Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إعادة تشكيل قناة كيلو فولت في الأغشية الدهنية للدراسات الهيكلية والوظيفية

Published: July 13, 2013 doi: 10.3791/50436
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas
* These authors contributed equally

Summary

يتم وصف إجراءات إعادة كاملة من قناة البوتاسيوم الجهد بوابات النموذج في الأغشية الدهنية. القنوات المعاد هي مناسبة لفحوصات الكيمياء الحيوية، والتسجيلات الكهربائية، وفحص يجند والدراسات البلورات الإلكترون. قد يكون هذه الأساليب التطبيقات العامة للدراسات الهيكلية والوظيفية للبروتينات غشاء الأخرى.

Abstract

لدراسة التفاعل دهون، بروتين بطريقة reductionistic، فمن الضروري دمج بروتينات الغشاء في الأغشية من تكوين الدهون واضحة المعالم. نحن ندرس آثار النابضة التي تعتمد على الدهون في البوتاسيوم الجهد بوابات (كيلو فولت) قناة النموذج الأولي، وعملت الإجراءات المفصلة لإعادة تشكيل قنوات في غشاء أنظمة مختلفة. إجراءات إعادة النظر في اتخاذ لدينا على حد سواء الانصهار المنظفات التي يسببها من الحويصلات والانصهار من البروتين / المنظفات المذيلات مع دهن / المنظفات المذيلات المختلطة فضلا عن أهمية التوصل إلى توزيع توازن الدهون بين البروتين / المنظفات / الدهون والمنظفات المذيلات المختلطة / الدهون. اقترح البيانات المتوفرة لدينا أن الإدراج من القنوات في حويصلات الدهنية هو عشوائي نسبيا في التوجهات، وكفاءة إعادة مرتفع بحيث لم تظهر أية المجاميع البروتين التي يمكن اكتشافها في التجارب تجزئة. لقد استخدمت إعادةقنوات D لتحديد الدول بتكوين جزئي من القنوات في الدهون المختلفة، وتسجيل الأنشطة الكهربائية من عدد قليل من القنوات إدراجها في طبقات ثنائية الدهون مستو، وشاشة لبروابط التشكل محددة من مكتبة الببتيد عرض-فج، ودعم نمو بلورات 2D من القنوات في الأغشية. يمكن تكييفها إجراءات إعادة الموصوفة هنا لدراسة بروتينات غشاء أخرى في طبقات ثنائية الدهون، وخاصة للتحقيق في آثار الدهون على القنوات الأيونية الجهد بوابات حقيقية النواة.

Introduction

الخلايا تبادل المواد والمعلومات مع بيئتها من خلال وظائف بروتينات غشاء محددة 1. بروتينات الغشاء في أغشية الخلايا تؤدي وظيفة ومضخات، والقنوات، المستقبلات، والإنزيمات intramembrane، ينكرز وأنصار الهيكلي عبر الأغشية. كانت الطفرات التي تؤثر على بروتينات الغشاء ذات الصلة العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان. في الواقع، كانت العديد من البروتينات الغشاء الأهداف المخدرات الأولية لأنها مهمة ويمكن الوصول إليها بسهولة في أغشية الخلايا. ولذا فمن المهم جدا لفهم بنية ووظيفة البروتينات الغشاء مختلف في الأغشية، وتجعل من الممكن استنباط أساليب جديدة للتخفيف من الآثار الضارة من البروتينات متحولة في الأمراض التي تصيب الإنسان.

الدهون تحيط بكل بروتينات غشاء متكاملة في طبقات ثنائية 2، 3. في الأغشية حقيقية النواة، من المعروف أن مختلف أنواع مختلفة من الدهون التي سيتم تنظيمها في microdomains 4، 5.وقد أظهرت العديد من البروتينات الغشاء ليتم توزيعها بين هذه microdomains فضلا عن مرحلة السوائل ضخمة من الأغشية 3، 6. الآلية التي يقوم عليها التنظيم من microdomains وتسليم بروتينات الغشاء الى لهم وأهمية الفسيولوجية مثل هذه التوزيعات هي مهمة بوضوح ولكن لا تزال غير مفهومة تماما. إحدى الصعوبات التقنية الرئيسية في دراسة آثار الدهون على بروتينات الغشاء هو إعادة موثوقة من تنقية البروتينات كيميائيا الغشاء في الأغشية التي تسيطر عليها جيدا تركيبة الدهون حتى يتسنى لجميع البروتينات أعادت تقريبا وظيفية 7. في السنوات القليلة الماضية، قمنا بتطوير طرق لإعادة تشكيل قناة البوتاسيوم الجهد بوابات النموذج الأولي من A. pernix (KvAP) في النظم المختلفة لغشاء الهيكلية والوظيفية دراسات 8-10. وأظهرت بيانات من الآخرين، ولنا معا أن الدهون من المرجح عاملا محددا في التغييرات متعلق بتكوين من الجهد الاستشعارالمجالات من قناة أيون الجهد بوابات وربما تشكيل هياكل بعض من هذه القنوات 11. في القادم، وسوف نقدم وصفا مفصلا لأساليب عملنا وسوف نقدم نصائح تقنية الحرجة التي من المرجح أن ضمان نجاح الاستنساخ من نتائجنا وكذلك تمديد طرقنا على دراسات للبروتينات غشاء الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التعبير وتنقية قناة KvAP (الشكل 1)

  1. عمل الإعداد - يوم 0
    1. شطف قوارير الزجاج للثقافة البكتيرية مع الماء منزوع الأيونات (DIH 2 O) وMilliQ H 2 O (MQH 2 O) لإزالة أثر المنظفات غسل الاواني من العام.
    2. الأوتوكلاف 1،000 مل المتوسطة LB في 2.8 L مخروطي قوارير (مجموع اثنين لتر ثقافة كمثال هنا). تم العثور على صلابة منخفضة من الماء إلى أن تكون مهمة لثقافة ناجحة من البكتيريا المتحولة.
    3. الأوتوكلاف 100 مل المتوسطة LB في 500 مل قوارير
    4. تحويل 60 ميكرولتر من الخلايا المختصة أزرق XL1 مع 200 نانوغرام من pQE60 البلازميد الذي يحتوي على الجين لKvAP مع موقع القطع الثرومبين وصاحب العلامة 6 في جلساتها C-محطة، لوحة البكتيريا على اثنين من لوحات LB-أجار تحتوي على 100 ​​ميكروغرام / مل الأمبيسلين، واحتضان لهم ل14-16 ساعة في الحاضنة 37 درجة مئوية.
  2. التعبير عن KvAP - يوم 1
    1. تحقق التطبيقearance من المستعمرات البكتيرية على لوحات بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها. كانت تلك المستعمرات عادة فقط حوالي 0.2-0.5 ملم وقطرها، وكان هناك الكثير منهم. نحن لا نريد لوحات التي تؤوي مستعمرات كبيرة تحيط بها الكثير من المستعمرات الفضائية.
    2. إضافة 5.0 مل المتوسطة LB إلى كل لوحة LB-أجار حضنت بين عشية وضحاها والخردة قبالة المستعمرات. نقل تعليق البكتيريا إلى 100 مل المتوسطة LB تعقيمها في دورق سعة 500 مل. إضافة الأمبيسلين إلى تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل، واحتضان الثقافة صغيرة ل~ 1 ساعة عند 37 درجة مئوية أو حتى OD600 تصل إلى 0.60.
    3. في هذه الأثناء، مكان اثنين من قوارير مع 1.0 L المتوسطة إلى 37 ° C يهز حاضنة لالاحماء المتوسطة، وإعداد 20 مل من بووتون 2 (1.0 M؛ 10 ملي تركيز النهائي في كل ثقافة L 1.0)، 2.0 مل 0.4 M IPTG (الآيزوبروبيل-β-ثيولي غالاكتوزيد)، و 2.0 مل من 100 ملغ / مل الأسهم الأمبيسلين في الماء.
    4. مرة واحدة في الثقافة صغيرة جاهزة، إضافة 10 مل من بووتون 2، 1.0 مل من ampiciالأسهم الناموسيات، و 50 مل من ثقافة صغيرة من الخطوة 1.2.2 إلى وسائل الإعلام LB قبل تحسنت. OD600 يجب أن يكون حول 0.05. مشاهدة لهطول ممكن نظرا لصلابة عالية من الماء والأيونات المضادة في وسائل الإعلام LB. با 2 + هو معروف لربط المجال المسام للقناة وكتل التيار الأيونية البوتاسيوم، وبالتالي يقلل من سمية من التعبير الرفيع المستوى للقنوات للبكتيريا.
    5. اتخاذ OD600 كل ساعة حتى يصل 0.70، وفي كل خمس عشرة دقيقة حتى يصل 0،8-0،9. لدينا في مجموعة المتابعة، وعادة ما يستغرق 5 ~ ساعة لتصل إلى 0.8.
    6. إضافة 0.40 ملي IPTG لبدء التعبير الناجم عن بروتين القناة، واحتضان ثقافة لأخرى 4.0 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 225 دورة في الدقيقة تهتز.
    7. البكتيريا الحصاد في زجاجات الطرد المركزي 1.0 لتر عن طريق الدوران في 4،000 x ج، 4.0 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. صب وطاف قدر الإمكان في دورق النفايات، إضافة 10 مل 1.0 م العازلة الفوسفات نا لترسيب جميع با 2 +، ثم قم بإضافةحجم صغير من المبيض لقتل البكتيريا. الحفاظ على البكتيريا تحصد في زجاجات الطرد المركزي مدفونة في الجليد في 4.0 ° C الغرفة الباردة بين عشية وضحاها.
  3. تنقية البروتين KvAP (يوم 2 و 3؛ 1B الشكل)
    1. Resuspend والبكتيريا بيليه في 15 مل من تحلل العازلة IMAC في 1.0 L الثقافة. إضافة ~ 1.0 U الدناز الأول، وثلاثة مثبطات الأنزيم البروتيني من leupeptin، أبروتينين وpepstatin A عند 1.0 ميكروغرام / مل. وكان حجم التداول الكلي للثقافة اثنين لتر ~ 35 مل.
    2. يصوتن البكتيريا معلق في كوب معدنية مدفونة في الجليد ليصبح المجموع 10 دقيقة من في الوقت المحدد. تم تعيين sonicator المسبار الميكروي في 5 ثانية ON / OFF دورة 10 ثانية مع انتاج الطاقة 40٪ في 4.0 ° C غرفة باردة. تم تحديد الإعداد انتاج الطاقة تجريبيا حتى أن معظم البكتيريا هي lysed دون الكثير من التدفئة في الحل.
    3. إضافة 0.50 غرام من N-ديكل-β-D-مالتوزيد (DM؛ سول الصف من Anatrace) في مسحوق جاف إلى الخلايا المحللة sonicated واحتضان الخليط لمدة 3.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع الهز المستمر الأفقي (~ 100 دورة في الدقيقة) من أجل انتزاع أكبر قدر البروتينات قناة ممكن. فمن المهم للتأكد من أن مسحوق المنظفات يذوب تماما على مدى فترة من 30-50 دقيقة.
    4. بعد استخراج المنظفات، وإزالة الحطام الخلية من المحللة بواسطة الطرد المركزي عند 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في RT. أثناء انتظار الطرد المركزي وحتى النهاية، إعداد LC العمود القائم على صاحب العلامة (الضغط المنخفض اللوني السائل) كما هو مفصل في الإطار 1.
    5. تحميل طاف من الخطوة 1.3.4 على إيماك قبل معبأة (ط mmobilized م ETAL أيون لج hromatography ffinity) العمود بمعدل تدفق 1-2 مل / دقيقة التي يقودها مضخة تمعجية. وبدلا من البروتين المستخرج صاحب الموسومة يمكن حضنت مع الراتنج إيماك للربط batchwise.
    6. غسل الراتنج IMAC عن طريق تشغيل 5 مجلدات سرير من غسل العازلة وآي ماك، و 10 مجلدا من السرير IMAC برتقالي غسلإيه زائد 20 ملي إيميدازول. يتم استخدام رصد الأشعة فوق البنفسجية في خط للتأكد من أن غسل نظيفة.
    7. أزل البروتين KvAP من خلال تطبيق العازلة شطف IMAC يحتوي على 300 ملي إيميدازول. ومزال معظم KvAP منضم في غضون 6 مل من شطف العازلة من خلال العمود. إضافة الثرومبين (1.0 U في 2-3 ملغ من البروتين) في الكسور شطف المجمعة واحتضان بين عشية وضحاها البروتين على مقاعد البدلاء ليلتصق صاحب العلامة 6.
    8. في اليوم التالي، والتركيز على حل بروتين الثرومبين-هضمها في Centricon (MWCO = 30K) وصولا الى 600 ميكرولتر لFPLC حجم الاستبعاد (سريع البروتين اللوني السائل). أثناء الطرد المركزي، خلط عينة كل خمس دقائق لتقليل تجميع البروتين. كما يتركز البروتين، وتركيز المحلية في تصفية الغشاء يصبح أعلى، وهناك في بعض الأحيان أبيض واضح يترسب التي يمكن أن تسد وإلا فإن غشاء التصفية. أيضا نسبة عالية من البروتينات (~ 5-10 ملغ / مل) في أسفل المكثف يؤدي إلى الحاجبلون نيش والاختلاط يساعد حقا لتقليل الخسائر عينة.
    9. تشغيل KvAP المركزة من خلال Superdex 200 العمود الذي هو قبل معايرتها مع العازلة موازنة FPLC. عادة ذروة قناة KvAP رباعي القسيمات في elutes DM مع حجم الاحتفاظ 12.3 مل. هناك ذيل زائدة صغيرة عند حوالي 13.6 مل، والذي يحتوي على كمية صغيرة من KvAP أحادى. الفراغ من العمود الذي استخدمناه في 7.0 مل، وعادة العينة يؤدي إلى ذروة صغيرة في الفراغ، الذي يحتوي على البروتين KvAP القليل جدا. وإميدازول يأتي في نهاية شطف (~ 24 مل). تجمع الكسور التي تحتوي tetramers KvAP معا والتركيز على حل البروتين وصولا الى 0.5 مل. تحديد تركيز العينة باستخدام معامل الانقراض المقدرة (~ 1.2E-5.0 M -1 سم -1، والتي تم حسابها على أساس عدد من بقايا العطرية) من KvAP عند 280 نانومتر [المرجع 12؛ URL: الإلكتروني http:// web.expasy.org / protparam /].
      في درجة حرارة الغرفة، وKvAP تنقيته في DM مستقرة على الأقل في الأسبوع من دون خسارة كبيرة من البروتين. في 4 درجات مئوية، ويمكن أن تستمر لفترة أطول. أبدا تجميد البروتين في المنظفات. فمن المستحسن لتخزين البروتين في DM في 4 درجات مئوية، والبروتين في β-OG في درجة حرارة الغرفة. ولكننا عادة لا تنتظر، والمضي قدما إلى الخطوة مباشرة بعد إعادة البروتينات جاهزة.
    10. فحص العينات في 12٪ تخفيض SDS-PAGE هلام.
      تم عن طريق خلط 20 ميكرولتر من العينات مع العازلة عينة SDS-5X (الجدول 3 للمخازن) تستكمل مع 1.0٪ β-ME أعدت عينات من كل خطوة وصفها أعلاه. لم المغلي العينات. بعد كانت المواد الهلامية جاهزة والعينات عادة ما كان في SDS-المخزن المؤقت لأكثر من 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وأظهرت KvAP من النوع البري بعد أن تم تشغيل الجل وملطخة Coomassie الأزرق على خط النار في فرقة واحدة في حوالي 26 كيلو دالتون (الشكل 1B

2. أيون إعادة إعماره القناة

2.1. إعداد الحويصلية والانصهار المنظفات التي يسببها من الحويصلات

قبل إعداد الدهون، غسل 14 مل الزجاج القابل للتصرف أنبوب اختبار، أنبوب زجاجي المسمار المغطاة، و250 ميكرولتر حقنة زجاجية مع الكلوروفورم. أسكب ~ 10 مل كلوروفورم في testtube.

  1. إعداد بالميتويل-oleoyl-الفوسفاتيديل-ايثانول (البابا) وبالميتويل-oleoyl-الفوسفاتيديل-الجلسرين (POPG) الجسيمات الشحمية.
    1. نقل 3.75 ملغ من البابا و1.25 ملغ من POPG (البابا: POPG = 03:01 نسبة الوزن) في الكلوروفورم في أنبوب زجاجي المسمار وتوج قبل تنظيف وتجفيف الدهون تحت دفق مستمر من غاز الأرجون. عندما لم يعد فيها الكلوروفورم مرئية، تجفيف الدهون تحت مزيد من فراغ الغرفة لمدة ساعة واحدة.
    2. إضافة 440 ميكرولتر من منخفض الملح العازلة (10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4) أو الماء في الدهون المجففة ودوامة أنبوب لترطيب الدهون. تعليق المادة الدهنية تبدو بيضاء وعكر.
    3. يصوتن تعليق الدهون في sonicator حمام الجليد الباردة حتى يصبح حل حويصلة شفافة (OD410 <0.2).
      عادة لملغ / مل البابا / 10 POPG حل في الماء أو العازلة الملح منخفضة، قمنا بتشغيل sonicator مع 30 ثانية ON OFF و 30 ثانية (على الجليد) أي ما مجموعه 15-20 دقيقة. بسبب الحرارة المتولدة أثناء صوتنة، فإنه من المستحسن لإضافة 1.0 ملم DTT في حل الدهون من أجل تقليل أكسدة الدهون، وإلى تهدئة حمام مائي من sonicator إلى 10 درجة مئوية أو أقل. وOD410 النهائي التي تعتمد على الدهون. بالنسبة لبعض الدهون قد يكون من الصعب جدا الوصول إلى هذه OD منخفضة. اذا ما حدث ذلك، ونحن عادة استخدام المنظفات لذوبان الدهون تماما والسماح الحضانة طويلة للوصول إلى توزيع جيد من الدهون حول المذيلات تحتوي على البروتين (انظر التالي).
      A sonicator حمام ذات قدرة عالية المهم في ORDإيه لتصل إلى OD410 <0.2. لقد تم استخدام نظام الذي أدلى به مختبر التوريدات، وشركة (نموذج # G112SPIG، هيكسفيل، NY). مفتاح ل sonication السليم للحويصلات هو التأكد من أن مركز الرنانة في منتصف أنبوب لديه اهتزاز قوي. الاهتزاز يختلف مع حجم المياه وبالتالي يمكن تعديلها. كما وجدت أن زيادة اللزوجة تجريبيا من الماء عن طريق إضافة كمية صغيرة من الجلسرين يمكن أن تعزز فعالية صوتنة.
      وبدلا من ذلك فقد وجدنا أن استخدام sonicator المسبار الميكروي في اتصال مع التعليق الدهون في البلاستيك أو أنبوب معدني يمكن أن تنتج نفس النتائج. والمسبار الميكروي في حاجة الى التنظيف وسوى غيض هو تزج في حل الدهون. لأن يتم تقسيم جزيئات الدهون الى قطع صغيرة على السطح من المسبار الميكروي، من المهم جدا للحفاظ على تبريد العينة، وبعض عوامل الاختزال في جميع أنحاء لمنع أكسدة الدهون غير المشبعة من.
      تحت البرد الإلكترون ميكرoscopy، فإن الغالبية من الحويصلات unilamellar sonicated هي 30-50 نانومتر في القطر (لا تظهر البيانات). انحناء سيارات الدفع الرباعي الصغيرة عالية جدا لدرجة أن اضطراب صغير يكفي للحث على الانصهار حيوية من هذه الحويصلات في أكبر تلك التي هي 80-200 نانومتر في القطر (انظر التالي).
    4. إضافة 50 ميكرولتر من 3.0 M بوكل و 10 ميكرولتر من 0.50 M DM إلى الخليط بحيث التعليق الدهون النهائية تضم 300 ملي بوكل و 10 ملم DM. احتضان الحل مع دوران أفقي لمدة 2 ساعة على RT لتشكيل الدهون / المنظفات المذيلات المختلطة. بعد الحضانة، وينبغي أن يصبح نظام التعليق وعكر قليلا (الشكل 2A)، والذي يرجع إلى الانصهار المنظفات التي يسببها من الحويصلات unilamellar الصغيرة.
    5. عندما يتركز البروتين إلى أكثر من 2.0 ملغ / مل، 0.50 ملغ KvAP إضافة البروتين، و 50 ميكرولتر من 3.0 M بوكل، 16 ميكرولتر من الأسهم 0.50 M DM في المياه، و 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4 إلى خليط الدهون / المنظفات ل جعل 1 مل من الحجم النهائي. والدهون النهائية: نسبة البروتين الوزن هو 10:01وتركيز النهائي من DM هو 18 مم (الشكل 2A). احتضان البروتين / الدهون / المنظفات الخليط في أنبوب زجاجي مع دوران أفقي لمدة 2 ساعة أخرى.
      ويسترشد اختيار تركيز المنظفات من قبل الانصهار الحويصلة المنظفات التي يسببها والحويصلة الانحلالية 13. عندما تتشكل الحويصلات بواسطة صوتنة قوي، ومتوسط ​​قطرها هو في حدود 30-50 نانومتر تحت EM. هذه الحويصلات يكون تشتت منخفضة جدا عند 410 نانومتر. في تركيزات منخفضة، يتم إدراج المنظفات لأول مرة في الحويصلات، وزعزعة الحويصلات، وتحفز اندماج الحويصلات المنظفات المشبعة (OD410 ترتفع، وانظر الشكل 2A). الانصهار الحويصلة يؤدي إلى زيادة OD410 نانومتر. لمدة 10 ملغ / مل البابا / POPG الحويصلات، وOD410 القمم في حوالي 15 ملم DM. عندما يتم إدخال أكثر المنظفات والحويصلات بدء اقتحام قطعا و أصبح تقسيم الدهون إلى المنظفات / الدهون المذيلات المختلطة. ويرافق هذه العملية الأخيرة من قبلتقليل من OD410 وصولا الى المستوى النهائي منخفضة (<0.1).
      بسبب الأحداث الانصهار نشطة في مرحلة ارتفاع الكثافة البصرية نظرا لانصهار المنظفات التي يسببها من حويصلات صغيرة، فمن المحتمل جدا أن البروتين / المنظفات المذيلات سيتم تنصهر بنشاط مع حويصلات الدهنية المشبعة المنظفات. هذا هو السبب وراء اختيار 18 مم DM وقت إعداد البروتين / الدهون / خليط المنظفات. إذا أصبح المنظفات تتركز بأكثر من 4 أضعاف، وكمية من الاحتياجات DM إلى تعديل بحيث التركيز النهائي لا يزال حوالي 18-20 ملم. عندما العائد البروتين منخفض جدا، فإنه من الصعب تقييم مدى المنظفات المركزة هي في العينة، فإننا بدلا خلط البروتين مع الدهون solubilized تماما، واستخدام خليط بالكامل معايرتها لإعادة. في أيدينا، إذا سمح الوقت لم يكن كافيا للتوصل إلى توازن توزيع جيد من الدهون التي تحتوي على البروتين بين والمذيلات خالية من البروتين، وreconstitutانخفضت كفاءة أيون بشكل ملحوظ. ونحن عادة اختبار كفاءة إعادة من قبل اثنين من التجارب: 1) دراسة شارك في الهجرة من البروتين مع الكسر حويصلة في تنبيذ فائق التدرج السكروز الكثافة؛ 2) استخراج البروتينات من الحويصلات المعاد، ويجزئ لهم في هلام عمود الترشيح للعثور على مقدار البروتين (KvAP في حالتنا) لا يزال يتعين رباعي القسيمات. الوقت الحد الأدنى من الحضانة من البروتين / الدهون / المنظفات هو بضع ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات.
      لبروتين الغشاء الجديد الذي هو مستقر في المنظفات المختلفة، فإن الخطوة الأولى هي معرفة ممتلكات الانحلالية من الدهون عن طريق مثل هذه المنظفات، على غرار ما هو أظهر في الشكل 2A. المقبل، فإنه من المستحسن أن تبدأ مع مقتطفات PC، مثل E. القولونية القطبية PC استخراج، استخراج PC فول الصويا وغيرها، بحيث إذا كان بروتين معين يحتاج بعض الدهون الفوسفاتية وظيفته، فإنه يمكن إدراجها بالفعل في المقتطفتيد الدهون الخليط.
  2. إعداد KvAP في خليط مع المنظفات solubilized 1،2-dioleoyl-3-trimethylammonium-البروبان (DOTAP) أو 1،2-dioleoyl-SN-glycero-3-سوسينات (كلاب) --- مثال كاملة الإذابة الدهون لإعادة
    1. إعداد الدهون هو نفس للبابا / POPG الحويصلات. sonication من الدهون رطب إلى حويصلات صغيرة unilamellar يحتاج لوقت أطول (عادة 45-60 دقيقة) من للبابا / POPG الدهون (عادة 5-10 دقيقة). الكلاب الحويصلات قد تلتحم ببطء مع بعضها البعض وتشكل قطرات دهنية صغيرة.
      بسبب صعوبة في جعل سيارات الدفع الرباعي ذات جودة عالية من DOTAP والكلاب بتكاثر، ونحن عادة ذوبان هذه الدهون اثنين تماما قبل الاختلاط مع البروتينات.
    2. لذوبان في DOTAP والكلاب تماما، يتم خلط الحويصلات sonicated مع 10 ملي DM و 40 ملي N-الأوكتيل-β-D-جلوكوسيدي (β-OG). وحضنت الخليط الدهون / المنظفات بين عشية وضحاها (> 15 ساعة)في درجة حرارة الغرفة، ويجب أن الخليط يكن لديك أي جزيئات صغيرة أو قطرات. ولكن بدلا من ذلك هو واضح إلى حد ما. والفشل في التوصل إلى التوازن الكامل في هذه الخطوة تؤدي إلى تشكيل جزء كبير من الحويصلات الصفاحات.
    3. مزيج من البروتين KvAP مع DOTAP المنظفات solubilized والكلاب في البروتين: نسبة الدهون أقل من أو يساوي 1:10. ولا يسمح للخليط البروتين / المنظفات / الدهون لاحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 ساعة مع دوران نهاية الإفراط في نهاية المطاف.

2.2. إزالة المنظفات لتشكيل proteoliposomes

  1. غسيل الكلى --- إزالة البطيء للمنظفات، مثل DM وβ-OG، التي لديها تركيزات عالية نسبيا مذيلة الحرجة (CMC ≥ 1.0 ملم)
    إعداد العازلة غسيل الكلى 2 ليتر (الجدول 3) لكل خليط مل 1.0.
    قطع طول مناسب من أنابيب غسيل الكلى (MWCO = 10K، 0.70 سم)، وغسله بالماء DI. فمن المهم للتحقق وجعلتأكد أنه لا يوجد أي تسرب في الأنابيب. للحصول على عينات الحساسة، وأنابيب يمكن التعامل أولا مع منطقة عازلة من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك pH8.0 و 2.0 ملي EDTA، ومن ثم تنظيفها في الماء المغلي لمدة 3-5 دقيقة. ثم يشد الأنبوب في نهاية واحدة وتشطف مع المخزن المؤقت لغسيل الكلى.
    تحميل مزيج من البروتين ودهون، المنظفات في أنابيب غسيل الكلى. المشبك طرفي الأنبوب مع الحد الأدنى من الفضاء فوق اليسار الحل. وضع أنابيب تحميلها في المخزن المؤقت لغسيل الكلى، واستخدام لوحة التحريك بحيث أنابيب تدور ببطء في الحل. تغيير العازلة غسيل الكلى مرة واحدة كل 8 ساعات. بعد التغيير العازلة الأولى، ينبغي أن يصبح الحل غائم إذا كان خليط من البروتين ودهون، المنظفات واضحة تماما. إذا كان غسيل الكلى سريع جدا، قد يكون هناك بيضاء صلبة تترسب في قاع الأنبوب غسيل الكلى. فمن المستحسن أن وقت التغيير العازلة، وينبغي أن يفرك الأنبوب، ومقلوب عدة مرات. بعد خمسة تغييرات من العازلة غسيل الكلى، والحويصلات عادة ما تكون جاهزة.
    علينا التحقق من المبلغ المتبقي من المنظفات طريق اطلاق النار على حويصلات على طبقة ثنائية المادة الدهنية. عندما يكون هناك كمية كبيرة من المنظفات لا يزال اليسار، يصبح طبقة ثنائية كسر فوري تقريبا. ومن الممكن أيضا لقياس المنظفات المتبقية باستخدام أسلوب اللونية أو قياس التوتر السطحي للتعليق حويصلة.
  2. استخدام الخرز البوليسترين للمساعدة على إزالة المنظفات التي تحتوي على CMC منخفض
    في كثير من الحالات، لدينا لاستخدام منظفات CMC منخفضة، مثل DDM (CMC ~ 0.17 مم في الماء). وتستخدم الخرز مع المسام مسعور صغيرة لإزالة هذه المنظفات 14.
    1. إعداد الخرز. الوزن من 0.5 غرام من حبات الجافة ووضعها في أنبوب 50 مل كورنينج، إضافة 20 مل الميثانول، يصوتن الحل في sonicator الحمام لمدة 5 دقائق لإزالة فقاعات المحاصرين، وتدور باستمرار حبات في 5،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، ثم صب معظم الميثانول. تكرار غسل مع الايثانول والمياه MilliQ. يتم تخزين حبات غسلها في 20٪ من الإيثانول في 4 درجات مئوية، وتحتاج إلى تغيير إلى منطقة عازلة خالية من المنظفات قبل الاستخدام.
    2. تقدير كمية المنظفات في خليط من البروتين / الدهون / المنظفات في أن يعامل، وحساب كمية من الخرز اللازمة لإزالة المنظفات. لDDM وDM، قدرة ملزم هو حوالي 100 ملغ حبات لمدة 10 ملغ المنظفات. يتم وزن حبات الرطب دون الماء الزائد بها، وإضافتها مباشرة إلى خليط من البروتين. مطلوب لا يقل عن 15-20 دقيقة لحبات أن تكون فعالة بشكل كامل وانخفاض تركيز المنظفات يصل إلى مستوى ثابت 14-16. لإزالة 8.7 ملغ من DDM (دوديسيل-مالتوزيد) في 1.0 مل حل، أي ما يعادل 18 ملم ~، ما مجموعه 87 ملغ من الخرز البوليسترين، مثل بيو الخرز SM2، ويستخدم في خمسة أجزاء متساوية. مزج خليط من البروتين / الدهون / المنظفات مع كل جزء لمدة 20-30 دقيقة مع التناوب المستمر نهاية الإفراط في نهاية في درجة حرارة الغرفة، وتدور باستمرار الخرز، وطاف لنقل جزء القادم من الخرز، وكرر حتى النهاية.
      عندما concentr المنظفاتأوجه تصل CMC لها، ونحن نعرب عن قصد الفترة الزمنية لذلك لساعة واحدة حتى أن كمية صغيرة من المنظفات في الحل سيسهل اندماج الحويصلات الصغيرة إلى الكبيرة.
    3. لإزالة كمية ضئيلة من المنظفات بعد الخطوة الأخيرة، إضافة 35 ملغ بيو راد SM2 الخرز واحتضان مع الحويصلات لمدة 4 ساعة.
      عندما الإجراءات لإزالة المنظفات المذكورة أعلاه هي ليتم تطبيقها على بروتين جديد، فمن عادة المستحسن أن تبدأ مع نسبة البروتين / الدهون (وزن / وزن) من ~ 01:10. يحتاج خليط الدهن / المنظفات لتكون مستعدة بعناية بحيث يكفي المنظفات تضاف إلى ذوبان الدهون تماما (الشكل 2A). من المهم أن احتضان الخليط دهون، المنظفات لأكثر من 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (مع 1-2 ملي DTT) مع الهز المستمر (400 دورة في الدقيقة) أو التناوب نهاية الإفراط في نهاية المطاف. عندما يتم خلط البروتين مع الدهون، ينبغي حضنت الخليط البروتين / الدهون / المنظفات لفترة كافية (بين عشية وضحاها إذا كان البروتين هو stablه) إما في درجة حرارة الغرفة أو في غرفة باردة بحيث توزيع المنظفات والدهون بين المذيلات تحتوي على البروتين والمذيلات خالية من البروتين هو حتى نسبيا. وبالإضافة إلى ذلك، إذا تم توظيف سريع إزالة المنظفات باستخدام BioBeads، فمن المهم معرفة قدرة المنظفات ملزم من الخرز. إزالة البطيء للمنظفات المرجح يضمن أن لديك ما يكفي من البروتينات والدهون للحفاظ على سلامتها وتصبح إدراجها في حويصلات كبيرة نسبيا.

2.3. تخزين proteoliposome ومراقبة الجودة

  1. مرة واحدة الحويصلات مستعدون، إعدادهم في 50 ميكرولتر مأخوذة وفلاش تجميد مأخوذة بواسطة تغرق المباشر في النيتروجين السائل. ثم يتم تخزين الحويصلات المجمدة في الفريزر -80 درجة مئوية. لفحوصات الكيمياء الحيوية، ونحن لا نستخدم الحويصلات المجمدة لأن دورة تجميد ذوبان الجليد وجدت في بعض الأحيان لتقديم الأعمال الفنية في رد فعلنا CYS محددة. لتسجيل الكهربائيةق، ونحن نستخدم فقط الحويصلات التي تم تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تقل عن 6 أشهر.
  2. تعويم الحويصلات في التدرج الكثافة (الشكل 2B)
    1. تحميل 50 ميكرولتر من تعليق حويصلة على الجزء العلوي من طبقات من التدرج السكروز التي تحتوي على 0.3 مل من كل 10، 35 و 55٪ سكروز المحرز في 10 HEPES ملي وتدور في 200،000 G لمدة 4 ساعة على 4 درجات مئوية. تسريع ويتباطأ ببطء لتجنب تعطيل التفاعل بين الطبقات.
    2. جمع الكسور 100 ميكرولتر من أعلى إلى أسفل، وتشغيلها على غير مختزلة SDS-PAGE (الشكل 2B). اتسخت لKvAP بشكل جيد مع الأزرق Coomassie مثل أن عصابة من البروتين 0.5-1.0 ميكروجرام مرئيا بوضوح. وينبغي العثور على بروتين KvAP في واجهة بين 10 و 35٪ سكروز. وينظر لا المجاميع الثقيلة من البروتينات في نطاق عالية الكثافة، مشيرا إلى أن جميع البروتينات تقريبا في الأغشية.
  3. تحقق من التشكل السليم للقناة KvAP في الحويصلات. <ر /> لدينا البيانات السابقة أن واحدة السيستين متحولة (L125C/C247S) KvAP، عند دمجها بشكل صحيح في طبقات ثنائية، ودفن تماما في الأغشية، والتي لا يمكن الوصول إليها من قبل الكواشف السيستين محددة 8. تم اختبار الإجراءات إعادة مع هذه القناة متحولة، وفحصها من قبل كاشف السيستئين محددة، MTS-PEG5000. التعديل في L125C مع 1.0 ميكرومتر MTS كاشف في درجة حرارة الغرفة ويدخل تحولا 5kDa إلى الفرقة KvAP في امختزل هلام SDS-PAGE. يجب أن التنفيذ الناجح لإجراءات إعادة لدينا أي رد فعل يؤدي إلى كشفها للقنوات متحولة L125C في الأغشية فوسفورية، مما يدل على الإدراج كاملة تقريبا من جميع القنوات في طبقات ثنائية. كعنصر تحكم إيجابية من رد الفعل، هو عرض 5.0 مم DM لتقديم ما يقرب من جميع مخلفات L125C في القنوات متحولة للوصول إلى كاشف MTS.
    بدلا من ذلك، السم المسام ملزم، مثل chrybdotoxin، يمكن أن تستخدم لحساب قنوات رباعي القسيمات. قائم على الضد ملزمة كماويقول (انظر الإطار 2، حيث يتم إعداد اناث باعتباره يجند التشكل محددة لKvAP) يمكن أن تستخدم لتحديد مواقع الربط المتاحة في الحويصلات المعاد. ومن ثم يمكن مقارنة هذه المقايسات ملزمة مع فحص كمية لقياس البروتين الكلي من أجل معرفة ما جزء من القنوات المعاد هي tetramers وما جزء من البروتين لديه مجداف الجهد الاستشعار (S3/S4 من أجهزة الاستشعار الجهد) بشكل صحيح مطوية.
    لبروتينات أخرى أن يعاد تشكيلها، فإنه من المستحسن أن إدخال طريقة الكمي لتقييم ما جزء من البروتينات المعاد ومطوية بشكل صحيح. فحص وظيفي دقيق وبالتالي شرط أساسي لتطوير مراقبة نوعية جيدة لإعادة ناجحة.

3. تطبيقات اعادة تشكيل الحويصلات المحتوية على قناة

3.1. الدراسة الفنية للأنشطة القناة الايونية في الأغشية الدهنية السوداء.

إعداد نالمواد eeded.

  1. إعداد الدهون
    1. تنظيف الزجاج أنبوب اختبار، قارورة العنبر مع تفلون ظهرت كاب المسمار، ومجموعة من المحاقن الزجاجية مع الكلوروفورم. تجفيف قارورة العنبر تحت تيار من غاز الأرجون.
    2. نقل 0.75 ملغ البابا و0.25 ملغ POPG في الكلوروفورم في قارورة العنبر وتتبخر الكلوروفورم مع غاز الارجون.
    3. غسل الدهون المجففة مع 0.20 مل البنتان، وجاف تماما لإزالة كلوروفورم المتبقية. أخيرا حل الدهون في 50 ديكان ميكرولتر. سيتم استخدام الدهون في ديكان (20 ملغ / مل) لطلاء طبقة ثنائية الدهن عبر ثقب ميكرون 150-250 (الشكل 3B) حفر في الجزء ضعيفة في جانب واحد من طبقة ثنائية كأس التجريبية (الشكل 3A).
  2. إعداد الحل
    1. حل داخل الخلايا (العابرة): 10 مم HEPES / KOH، ودرجة الحموضة 7.4، 15 ملي بوكل
    2. حل خارج الخلية (رابطة الدول المستقلة): 10 مم HEPES / KOH، ودرجة الحموضة 7.4، 150 ملي بوكل
    3. الملح الجسر: ثني الزجاج الشعيرات الدمويةإلى جسور على شكل U، وملئها أجار المنصهر 1.0٪ الذائبة في حل خارج الخلية.
      تم العثور على التدرج التناضحي القائم بين الحلول العابرة وكومنولث الدول المستقلة إلى أن تكون القوة الدافعة الرئيسية للانصهار حويصلة على طبقة ثنائية الدهن 17. لالدهون سالبة الشحنة، تم العثور على 15 مم CaCl 2 أو موجبة الشحنة الببتيدات بولي أرجينين لتكون قادرة على حمل الأحداث الانصهار. ويمكن إدخال الدهون Fusogenic، مثل DOTAP والكلاب وغيرها، في الدهون الحويصلات بحيث فرصة من الأحداث الانصهار هو أعلى.

التسجيلات الكهربائية من قنوات KvAP في طبقات ثنائية الدهون

  1. قبل طلاء حفرة مستديرة (قطر ~ 0.25 مم) التي يتم حفرها على سطح أسطواني من الكأس طبقة ثنائية (الشكل 3B). يتم نقل الدهون مع مدقة الشعرية التي يتم إجراؤها في المختبر. رئيس جولة من مدقة الشعرية غير مصقول ولا تخدش سطح كوب. الوينتشر البريد كمية صغيرة من الدهون التي يحملها مدقة الشعرية حول الثقب في طبقة ثنائية الكأس، وتجفف في الهواء.
  2. الانتظار لمدة 1-2 دقائق حتى يتسنى للديكان سوف تتبخر تماما. وينبغي توخي الحذر لتجنب الحل الدهون من الوقوع في حفرة.
  3. إدراج الكأس الى غرفة تسجيل، ووضع في الجسور الملح وتوصيل الأقطاب الكهربائية إلى الجانبين من كأس تسجيل (الشكل 4A). إضافة لرابطة الدول المستقلة وعبر حل للجانبين من الحفرة. يتم تأسيس التدرج التناضحي لتسهيل اندماج الحويصلات إلى طبقة ثنائية المادة الدهنية.
  4. ضبط المحتملة الإزاحة بين الجانبين من الكأس إلى ~ 0 (عادة <2 الفولت). استخدام مدقة الشعرية لنقل كمية صغيرة من خليط الدهن في ديكان، وترسم الدهون عبر ثقب حتى أشكال غشاء طبقة ثنائية. تم الكشف عن تشكيل طبقة ثنائية من خلال تسجيل الحالي السعة أثناء تسليم نبض المنحدر.
  5. انتظر حتى الغشاءيخفف من وتصبح مستقرة نسبيا. علينا أن ننتظر حتى لم يعد هناك تغيير في السعة غشاء لمدة 3-5 دقيقة.
    في التفكير العام حول طبقة ثنائية مستو شكلت عبر ثقب كبير هو أن الجزء الأوسط جدا من الغشاء على مقربة من تكون ~ 4.0 نانومتر سميكة باعتبارها طبقة ثنائية منتظمة، والغشاء تصبح أكثر سمكا عندما يحصل على مقربة من حافة الحفرة، حيث هناك بالطوق حول ومعظم المذيبات ديكان هو 18، 19. فلا مناص من أن هناك ديكان المتبقية في الجزء طبقة ثنائية المركزي للغشاء. وكان تقدير الماضية من نسبة حجم N-ديكان مقابل PC 0،35-0،45 بعد ترقق طبقة ثنائية 18، 20-22. EM أظهرت دراسة طبقة ثنائية ضعفت أن هناك عدسات ديكان تقع بين اثنين من المنشورات من طبقة ثنائية 22. اقترح هذه البيانات إلى أن بروتينات الغشاء إدراجها في أغشية طبقة ثنائية المادة الدهنية تتعايش مع جزر صغيرة (تصل إلى 50 نانومتر في القطر) من ديكان. وديكان المتبقية طن طبقة ثنائية أيضا يقلل من قدرة كهربائي مستمر إلى 0.4-0.5 المكثف / سم 2، والتي يمكن استخدامها للحصول على تقدير تقريبي لحجم طبقة ثنائية ضعيفة على أساس السعة المقاسة. طبقة ثنائية من 100 السعة الجبهة الوطنية يأتي من طبقة ثنائية الغشاء دائرية من ~ 180 ميكرون في القطر.
    لKvAP، فإن ديكان المتبقية لا ينتقص لها النابضة التي تعتمد على الجهد، وعلى الرغم من أن وظيفة قناة لم يتم دراستها بعناية في طبقة ثنائية الخالية من المذيبات. ظهرت نفس ليكون صحيحا لقنوات NaChBac والقنوات Kv1.2 إدراجها في BLMs 23. فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كان كبيرا اليسار تحول منحنى GV تقاس من قنوات Kv1.2 في طبقة ثنائية النسبية ديكان الدهنية للقنوات في البويضات لديها أي علاقة مع ديكان المتبقية 23. اعتمادا على الدهون المستخدمة في تشكيل طبقات ثنائية، وكمية من ديكان المتبقية في طبقة ثنائية قد تختلف. على سبيل المثال أفيد أن تشكيل مستو membr الدهونانيس من MGDG (أحادية galactosyl-مادة ال diacylglycerol) يتطلب ديكان، وربما يعود ذلك إلى الشقوق بين MGDG المخروطية يجري شغلها مع جزيئات ديكان. ما إذا كان ديكان المتبقية له آثار على البروتينات التي يتعين دراستها هي تجريبية بحتة، وهناك حاجة إلى اختبار تجريبي لمعرفة ما إذا كان وتأثير كبير أم لا.
  6. حالما يصبح غشاء مستقرة، واطلاق النار 0.5-1.0 ميكرولتر قناة التي تحتوي على حويصلات عن طريق وضع نهاية غرامة من طرف P2-ماصة الحق فوق الحفرة. تقع الحويصلات أسفل عبر الفتحة الى الجزء السفلي من الكأس.
    أثناء هذه العملية، حويصلات متعددة أصبحت تعلق على الغشاء عبر ثقب. تعطى وقتا كافيا، وتنصهر في بعض جزء طبقة ثنائية بحيث يمكن لعدد قليل من القنوات KvAP يتم إدخالها بشكل صحيح في طبقة ثنائية مستو في جزء من مركز الغشاء. كلا التدرج التناضحي والتفاعل كهرباء مهمة في اندماج الحويصلات في طبقات ثنائية الدهون 17، 24.
  7. لاختبارالقنوات KvAP في طبقة ثنائية، يتم تسليم نبضة قصيرة من 80 بالسيارات من المحتمل عقد -80 بالسيارات. ويرد يرجع ذلك إلى تعطيل سريع والتعافي البطيء من تعطيل، فاصل زمني طويل (~ 120 ثانية للقنوات في PE / PG الأغشية) بين اثنين من البقول. وأظهر تسجيل الحالي نموذجي من القنوات في بابا / POPG الغشاء في الشكل 3C. إذا كان التيار هو صغير، واطلاق النار أكثر الحويصلات. مرة واحدة الحالي تبدو جيدة في الحجم، وتحقيق التوازن في تركيزات أيون في الحلول على جانبي الغشاء. القنوات مستعدون للتجارب الكهربية.

3.2. الكشف عن بروابط التشكل محددة ضد القنوات في الحويصلات

  1. مقدمة من المكتبة فج-المعروضة.
    -عرض فج مكتبة الببتيد 20 مير موجود في N-محطة من خمس نسخ من البروتينات PIII في نهاية واحدة من البكتيريا الخيطية FD-25 تيت. يعرض مكتبة تقريبا. 1 × 10 8 تختلفأنواع والأنف والحنجرة من عشوائية 20 مير متواليات الببتيد، وقدمت التكرم لنا من قبل معمل د. Kathlynn براون في مركز ساوث ويسترن الطبي UT 26. إصابة فج في E. القولونية K91 يجعل البكتيريا المقاومة إلى 12 ميكروغرام / مل التتراسيكلين.
    A إجراءات مفصلة لثقافة البكتيرية، وقد وصفت التضخيم وtitering من فاجات وتعاقب من المستعمرات فج من قبل ماغواير، وآخرون. 26 وسنقدم وصفا موجزا للعمليات الأساسية في القسم التالي. يمكن للقراء العثور على مزيد من التفاصيل في ورقة ماجواير. وسوف نركز بدلا من ذلك على عزل الحيوانات المستنسخة المحددة التي تربط بإحكام على القنوات الأيونية تشكيلها في حويصلات (الشكل 4A).
    الفكرة الأساسية وراء الشاشة لدينا هو أن فاجات منضمة إلى قنوات المعاد على وجه التحديد يمكن أن يتم سحبها إلى أسفل مع الحويصلات. وفج منضم يمكن تضخيمها واختبارها ضد القنوات في الأغشية الدهنية. لدينا دراسةالتغييرات متعلق بتكوين أجهزة الاستشعار الجهد KvAP في الأغشية الدهنية المختلفة 8 أظهرت أنه من الممكن للحفاظ على أجهزة استشعار الجهد في ولايات "يستريح" إما "تنشيط" أو عن طريق تحويل الدهون من الدهون الفوسفاتية العادية لتلك التي لا تحتوي على الفوسفات في مناطق headgroup (DOTAP والكلاب في التجارب لدينا). وتستخدم هذه اثنين من التشكل الدهون محدد في منطقتنا فحص بروابط التشكل محددة. سوف يكون أول مشبعة مكتبة فج من قبل القنوات في الحويصلات فوسفورية (اختيار السلبي) قبل اختياره لدنة ضيق إلى القنوات في DOTAP والكلاب الأغشية (اختيار إيجابية).
  2. الإجراءات الأساسية وراء اختيار فج
    نمو K91 البكتيريا في المتوسط ​​LB: الساعة تضاعف البكتيريا في حوالي 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الهز 200 دورة في الدقيقة.
    التضخيم من المكتبة: تخلط الحل فج مع البكتيريا K91 في OD0.4. بعد 15 دقيقة الحضانة عند 37° C، وتنتشر بالتساوي على مخاليط -9.5 × 9.5 بوصة 2 لوحات أجار التي تحتوي على 12 ميكروغرام / مل التتراسيكلين، واستعمال لوحات كبيرة يمنع هيمنة الثقافة عن طريق البكتيريا التي لديها أعلى معدل نمو. مرة واحدة على تنوع المكتبة أصغر، وتستخدم 10 سم أطباق بتري لاختيار والتضخيم على نطاق صغير.
    التضخيم على نطاق واسع من الحيوانات المستنسخة الفردية: تلقيح قسامة صغيرة من فاجات (~ 100 ملايين) في 250 مل LB بالإضافة إلى 5 ملي MgSO 4 و 12 ميكروغرام / مل التتراسيكلين، تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. جمع الخلايا بواسطة 6،000 دورة في الدقيقة تدور لمدة 10 دقيقة. جمع طاف وإضافة الى ذلك 0.2 المجلد / المجلد المخزن المؤقت التساقط (2.5 M كلوريد الصوديوم، و 20٪ PEG8000). بعد مرور فترة الحضانة على الجليد لمدة 1.0 ساعة، أجهزة الطرد المركزي الحل في 17،000 XG لمدة 30 دقيقة لتكوير جميع فاجات. إزالة كافة طاف، إضافة 1.0 مل PBS، واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة، resuspend بلطف بيليه (لا vortexing ل). نقل تعليق إلى أنبوب جديد، والطرد المركزي في 14،000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. طاف لنقل أنبوب آخر، واحتضان في 65 ° C حمام الماء لمدة 15 دقيقة لقتل جميع البكتيريا. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب لمدة 2 دقيقة في 13،000 دورة في الدقيقة. تجاهل بيليه، قسامة وتخزينها الحل فج في -80 درجة مئوية.
  3. بالغسل من فاجات ضد قنوات KvAP في حويصلات الدهنية.
    1. في حاجة إلى فاجات الببتيد عرض ليتم تضخيمها وtitered قبل تجاربنا حتى أن عدد فاجات لكل وحدة حجم هو معروف. أعيد KvAP إلى البابا / POPG (3:1)، بالإضافة إلى 0.50٪ الحويصلات البيوتين-DOPE كما سيطرة سلبية، وإلى الكلاب: البيوتين DOPE (199:1؛ وقد تم نفس الشيء بالنسبة DOTAP حويصلات) يستخدم كهدف الاختيار. تركيز النهائي من KvAP في حويصلات هو 0.50 ملغ / مل، والدهون هي 5.0 ملغ / مل. الواردة المخزن المؤقت بالغسل 500 ملي بوكل، HEPES 100 ملم / KOH درجة الحموضة 7.4، و 0.10 ملغ / مل BSA.
      لتعرض لأول مرة، كانت مخففة ~ 10 10 فاجات (100 نسخة لكل نوع) إلى 0.050 مل المتوسطة LB. للخطوات اللاحقة بالغسل، وسانتتم تعديل arting فج أن يكون في حدود 10 يونيو - 10 أغسطس.
    2. اختيار السلبية:
      احتضان فاجات المخفف في 50 LB ميكرولتر مع 100 ميكرولتر NeutrAvidin الخرز الاغاروز (قادرة على ملزم 1-2 ملغ البيروكسيديز BSA لكل مل من راتنج؛ بيرس) في 1.0 مل بالغسل العازلة. بعد 10 دقيقة الحضانة، وفصل حبات من قبل الغزل لهم في 100 x ج لمدة 1.0 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين لإزالة أي فاجات التي تربط مباشرة إلى الخرز.
      مزج اليسار أكثر فاجات من الخطوة السابقة مع 50 ميكرولتر حويصلات فارغة (البابا / POPG بالإضافة إلى 0.5٪ البيوتين DOPE) التي لا تحتوي على البروتينات. إضافة 100 ميكرولتر الخرز NeutrAvidin التي تم غسلها مع المخزن المؤقت بالغسل إلى خليط فج-حويصلة. بعد الدورية الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، وإزالة الخرز التي تدور 100 x ج لمدة 30 ثانية. يتم تكرار هذه الخطوة لحويصلات فارغة من الكلاب: البيوتين DOPE (199:1)، وكذلك للقنوات KvAP في البابا / POPG حويصلات (مع 0.5٪ البيوتين DOPE). طاف بعد هذه العلاجات إحتوىنانوثانية في فاجات-تطهيرها بالكامل. بعد المرحلتين الأولى الشاشة اثنين، يمكن أن يؤديها على تصريح مسبق فقط ضد KvAP في البابا / POPG الحويصلات.
    3. اختيار إيجابية
      احتضان فاجات-تطهيرها بالكامل مع قنوات KvAP في الكلاب: البيوتين DOPE (199:1) حويصلات (الشيء نفسه بالنسبة للحويصلات DOTAP) في ظل وجود 100 حبات NeutrAvidin ميكرولتر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. تبرزي حجم من الخليط إلى 15 مل باستخدام العازلة بالغسل قبل الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 10 دقيقة. جمع حبات، وغسلها ثلاث مرات مع 45 مل العازلة بالغسل.
    4. resuspend والخرز في 500 ميكرولتر المتوسطة LB تحتوي على 5.0 ميكروغرام / مل البيوتين، واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين من أجل الإفراج عن بعض فاجات متجهة من NeutrAvidin، التي لديها تقارب أقل من البيوتين الأصلي. فصل حبات ب 100 تدور x ج لمدة دقيقة واحدة. جمع طاف والخرز في اثنين من أنابيب مختلفة لtitering.
    5. لتضخيم فاجات المختارة، متاسعا 200 ميكرولتر من طاف أو الخرز معلق في الخطوة الأخيرة مع 500 ميكرولتر K91 ثقافة البكتيرية (OD600 ~ 0.4-0.6، مثقف ~ 4 ساعات قبل استخدامها). بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، لوحة 50 ميكرولتر من كل على لوحات التتراسيكلين للثقافة بين عشية وضحاها.
      خلال الدورتين الأولى الشاشة اثنين (الشكل 4A)، وجمع كل 500 ميكرولتر طاف وحبات من الخطوة الأخيرة، مزجها مع 5 مل ثقافة البكتيريا، ومنها لوحة في لوحات 9.5 بوصة مربعة من أجل استرداد وتضخيم كل المستعمرات فج . هذه الخطوة مهمة لاستعادة تلك فاجات التي تجعل البكتيريا تنمو أبطأ من غيرها.
    6. وتتضخم المستعمرات من لوحات وtitered قبل الدورة القادمة للبالغسل واختيار (انظر ماغواير، وآخرون، 26).
    7. دراسة أنشطة فاجات اختيارها إيجابا على القنوات.
      بعد 10-12 دورات من الاختيار، واختبار مجموع فاجات تضخيمها على القنوات KvAP في بيلا الدهونyers أدلى البابا / POPG. إذا كان هناك جزء كبير من الحيوانات المستنسخة إيجابية، ينبغي أن فاجات المختارة في 100-500 نانومتر منع جزء كبير من القنوات في طبقة ثنائية (الشكل 4B) كما كنا ضد اختيار قنوات استقرت في حالة الراحة. وتشير البيانات إلى أن هناك إيجابية الحيوانات المستنسخة التي سوف تظهر ملزمة قوية للقنوات في حالة الراحة. بعد 16 دورات من الاختيار، اختيار 50 المستعمرات إيجابية للالتسلسل مستعمرة واحدة. يتم اختيار حددت الهيمنة استنساخ فج من المقارنة بين متواليات، وتتضخم واختبارها ضد قنوات في طبقات ثنائية. مرة واحدة يتم تأكيد استنساخ إيجابية، توليف الببتيدات التي تحملها الحيوانات المستنسخة إيجابية قوية واختبارها على القنوات وكذلك لتأكيد أنشطتها التشكل محددة.

3.3. تبلور من القنوات KvAP في الأغشية لتحديد هيكل 27-29

  1. لتحقيق الاستقرار في التشكل منالقناة، الموثق التشكل محددة للقناة، 33H1 اناث البروتين، ويستخدم لتشكيل مجمع KvAP / اناث. هو مفصل في إعداد البروتين اناث الإطار 2. تنقية معقدة في العمود Superdex 200. وelutes المعقدة في جميع أنحاء 11.4 مل في نظامنا.
  2. للعرض على الشاشة الأولي، خلط البروتين مع DMPC أو POPC التي يتم solubilized تماما في DM أو β-OG. خليط من البروتين / الدهون / المنظفات هي مختلطة لأكثر من 15 ساعة من أجل التوصل إلى التوازن الحرارية في توزيع المكونات الثلاثة بين المذيلات المختلطة. عادة نحن أول اختبار ثلاث نسب الدهون / البروتين مختلفة (LPR = 0.5، 1.5، 2.5) وثلاث مستويات الحموضة مختلفة (6.0، 7.0، و 8.0). يحتوي المخزن المؤقت لغسيل الكلى 20 ملي العازلة K-الفوسفات، و 100 ملي بوكل، و 3.0 ملي NaN3. يتم تغيير العازلة غسيل الكلى كل 2-3 أيام. تؤخذ قسامة صغيرة من بلورات خارج كل 2-3 أيام لبحث تشكيل الحويصلات وظهور ممكن من شعرية البلورية.
    قائمة التابلويدمن LPR ويستخدم مقابل درجة الحموضة لتحديد سلوك هذا البروتين في نوعين مختلفين من الدهون. نحن نريد الحصول على حويصلات كبيرة الحجم نسبيا (أكثر من 150 نانومتر) أو صفائح الغشاء عندما يتم فحص عينات غسيل الكلى بواسطة السلبية وصمة عار EM. نمط منتظم صغيرة في الأغشية يشير إلى وجود ضرب وسيتم استخدامها لتوجيه مزيد من التحسين.
    EM السلبية وصمة عار: شبكات النحاس المغلفة مع الأفلام الكربون (~ 3-5 نانومتر سميكة) وتوهج في تصريفها في الهواء لجعل سطح الكربون ماء. يتم تحميل وحدة تخزين صغيرة (2-3 ميكرولتر) من التعليق بلورات على سطح الكربون، والمحتضنة لمدة 0.5-1.0 دقيقة. وصمة عار على شبكات من الجانب مع حافة ممزقة قطعة من ورق الترشيح هتما # 4. الوجه شبكة واحتضان لمدة 15 ثانية ~ على الجزء العلوي من قطرة من 150 ميكروليتر حل تلطيخ (2.0٪ PTA / KOH، ودرجة الحموضة 8.0 في المياه بالإضافة إلى 0.5٪ طرهالوز، أو 6.0٪ الأمونيوم كربونات / KOH، pH6.3-6.5 ، في المياه بالإضافة إلى 0.5-1.0٪ طرهالوز). وصمة عار أكبر قدر ممكن الحل من tكان سطح الشبكة، والسماح للشبكة لتجف قبل إدخاله في TEM للفحص. تؤخذ الصور من الحويصلات تحت شرط جرعة منخفضة لتفادي الضرر من أي التعبئة البلورية من الإلكترونات.
  3. ثم يتم توسيع الشاشة لدراسة الخطوات أصغر من LPR من أجل التوصل إلى LPR الصحيح. إذا كانت البروتينات هي مناسبة لتبلور، شعرية صغيرة من البروتينات في أغشية قد تصبح مرئية. للتغلب على هذه الظروف الأولية، زيادة الاستخدام الأمثل للتبلور من خلال تغيير أنواع الملح وتركيز، ودرجة الحرارة، وسرعة والطرق لإزالة المنظفات، الكاتيونات ثنائي التكافؤ، والمنظفات المستخدمة في إعداد البروتينات، مسببات، وتكوين الدهون الخ
    بلورات 2D الأمثل من KvAPΔ36/Fv معقدة تنمو لتصبح ورقة الكبيرة التي تتراوح من بضعة ميكرونات إلى 20-30 ميكرون (الشكل 5A). في ظل ظروف cryoEM، وتظهر بلورات شعرية مربع واضح مع واضحة تماثل أربعة أضعاف ما كان متوقعا من أربعة أضعاف متماثل تشانNELS (الشكل 5B و C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوصف تدفق العام للتجارب لتنقية قناة KvAP إلى التجانس البيوكيميائية في الشكل 1A. وأظهرت عينات نموذجية خلال التعبير وتنقية هذا البروتين في هلام SDS-PAGE في الشكل 1B. البروتين بعد تنقية إيماك هو محض نسبيا. العائد من قناة KvAP حوالي 1.0 ملغ / ليتر الثقافة.

الانحلالية من حويصلات الدهنية مع المنظفات يحتاج إلى أن عملت بها لكل زوج من الدهون مقابل المنظفات. يتم تقديم الانحلالية من حويصلات صغيرة unilamellar البابا / البابا بواسطة DM في الشكل 2A، فإن النتائج من تعويم حويصلات عادة ما تكون اضحة إلى حد ما. وأظهرت نتائج نموذجية في مقايسة SDS-PAGE من الكسور من التدرجات في الشكل 2B. في التدرج كثافة السكروز، وتحتوي على قنوات البابا / POPG حويصلات عادة تتركز في واجهة بين طبقة إلى 10٪د طبقة٪ 35. وتحتوي KvAP-DOTAP والكلاب الحويصلات هي أخف وزنا وعادة ما تكون في واجهة توين 5٪ و 10٪ (اخترقت قليلا في طبقة 10٪). إذا كان هناك جزء كبير من الحويصلات الصفاحات، فإنها عادة ما تكون بيضاء وتتركز تحت واجهة 10-35٪. وجدنا أن هذا يحدث عادة عندما لم حضنت الخليط البروتين المنظفات الدهنية طويلة بما فيه الكفاية للوصول إلى توزيع جيد من الدهون.

وتظهر التسجيلات الكهربائية من قنوات KvAP إدراجها في طبقات ثنائية الدهون مستو في الشكل 3. يظهر التتبع الحالي النموذجية التي في -80 بالسيارات، وقنوات هادئة. التحول إلى +80 بالسيارات يؤدي إلى ذروة السعة السريع (واحد حاد في وقت تبديل الجهد). A بطيئة مرحلة ارتفاع الحالي يوحي بأن قنوات تصبح نشطة وقادرة على إجراء الحالية البوتاسيوم إلى الخارج. بعد ذروة مرحلة الارتفاع، ويبدأ في الانخفاض الحالي، وهي خطوة اسمه تعطيل. وinactivatiعلى يستغرق بضع مئات من ميلي ثانية لإكمال. مرة يتم فيها تشغيل التيار الكهربائي مرة أخرى إلى -80 بالسيارات، هناك مرحلة العودة بعد ذروة السعة الهبوطي، مما يعكس الختامي للقنوات المفتوحة ويسمى التعطيل (الشكل 3C).

في منتصف الشاشة فج، اختبرنا نشاط فاجات تضخيمها على القنوات KvAP في طبقات ثنائية البابا / POPG. بعد 12 دورات الاختيار، وتحول دون فاجات تضخيم أنشطة قناة (الشكل 4B، فج مختارة). إلا أن فج-عرض مكتبة بدءا لا تظهر أي تأثير على القنوات (الشكل 4B، ومراقبة فج). على الرغم من أن أنشطة فاجات المختارة لم تكن عالية جدا، لأن فقط على تركيز منخفض من فاجات إيجابية كانت حولها، واقترح واضحة، والآثار استنساخه أن هناك، استنساخ الإيجابية النشطة التي تظهر تقارب ملزم عالية، وينبغي إثراء انتقائي خلال المتبقية قبرصي الفرزتقييمات مؤسسية ومرة ​​واحدة المخصب، من المحتمل أن يكون الأنشطة المثبطة قوية على القنوات في الأغشية.

في مرحلة مبكرة من فحص بلورات 2D، رأينا المشابك الصغيرة في العديد من حويصلات صغيرة. مع التحسين، وأظهرت بعض أوراق كبيرة مع الكثير من حويصلات صغيرة حول (الشكل 5A). الصور cryoEM من هذه البلورات أظهرت دائما الكثير من العيوب المحلية (الشكل 5B)، مما يشير إلى أن مزيد من التحسين هو مطلوب للحصول على بلورات أفضل. مرة واحدة في البلورات وأمثل بشكل جيد، فإنها أظهرت حواف حادة، ويبدو كما أوراق منفصلة. في التكبير عالية، فمن الواضح أن كثيرا أمرت الوحدات الفردية أفضل (الشكل 5C).

اسم الكاشف / المواد شركة رقم الكتالوج تعليقات
تريبتون RPI كورب T60060
خلاصة الخميرة RPI كورب Y20020
كلوريد الصوديوم الصياد S271-3
تريس قاعدة RPI كورب T60040
كلوريد البوتاسيوم الصياد BP366-500
N-دوديسيل-β-D-مالتوزيد [أفمتريإكس] D322S سول الصف
N-الأوكتيل-β-D-غلوكوزيد [أفمتريإكس] O311 انا في الصف
أبروتينين RPI كورب A20550-0.05
Leupeptin RPI كورب L22035-0.025
Pepstatin A RPI كورب P30100-0.025
PMSF P7626
الدناز أنا روش 13407000
الحيوي الخرزة SM-2 بيو راد 152-3920
HEPES RPI كورب H75030
البابا أفانتي الدهون القطبية 850757C
POPG أفانتي الدهون القطبية 840457C
DOGS أفانتي الدهون القطبية 870314C
DMPC أفانتي الدهون القطبية 850345C
البيوتين DOPE أفانتي الدهون القطبية 870282C
DOTAP أفانتي الدهون القطبية 890890C
NeutrAvidin الآغاحبات روز Piercenet 29200
أنابيب غسيل الكلى الطيف المختبرات، وشركة 132-570
البنتان الصياد R399-1
ديكان أمريكا جزر تركس وكايكوس D0011
MTS-PEG5000 تورونتو كيماويات البحوث M266501

الجدول 1. قائمة الكواشف والمواد.

  • ثقافة البكتيرية يهز حاضنة
  • مقياس الطيف الضوئي
  • الصغرى التحقيق sonicator
  • المهزة
  • أجهزة الطرد المركزي من الأرض نموذجية لجمع الثقافة البكتيريا وللعينات التركيز
  • أعمدة فارغة
  • Superdex 200 عمود متصلا نظام FPLC

الجدول 2. هناك حاجة إلى معدات.

اسم العازلة محتويات
العازلة تحلل IMAC 50 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 100 ملي بوكل
العازلة غسل IMAC 50 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 100 ملي بوكل، و 5.0 ملي DM
شطف العازلة IMAC 50 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 100 ملي بوكل، 5.0 ملي DM، و 300 ملي إيميدازول
العازلة عينة SDS-(5X) (امختزل) 60 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 6.8)، 25٪ الجلسرين، 2.0٪ SDS، الأزرق برموفينول 0.10٪. (1.0٪ إضافة 2 المركابتويثانول لجعل المخزن المؤقت الحد).
التراص العازلة جل لSDS-PAGE (4X) 0.50 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 6.8)، 0.40٪ SDS
هلام العازلة قرار لSDS-PAGE (4X) 1.5 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.8)، 0.40٪ SDS
FPLC equilibحصة 20 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 100 ملي بوكل، و 5.0 ملي DM
غسيل الكلى الحويصلية 10 HEPES ملي و 100 ملي بوكل

الجدول 3. اسم العازلة ومحتويات.

الشكل 1
الشكل 1. إعداد KvAP لإعادة. A. تدفق العمل العام من البروتين التعبير وتنقية وإعادة. B. تنقية بيوكيميائية من البروتين. ثقافة الناجم عن E. تمت معالجة القولونية XL1 أزرق KvAP التعبير وKvAP تنقيته. عشرين ميكرولتر من الثقافات الخلية قبل (حارة 1) أو بعد (حارة 2) الاستقراء، واستخراج المنظفات (حارة 3)، التدفق من خلال اللوني من إيماك (حارة 4)، وهما غسل الخطوات (الممرات 5.6)، و 5.0 ميكروغرام من مجموع البروتين بعدوتعرض 300 ملي إيميدازول شطف (لين 7) و 5.0 ميكروغرام من KvAP tetramer من حجم الاستبعاد FPLC (حارة 8) لعدم تخفيض 12٪ SDS-PAGE وCoomassie الأزرق تلطيخ.

الشكل 2
الشكل 2. إعادة تشكيل KvAP في البابا / POPG الحويصلات. A. الانصهار الحويصلة والانحلالية بوصفها وظيفة من تركيز المنظفات. وقد استخدم الامتصاصية في 410 نانومتر لرصد تشتت الضوء من حويصلات (طرح خط الأساس إلى ما لا جزء المنظفات). وكانت نسبة الدهون (البابا / POPG 3:1) 10 ملغ / مل. الحويصلات unilamellar صغيرة بعد صوتنة قوية، وmonodispersed ولديه ضعف تشتت بسبب أحجامها من 30-50 نانومتر في القطر. عندما أدخلت المنظفات، فهي موزعة بين مرحلة الحل والمرحلة الغشاء الدهني. ونظرا لانحناء قوي في الصغيرة حويصلات unilamellar، وأدخلت المنظفات الزناد الانصهار الحويصلة والإفراج عن انحناء (وبالتالي انخفاض الطاقة الكامنة السطح). الحويصلات تنصهر هي أكبر في الحجم وتظهر نثر أقوى في 410 نانومتر. وبالتالي يعكس مرحلة ارتفاع ذروة (منطقة رمادية اللون) والانصهار المنظفات التي يسببها، نظام جيد للبروتين مذيلة الانصهار إلى الحويصلات. تركيز المنظفات (DM كمثال هنا) الحق في ذروة امتصاص تم اختياره بالفعل لعملية إعادة لدينا. B. الخمسون ميكرولتر من الحويصلات KvAP المعاد (KvAP 0.5 ملغ / مل) تم مفصولة السكروز التدرج الكثافة. تم فحص عينات من 100 الكسور ميكرولتر من أعلى إلى أسفل (1 ~ 9) من السكروز التدرج في تخفيض 12٪ SDS-PAGE. كان الجل الأزرق Coomassie الملون. لين 3 الوارد ~ 2 ميكروغرام KvAP.

/ files/ftp_upload/50436/50436fig3.jpg "/>
الشكل (3). النشاط الكهربائي من قناة KvAP في طبقات ثنائية المعاد. A. تسجيل مجموعة المتابعة داخل قفص فاراداي، 1؛ قطبين، 2؛ الجانب غير المشبعة، 3؛ الجانب رابطة الدول المستقلة، 4؛. جسر الملح B. تضخيم قسم من الجزء ضعفت في جانب واحد من كوب طبقة ثنائية تبين وجود ثقب 5 ، والذي يستخدم لصنع أغشية. تم تسجيلها C. النشاط الكهربائي من القنوات KvAP التي تنصهر في غشاء الدهون السوداء. بينما كان محتجزا في -80 بالسيارات، ونابض غشاء المحتملة إلى 80 بالسيارات لمدة 150 ميللي ثانية، ومن ثم إعادتها إلى إمكانية عقد. وسجلت الحالية الأيونية في وضع الجهد المشبك باستخدام مكبر للصوت 200B Axopatch.

الشكل 4
الشكل 4. الكشف عن conformatiبروابط على الخاصة من مكتبة فج-المعروضة. A. مخطط وراء الفحص ضد القنوات الأيونية تشكيلها في الحويصلات. ومخدر الحويصلات مع البيوتين المخدر، وأنها يمكن أن تكون انسحبت من حل عن طريق الخرز NeutrAvidin. يتم التحكم في التشكل من قناة KvAP بواسطة الدهون محددة. تتم الاختيارات السلبية ضد الخرز، حويصلات فارغة والحويصلات مع قنوات في التشكل مختلفة قبل أن يتم تحضين فاجات مع قنوات في الدولة بتكوين جزئي الهدف (في DOTAP والكلاب كمثال هنا). وفاجات المختارة يمكن تضخيمها واختبارها ضد قنوات في طبقات ثنائية. B. اختبار فاجات المحدد في منتصف الشاشة. النشاط الكهربائي من KvAP في طبقة ثنائية في نقاط زمنية مختلفة بعد إضافة للفاجات المختارة: أثر أسود - قبل إضافة؛ التتبع أصفر - 2 دقيقة بعد؛ التتبع الحمراء - 10 دقيقة بعد إضافة الأعلى: مكتبة فج البداية (المجموع. ~ 10 10 فاجات أضافإلى طبقة ثنائية) تم اختباره على القنوات في طبقة ثنائية، وعثر لديهم اي نشاط يمكن كشفها لأن كل استنساخ فج لديه سوى حوالي 100 نسخة القاع: بعد 12 دورات التحديد، كانت لا تزال فاجات خليط من الحيوانات المستنسخة مختلفة. مضيفا حوالي 10 10 فاجات إلى القنوات في الصدارة طبقة ثنائية إلى تثبيط واضح لنشاط القناة، مما يدل على أن هناك استنساخ الإيجابية التي يجب أن يكون تقارب عالية. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 5
الشكل 5. تبلور ثنائي الأبعاد من KvAP في الأغشية. A. صورة سلبا الملون طبقة واحدة بلورات 2D في منتصف الأمثل وضوح الشمس. كانت ملطخة بلورات مع 6.0٪ الأمونيوممولبيدات، ودرجة الحموضة 6.4 زائد 0.50٪ طرهالوز. ويرجع ذلك إلى السكر، وأنها مكدسة في بعض الأحيان مع بعضها البعض. مربع مربع أسود يعين منطقة التي تؤدي إلى نمط حيود التي تظهر على الجانب الأيمن مع وجود بقع الحيود الذهاب الى ~ 20 أ. B. صورة CryoEM من الكريستال 2D من عينة مماثلة لتلك المستخدمة في (A). كانت مختلطة مع العينة 3٪ طرهالوز والتي جمدتها تغرق المباشر، وتصوير تحت cryoEM. تم الحصول على صورة في 50،000 X. وكان واضحا أن هناك عيوب المحلية في التعبئة والتغليف وضوح الشمس. C. CryoEM صورة لمزيد من الكريستال الأمثل. كان جزءا لا يتجزأ من العينة في 0.75٪ التانين و 10٪ طرهالوز وتم التقاط الصورة في 50،000 X. وخطوط مستقيمة والتعبئة ضيق اقترح أن القنوات أمرت جيدا في هذا النوع من البلورات. السهام السوداء اثنين بمناسبة شعرية مربع.

صناديق:

الإطار 1. إعداد عمود IMAC

  1. Resuspend والراتنج IMAC بدقة.
  2. نقل على الفور على الكمية المطلوبة من الراتنج في التعليق إلى أنبوب مل 50. نحن نستخدم 2 مل حجم السرير من الراتنج لتنقية KvAP من 2 L الثقافة.
  3. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب في 700 x ج لمدة دقيقتين لبيليه أسفل الراتنج.
  4. إزالة وتجاهل طاف.
  5. إضافة 10 مجلدات سرير من MQH 2 O وخلط لفترة وجيزة لشطف الراتنج.
  6. Recentrifuge في 700 x ج لمدة 2 دقيقة لتكوير أسفل الراتنج. تجاهل طاف.
  7. إضافة 10 مجلدات سرير من MQH 2 O وتصب في عمود فارغ.
  8. انتظر حتى يستقر الراتنج أسفل، وإغلاق العمود مع محول تدفق للضغط منخفض اللوني السائل.
  9. تشغيل 5 وحدات التخزين السرير من MQH 2 O و 5 مجلدات السرير من العازلة موازنة من خلال العمود.

الإطار 2. تنقية اناث

FV التحول - يوم 1

  1. تحول100 نانوغرام من البلازميد التي تحتوي على FV-صاحب 6-60 ميكرولتر من الخلايا JM83 المختصة، لوحة البكتيريا على أربع لوحات LB-أجار تحتوي على 100 ​​ميكروغرام / مل الأمبيسلين، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية الحاضنة.
  2. إعداد 6 X 1 L LB للثقافة البكتيرية.

التعبير عن اناث - يوم 2

  1. الغاء جميع المستعمرات من لوحات في المتوسط ​​LB. أضف هذا التعليق من البكتيريا إلى 6 X 1 L LB في حضور الأمبيسلين (100 ملغم / لتر)، واحتضان حتى OD600 تصل إلى 0.5.
  2. عندما تصل إلى 0.5 OD، وانخفاض درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية، ودورة في الدقيقة إلى 115. عند انخفاض درجة الحرارة إلى ~ 20 درجة مئوية، إضافة anhydrotetracycline (100 ميكرولتر من 1mg/ml في DMF إلى 1 L) للبدء في تحريض تعبير البروتين واحتضان 5 ساعة أخرى عند 20 درجة مئوية مع الهز الطبيعي.
  3. البكتيريا الحصاد في 1 L زجاجة أجهزة الطرد المركزي في 4،000 x ج لمدة 15 دقيقة. من اجل الخروج من طاف قدر الإمكان. الحفاظ على البكتيريا التي تحصد على الجليد فيA 4 ° C الغرفة الباردة بين عشية وضحاها.

الافراج عن جزيئات اناث من البكتيريا - يوم 3

  1. Resuspend البكتيريا في 150 مل من FV-الافراج العازلة (50 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 20٪ سكروز، 1.0 ملم EDTA).
  2. مع التحريك مع شريط التحريك المغناطيسي، إضافة الليزوزيم إلى 0.1 ملغ / مل والحفاظ على البكتيريا على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، إضافة MgCl 2-2،0 ملم والحفاظ على الجليد لمدة 10-15 دقيقة أخرى.
  3. أجهزة الطرد المركزي في البكتيريا المعالجة في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. ينبغي أن spheroblasts البكتيرية يذهب كل وصولا الى بيليه، وأطلق سراح معظمهم من الجزيئات اناث في طاف.
  4. Dialyze طاف ضد 4.0 L من غسل العازلة (20 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 100 مم كلوريد الصوديوم) في غرفة باردة لمدة 4 ساعة على الأقل. في نهاية اليوم، لتغيير العازلة غسيل الكلى الطازجة وdialyze بين عشية وضحاها. ويرجع ذلك إلى السكروز في الحل، فإن حجم ديالة زيادة بنحو 50٪. الزائدة من أنابيب غسيل الكلى وينبغي أن تستخدم.

تنقية IMAC وFPLC - يوم 4

  1. تتوازن 10 مل حجم السرير من راتنج تنقية إيماك (انظر الإطار 1) مع المخزن المؤقت لغسيل الكلى في أنبوب 50 مل.
  2. نقل ديالة من الأنبوب، إضافة MgCl 2-10 ملم وزيادة حجم إلى 200 مل. خلط مع الراتنج قبل معايرتها واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  3. حزمة العمود فارغة مع الراتنج المحتضنة، ويغسل الراتنج مع 5 مجلدات سرير من غسل العازلة، تليها 5 مجلدات سرير من غسل العازلة مع 10 ملي إيميدازول و 30 ملي إيميدازول لكل منهما.
  4. أزل البروتين ملزمة مع 20 مل من غسل العازلة بالإضافة إلى 300 ملي إيميدازول.
  5. تشغيل اناث المركزة من خلال Superdex 200 عمود قبل معايرتها مع غسل العازلة. تجمع الكسور التي تحتوي اناث (قمم نموذجي يظهر في حجم الاحتفاظ 17.6 مل) معا والتركيز عليه. تحديد تركيز العينة باستخدام معامل الانقراض من اناث في 280 نانومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد استخدم إعادة تشكيل قنوات KvAP في الأغشية المختلفة في العديد من الدراسات 8-10. بعد فكرة ضمان توزيع الدهون بين المنظفات / الدهون المذيلات المختلطة والبروتين / المنظفات / الدهون المذيلات المختلطة، ونحن قادرون على الوصول إلى إعادة شبه كاملة من KvAP في الأغشية المصنوعة من الدهون مختلفة جدا. كل قناة KvAP رباعي القسيمات يحتاج ~ 100 جزيئات الدهون لتغطية كامل المجال عبر الغشاء لها. شرط أساسي هو السماح بما يكفي لصهر جزيئات الدهون في البروتين / الدهون / المنظفات المذيلات قبل أن يتم إزالة المنظفات. لدينا الظروف القياسية (0.5 ملغم بروتين والدهون 5.0 ملغ) ضمان أن هناك في المتوسط ​​~ 1،000 جزيئات الدهون في جزيء البروتين. وأكد لدينا تجربة الطرح والتجارب البيوكيميائية أن إعادة تشكيل كاملة تقريبا. التسجيلات الكهربائية من قنوات إدراجها في الأغشية الدهنية السوداء، والفرز من القنوات أعيد تشكيلgainst مكتبة الببتيد عرض-فج، ونمو بلورات 2D من القنوات في جميع الأغشية تدليل على التطبيقات الناجحة لإعادة غشاء لأغراض مختلفة.

التغييرات متعلق بتكوين التي تعتمد على الدهون من القنوات KvAP والفحص ضد مكتبة الببتيد عرض-فج عرض وسيلة جديدة للكشف عن حاصرات قناة أو قناة الفتاحات بالطرق الكيميائية الحيوية بدلا من الاعتماد على الكهربية للحفاظ على قنوات محددة في التشكل 8. النجاح في الشاشة لدينا لدنة التشكل محددة تشير إلى أن الاستراتيجية ذاتها يمكن تطبيقها للعثور على المجلدات المحددة للالتشكل تفعيلها. فمن المنظور أن القنوات المعاد في الحويصلات يمكن استخدامها ضد سلسلة واحدة المكتبات اناث، المكتبات فاب، الخ وبالمثل، يمكن أن البروتينات الغشائية الأخرى من خلال تشغيل هذه العمليات وتأمين المجلدات الخاصة الضيقة التي قد تكون مفيدة لأغراض مختلفة. ونحن نعتقد أن هذا NEسوف نرى طريقة ث المزيد من التطبيقات العامة في المستقبل.

ونظم غشاء المعاد تسمح توضيح من التفاصيل الكيميائية وراء آثار الدهون في غشاء البروتينات 11. وقد تفاعل دهون، بروتين يعرف أن تكون مهمة بالنسبة للعديد من بروتينات الغشاء، وتعرض لدراسات متعددة في الماضي 3. في الدراسات المستندة إلى الخلايا، ويمكن تنفيذ التلاعب لتغيير مكونات محددة في الأغشية ومن ثم ترتبط التغييرات الوظيفية في البروتينات الغشاء مع التغييرات الهيكلية والتركيبية في الأغشية. مثل هذه الاتصالات غير مباشرة ويمكن أن تنجم عن عوامل متعددة في أغشية الخلايا التي لا تتميز بشكل جيد. في غشاء متجانس المعاد، فمن أكثر تحديدا في إجراء اتصالات بين التغييرات الهيكلية والوظيفية للبروتينات الغشاء والتغيرات في تكوين الدهون وخصائص الغشاء. في نهاية المطاف، لفهم رانه مبادئ الكيميائية وراء التفاعل دهون، بروتين، ونحن بحاجة لتحديد توزيع الدهون حول المجال عبر الغشاء، وفهم التغيرات الدينامية من هذه الدهون بجانب البروتينات. نظام المعاد يبدو أن هناك طريقة يمكن الاعتماد عليها نحو هذا الفهم.

إعادة تشكيل بروتينات غشاء يتطلب إزالة للرقابة من المنظفات من البروتين / الدهون / المنظفات المذيلات المختلطة، والانصهار من المذيلات المختلطة الى الشركات الكبيرة التي تتحول في نهاية المطاف إلى حويصلات 30. ويجري استخدام ثلاث طرق مختلفة لإزالة المنظفات، غسيل الكلى، والخرز، وcyclodextrin 14، 31، 32. ولكن ما زال من الصعب تحقيق تسيطر عليها بشكل جيد، وإزالة تدريجية للمنظفات من الحجم الصغير 33 و 34. سيكون وسيلة مثالية لإزالة المنظفات اتخاذ منظفات للخروج من المرحلة المائية بالتساوي عبر وحدة التخزين بأكملها في وتيرة السيطرة عليها، ويجب ألا تمارس قوية تدخل Oن إعادة تشكيل الأغشية طبقة ثنائية. مثل هذا الأسلوب قد تكون قادرة على تغيير سرعة وفعالية إعادة، ومن المرجح أن تمكين إعادة في حجم صغير. قد مزيج من بطء تخفيف وأي من ثلاث طرق التقليدية لإزالة المنظفات الاقتراب من هذا الهدف. بطيئة التخفيف عن طريق إدخال كمية صغيرة من الماء إلى الخليط البروتين / المنظفات / الدهون هو وسيلة السيطرة عليها لتقليل بالتساوي تركيز المنظفات وصولا الى CMC لها. إزالة المنظفات هو بعد ذلك أقل أهمية لتشكيل حويصلة، وإن كانت لا تزال مهمة لاندماج الحويصلات الصغيرة إلى الكبيرة. طرق أخرى لتحقيق إزالة المنظفات التي تسيطر عليها لا تزال بحاجة إلى تصور وتطويرها.

يأخذ لدينا إجراءات إعادة النظر في توزيع الدهون بين المذيلات المختلطة والانصهار المنظفات التي يسببها من الحويصلات وكذلك المذيلات المختلطة. نجاحها يمهد الطريق المؤدية إلى طائفة واسعة من التطبيقات من صحويصلات econstituted، أكثر بكثير من الاتجاهات الثلاثة التي قدمناها. على التكيف الداخلي جهدنا لبروتينات غشاء الأخرى ينبغي أن لا تواجه الحد من التقنية الرئيسية. على الرغم من العديد من البروتينات الغشاء تم تشكيل طريقة واحدة أو أخرى، فقد كان من الصعب على قرب تحقيق إعادة كاملة وتقييم الأداء الوظيفي للبروتينات من وجهات نظر مختلفة متعددة. تشير جهودنا في إعادة KvAP أن طرقنا قد تسمح إعادة كامل وسوف تكون مناسبة لهذه الأغراض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقد حصل على دراسات في KvAP في المختبر جيانغ مساعدة كبيرة من رودريك ماكينون معمل د. في جامعة روكفلر. شكر خاص إلى الدكتور Kathlynn براون ومايكل McQuire للحصول على المشورة والمساعدة على التجارب بشاشة فج لدينا. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (GM088745 وGM093271 إلى Q-XJ) وAHA (12IRG9400019 إلى Q-XJ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone RPI Corp. T60060
Yeast Extract RPI Corp. Y20020
NaCl Fisher S271-3
Tris Base RPI Corp. T60040
Potassium Chloride Fisher BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside Affymetrix D322S Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinin RPI Corp. A20550-0.05
Leupeptin RPI Corp. L22035-0.025
Pepstatin A RPI Corp. P30100-0.025
PMSF SIGMA P7626
Dnase I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp. H75030
POPE Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
DOGS Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotin-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
NeutrAvidin agarose beads Piercenet 29200
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentane Fisher R399-1
Decane TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Cemicals M266501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Galand Science. New York. (2007).
  2. Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).
  3. Lee, A. G. How lipids affect the activities of integral membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).
  4. Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199 (1998).
  5. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269 (2004).
  6. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257 (2003).
  7. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. J. Vis. Exp. (20), e1033 (2008).
  8. Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel. Nat. Commun. 2, 250 (2011).
  9. Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444, 775 (2006).
  10. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, 180 (2003).
  11. Jiang, Q. X., Gonen, T. The influence of lipids on voltage-gated ion channels. Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884 (2012).
  12. Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).
  13. Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso. Eur. J. Biochem. 243, 798 (1997).
  14. Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal. Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179 (1990).
  15. Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase. Biophys. J. 72, 2545 (1997).
  16. Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).
  17. Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane. The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).
  18. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).
  19. Hanke, W., Schlue, W. -R. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. Biological Techniques. Sattelle, D. B. , Academic Press, Inc. San Diego. 133 (1993).
  20. Tien, H. T. Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. , Marcel Dekker, Inc. New York. 655-65 (1974).
  21. Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution. The Journal of Membrane Biology. 10, 11 (1972).
  22. Henn, F. A., Thompson, T. E. Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies. Journal of Molecular Biology. 31, 227 (1968).
  23. Tao, X., MacKinnon, R. Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers. J. Mol. Biol. 382, 24 (2008).
  24. Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes. The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).
  25. Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).
  26. McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands. Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).
  27. Rigaud, J. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).
  28. Chami, M., et al. Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins. J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).
  29. Kuhlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of membrane proteins. Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).
  30. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65 (2003).
  31. Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. J. Struct. Biol. 121 (2), 142 (1998).
  32. Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin. J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).
  33. Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).
  34. Iacovache, I., et al. The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife. J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).

Tags

علم الأحياء الجزيئية، العدد 77، الكيمياء الحيوية، علم الوراثة، علم الأحياء الخلوي، علم الأحياء الهيكلي، الفيزياء الحيوية، والدهون غشاء، الفوسفورية، البروتينات الحاملة، بروتينات الغشاء، المذيلات، البروتينات موتور الجزيئي وعلوم الحياة، والكيمياء الحيوية، الأحماض الأمينية، والببتيدات، والبروتينات، والدهون تفاعل البروتين، قناة إعادة، تبوب التي تعتمد على الدهون، قناة ايون الجهد بوابات، بروابط التشكل محددة، والدهون
إعادة تشكيل قناة كيلو فولت في الأغشية الدهنية للدراسات الهيكلية والوظيفية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang,… More

Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. J. Vis. Exp. (77), e50436, doi:10.3791/50436 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter