 1mg/ml i DMF til en L) for å initiere induksjon av proteinekspresjon og inkuberes ytterligere 5 time ved 20 ° C med normal risting.
5. Harvest-bakterier i en L sentrifuge flaske på 4000 xg i 15 min. Hell ut supernatanten så mye som mulig. Hold høstet bakterier på isen ien 4 ° C kaldt rom over natten.

Frigjøring av Fv molekyler fra bakterier - Dag 3

6. Resuspender bakterier i 150 ml Fv-frigjørende buffer (50 mM Tris pH 8,0, 20% sukrose, 1,0 mM EDTA).
7. Under omrøring med en magnetisk rørestav, tilsett lysozym til 0,1 mg / ml og holde bakteriene på is i 30 min. Etterpå legger _MgCl2 til 2,0 mm og holde på is for en annen 10-15 min.
8. Sentrifuger de behandlede bakterier ved 20.000 xg i 30 min ved 4 ° C. De bakterielle spheroblasts bør alle gå ned til pelleten, og de fleste av de Fv molekyler er gitt ut i supernatanten.
9. Dialyser supernatanten mot 4,0 L av vaskebufferen (20 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl) i kaldt rom i minst 4 timer. På slutten av dagen, bytt til frisk dialysebuffer og Dialyser over natten. På grunn av sukrose i løsningen, vil volumet av dialysatet øke med omtrent 50%. Overskudd av dialyse-ledning bør brukes.

IMAC rensing og FPLC - Dag 4

10. Likevekt 10 ml seng volumet av IMAC rensing resin (se boks 1) med dialysebuffer i 50 ml tube.
11. Overfør dialysatet fra slangen, tilsett MgCl _2-10 mM og øke volumet til 200 ml. Bland med pre-likevekt harpiks og Inkuber i 30 min ved 4 ° C.
12. Pakk den tomme kolonnen med den inkuberte harpiks, og harpiksen vaskes med 5 sjiktvolumer av vaske-buffer, etterfulgt av 5 sjiktvolumer av vaske-buffer med 10 mM imidazol og 30 mM imidazol hver.
13. Eluer bundet protein med 20 ml vaske buffer pluss 300 mM imidazol.
14. Kjør konsentrert Fv gjennom Superdex 200 kolonne pre-likevekt med vask buffer. Pool fraksjonene som inneholder Fv (typiske topper dukker opp på 17,6 ml oppbevaring volum) sammen og konsentrere den. Bestem konsentrasjonen i prøven ved hjelp av ekstinksjonskoeffisient av Fv ved 280 nm.

Discussion

Tilberedning av KvAP kanaler i forskjellige membraner har vært brukt i flere studier ^8-10. Etter ideen med å sikre fordelingen av lipider mellom vaskemiddel / lipid blandede miceller og proteinet / vaskemiddel / lipid blandet miceller, er vi i stand til å nå nesten fullstendig rekonstituering av KvAP inn membraner laget av meget forskjellige lipider. Hver tetramerisk KvAP kanalene må ~ 100 lipidmolekyler å fullt ut dekke sin transmembrane domene. Det grunnleggende kravet er å tillate nok lipidmolekyler å fusjonere inn i protein / lipid / vaskemiddel micelles før vaskemidler fjernes. Våre standard forhold (0,5 mg protein og 5,0 mg lipider) sikre at det i gjennomsnitt ~ 1000 lipid molekyler per protein molekyl. Vår flotasjon eksperimentere og biokjemiske eksperimenter bekreftet at rekonstituering er nesten fullført. Elektriske opptak fra kanalene satt inn sorte lipid membraner, screening av de rekonstituerte kanaler engainst en fag-displayed peptid bibliotek, og veksten av 2D krystaller av kanalene i membraner alle demonstrere vellykkede anvendelser av membran tilberedning for ulike formål.

Den lipid-avhengige konformasjonsendringer av KvAP kanaler og screening mot et fag-displayed peptid bibliotek presentere en ny vei til skjermen for kanal stopper eller kanalåpnere av biokjemiske metoder i stedet for å stole på elektrofysiologi å holde kanalene i bestemte conformations ^åtte. Den suksess i vårt skjerm for konformasjon-spesifikke bindemidler antyder at den samme strategien kan brukes for å finne spesifikke bindemidler på det aktiverte konformasjon. Det er påregnelig at de rekonstituerte kanaler i vesikler kan brukes mot enkelt kjede Fv biblioteker, Fab biblioteker, etc. Likeledes kan andre membran proteiner kjøre gjennom disse operasjonene og sikre sine stramme bindemidler som kan være nyttige for ulike formål. Vi tror at dette new metoden vil se mer generelle applikasjoner i fremtiden.

Rekonstituert membransystemer vil tillate klarlegging av de kjemiske detaljene bak lipid effekter på membran proteiner ^11. Lipid og protein er kjent for å være viktige for mange membranproteiner, og har vært utsatt for flere studier i de siste ^3. I de cellebaserte undersøkelser kan manipulasjoner implementeres for å forandre den enkelte komponenter i membranene og deretter de funksjonelle forandringer i membranen proteiner er forbundet med de strukturelle og komposisjonsendring i membranene. Slike forbindelser er indirekte og måtte skyldes flere faktorer i cellemembranene som ikke er godt karakterisert. I et rekonstituert homogen membran, er det mer definitiv Når man kobler sammen de strukturelle og funksjonelle endringer i membranproteiner og endringene i lipidsammensetning og membranprosesser egenskaper. Til syvende og sist, for å forstå tHan kjemiske prinsipper bak lipid-protein interaksjon, må vi avgrense fordelingen av lipider rundt transmembrane domene, og for å forstå de dynamiske endringer av disse lipider rett ved siden av proteiner. Et rekonstituert system synes å være en pålitelig måte mot denne erkjennelse.

Tilberedning av membran proteiner krever kontrollert fjerning av vaskemidler fra protein / lipid / vaskemiddel blandet micelles, og sammensmeltingen av de blandede micellene inn store de som til slutt blir til blemmer ^30. Tre forskjellige metoder benyttes for fjerning av vaskemidler, dialyse, perler og ^{14 syklodekstrin, 31, 32.} Men det er likevel vanskelig å oppnå en godt kontrollert, gradvis fjerning av vaskemidler fra et lite volum ^{33, 34.} En ideell metode for fjerning av detergent ville ta vaskemidlene ut av den vandige fase jevnt over hele volumet i en styrbar hastighet, og bør ikke utøve sterke forstyrrelser on tilberedning av bilagsdannende membraner. En slik fremgangsmåte kan være i stand til å endre hastigheten og effekten til rekonstituering, og vil sannsynligvis gjøre det mulig for rekonstituering i et lite volum. En kombinasjon av langsom fortynning og en av tre konvensjonelle metoder for fjerning av vaskemiddel kan nærme seg dette målet. Langsom fortynning ved å innføre små mengder av vann inn i proteinet / vaskemiddel / Lipidblandingen er en styrbar måte å minske jevnt vaskemiddelkonsentrasjonsnivået ned til CMC sin. Den detergentfjerning etterpå er mindre kritisk for vesikkeldannelse, men likevel viktig for fusjon av små blærer i store. Andre måter å oppnå kontrollert detergentfjerning fortsatt trenger å bli unnfanget og utviklet.

Vår tilberedning prosedyren tar hensyn til lipid fordeling blandede micelles og vaskemiddel-indusert fusjon av blemmer samt blandet miceller. Suksessen baner vei som fører til et bredere spekter av anvendelser av reconstituted blemmer, mye mer enn de tre retninger vi presentert. Tilpasning av prosedyren vår til andre membran proteiner bør ikke møte store tekniske grensen. Selv om mange membran proteiner har blitt rekonstruert ene eller den andre, har det vært vanskelig å oppnå nær komplett tilberedning og å vurdere funksjonaliteten av proteiner fra flere ulike perspektiver. Vår innsats i KvAP rekonstituering tyder på at våre metoder kan tillate full oppløsning og vil være egnet til disse formålene.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	RPI Corp.	T60060
Yeast Extract	RPI Corp.	Y20020
NaCl	Fisher	S271-3
Tris Base	RPI Corp.	T60040
Potassium Chloride	Fisher	BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside	Affymetrix	D322S	Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside	Affymetrix	O311	Ana-grade
Aprotinin	RPI Corp.	A20550-0.05
Leupeptin	RPI Corp.	L22035-0.025
Pepstatin A	RPI Corp.	P30100-0.025
PMSF	SIGMA	P7626
Dnase I	Roche	13407000
Bio-Bead SM-2	Bio-Rad	152-3920
HEPES	RPI Corp.	H75030
POPE	Avanti Polar Lipids	850757C
POPG	Avanti Polar Lipids	840457C
DOGS	Avanti Polar Lipids	870314C
DMPC	Avanti Polar Lipids	850345C
Biotin-DOPE	Avanti Polar Lipids	870282C
DOTAP	Avanti Polar Lipids	890890C
NeutrAvidin agarose beads	Piercenet	29200
Dialysis Tubing	Spectrum Laboratories, Inc	132-570
Pentane	Fisher	R399-1
Decane	TCI America	D0011
MTS-PEG5000	Toronto Research Cemicals	M266501