Summary
酵母线粒体类核蛋白质，Mgm101，是一种重组蛋白RAD52型，形成大低聚环。甲协议的描述以制备可溶性的重组Mgm101使用麦芽糖结合蛋白（MBP）标记加上阳离子交换和尺寸排阻色谱法策略。
Abstract
20年前被确定MGM101基因维护线粒体DNA中的作用。从几组研究表明，的Mgm101蛋白参与线粒体DNA的重组修复。最近的调查表明，Mgm101 RAD52型重组蛋白家族有关。这些蛋白质形成大的低聚环促进退火同源单链DNA分子。然而，表征阻碍了Mgm101的生产重组蛋白的难度。在这里，用于制备重组Mgm101的一个可靠的程序进行说明。麦芽糖结合蛋白（MBP）标签Mgm101的首先在大肠杆菌中表达。最初是由直链淀粉的亲和层析柱纯化的融合蛋白。在被释放后通过蛋白水解裂解，Mgm101从MBP分离，通过阳离子交换色谱法。然后单分散Mgm101是获得通过尺寸排阻色谱法。可以定期获得的产量为〜0.87毫克每升细菌培养Mgm101。该的重组Mgm101有DNA污染最小。对样品成功地用于生化，结构和单粒子图像分析Mgm101。此步骤也可用于制备其它大的低聚物的DNA结合蛋白，可能会被错误折叠的和细菌细胞毒性的。
Introduction
同源重组是非常重要的双链断裂的修复（DNA双链断裂）和链间交联，并从倒塌的复制叉1重新开始DNA复制。在常规的同源重组，中央的反应由ATP-依赖的重组酶RecA蛋白在原核细胞中，在真核生物中1-3的Rad51和Dmc1。这些重组酶形成核蛋白丝的单链DNA，这是必不可少的双链DNA模板（ 图1，左侧面板）4-7内发起同源搜索和钢绞线入侵。除了 常规的计划，同源重组也可以采取地方在RecA/Rad51-independent的方式（ 图1，右图）。例如，酵母的保守和Rad59蛋白质可以直接催化切除双链DNA断裂露出的互补单链DNA链退火。这个重组过程中，被称为唱乐链退火，一般不涉及同源配对的双链DNA模板。退火后，除去核酸外切酶的异源尾巴刻痕结扎以恢复基因组连续性8-10。常伴有直接重复区域之间的基因组序列缺失修复由单链退火机制。
RAD52属于普遍噬菌体11的重组蛋白质，是一个多元化的群体。这些蛋白质也被称为单链退火蛋白（会计实务准则），根据他们的活动在促进同源的单链DNA分子退火。最好噬菌体会计实务准则Redβ的的ERF从噬菌体λ噬菌体rac和葡激酶蛋白从噬菌体lactococcal UL36和P22，RECT。的会计准则结构其特征在于由一个典型的β-β-β-α倍，虽然相似，几乎检测不到能够在他们的主要序列。他们都形成大的同源寡聚体环10 - 14倍的对称性在体外 12-14。这一特点高阶的组织结构功能的影响还不是很清楚。
我们有兴趣了解线粒体基因组同源重组的机制。我们先前已经确定MGM101是必不可少的维护在酿酒酵母 15线粒体DNA的基因。MGM101后来发现线粒体拟核相关需要的耐受性线粒体DNA损伤剂16。然而，这项研究已Mgm101忍住在过去十年中的难度生产重组Mgm101。最近，我们已经成功地大量生产可溶性Mgm101在从E大肠杆菌使用的MBP融合策略。这使我们能够证明Mgm101股生化和结构的相似性与RAD52家族蛋白17,18。在这份报告中，三个步骤的纯化过程进行了描述，产生均匀Mgm101for的生化和结构分析（ 图2）。
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Protocol
以前的研究已经表明，第一个氨基末端的22个氨基酸残基的Mgm101裂解后，导入到线粒体19。对于在大肠杆菌中的表达，通过PCR扩增MGM101缺乏的前22个密码子的开放读码框放在男性的编码序列的表达载体pMAL-C2E的修改版本，麦芽糖结合蛋白（MBP）的下游。这会产生的MBP-Mgm101的的断前蛋白酶（ 图3）与一个连接器包含一个切割位点的融合。首次构建质粒选择E。大肠杆菌转化，而 不IPTG和的Xgal蓝色/白选择。将得到的质粒pMAL-C2E MGM101然后导入大肠杆菌大肠杆菌菌株BL21-CodonPlus（DE3）-RIL，选择氨苄青霉素和氯霉素抗性菌落。
1。表达，诱导，细胞裂解和DNase I处理
- 伊诺克ulate新鲜的转化体在10ml补充有葡萄糖（0.2％），氨苄青霉素（100微克/毫升）和氯霉素（50微克/毫升）的LB培养基（1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠）。在200转摇孵育在37°CO / N。
- 为2升与上述补充的LB培养基中，接种10毫升的预培养物。成长的细胞在37℃振荡，直到OD 600达到0.5。
- 通过加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），使最终浓度为0.3 mM，的MBP-Mgm101的融合蛋白的诱导表达。 5小时，在30℃振荡，细胞生长。
- 收集细胞，通过离心分离，用Beckman JA-10转子（5500×g离心，4℃下，10分钟）。后弃去上清，重悬细胞沉淀在30ml含有蛋白酶抑制剂亮抑蛋白酶肽（25μM，1μM的胃酶抑素A和1mM的PMSF）的裂解缓冲液（的的20mM Tris-HCl，pH值7.4和1mM EDTA，pH值7.4）。
- 超声细胞悬浮液，冰浴20秒使用超声波处理器（热系统，型号W-385），在占空比为50％时，允许在冰上冷却30秒，然后重复2倍。
- 添加1毫升DNA酶1股票在2毫克/毫升。细胞裂解液在4℃下摇动2小时。
- 调整的NaCl至终浓度为500 mM。
- 中取出的细胞碎片。在4℃下以10,000 xg离心30分钟。
2。与直链淀粉亲和层析纯化
- 平衡1.5毫升的裂解缓冲液中的直链淀粉树脂（50％浆液）。平衡直链淀粉树脂加入细胞裂解物。轻轻摇动4°CO / N
- 加载到Econo柱层析柱安装在冷室中的溶胞产物 - 树脂混合物。允许未结合的蛋白质，通过重力柱。
- 洗净，用300毫升的洗涤缓冲液I（的20mM Tris-盐酸，pH值7.4，400 mM氯化钠，1mM EDTA的溶液，pH值7.4和0.2mM的PMSF）的直链淀粉树脂。
- 重复洗涤用150ml洗涤缓冲液II（20 mm T型的上升HCl，pH值7.4，200 mM氯化钠，1mM的EDTA，pH为7.4，为0.2mM PMSF）。
- 加入5毫升的洗脱缓冲液（的20mM的Tris-HCl，pH值7.4，200 mM氯化钠，1mM EDTA的溶液，pH值7.4和0.2mM的PMSF，10mM的麦芽糖）柱中，温育在4℃下进行10分钟，收集洗脱液重复多次。
- 合并洗脱液，确定通过加载后，以考马斯亮蓝染色（ 图4）上的SDS-PAGE凝胶的洗脱液的等分试样MBP-Mgm101的产率和纯度。
3。断前蛋白酶裂解和阳离子交换层析
- 添加50单位PreScission蛋白酶到的MBP-Mgm101洗脱液。在4℃下进行裂解位的CO / N，并允许它继续透析过程中对透析缓冲液（的的20mM Tris-HCl，pH值7.4，100 mM氯化钠，2mM的DTT，1mM EDTA的溶液，pH值7.4和0.2mM的PMSF）
- SDS-PAGE凝胶上（ 图5A），检查裂解的效率。
- 由多个注入负荷切割MBP Mgm101离子在生物秤迷你宏观准备高S墨盒连接到Bio-Rad公司生物DuoFlow FPLC系统。
- 开始的阳离子交换色谱法，申请的步骤盐梯度为5mM，300mM的，500毫米，750毫米和1,000 mM NaCl的混合缓冲液A（5 mM氯化钠所建立的;的10mM磷酸钠，pH为7.2; mM的PMSF）和缓冲液B（1M NaCl的10mM的磷酸钠，pH为7.2，1mM的PMSF）。设置在0.5毫升/分钟的流速。收集Mgm101馏分和检查产品的纯度的蛋白在SDS-PAGE凝胶（ 图5B）。
4。尺寸排阻色谱法
- 结合从阳离子交换色谱的蛋白质部分。透析GF平衡缓冲液中的蛋白质（的20mM MOPS，pH为7.0，150 mM氯化钠，1mM的EDTA，pH值7.4，5mM的2 - 巯基乙醇，0.2mM的PMSF）。
- VIVASPIN 15R超滤离心柱浓缩蛋白，以3000×g在4℃下通过纺丝，以减低音量〜1毫升
- 装载Mgm101Ø呐校准SUPEROSE 6制备级柱层析缓冲液平衡过的20mM MOPS，pH为7.0，150 mM氯化钠，5mM的β-巯基乙醇，1mM EDTA的溶液，pH值7.4，0.2mM的PMSF。
- 尺寸排阻色谱运行缓冲液，流速为0.5ml /分钟。
- 收集的零碎，纯化Mgm101峰。负载的等分试样的级分在12％的SDS-PAGE检查蛋白质的最终质量。
- 与VIVASPIN 6浓缩蛋白，然后迅速冻结样品在液氮中并储存在-80℃下
- 中使用Mgm101样品在6-12个月内单链DNA结合测定（ 图8），并用透射电子显微镜（ 图9）的结构的可视化。
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Representative Results
Mgm101是一个RAD52在线粒体相关的重组蛋白。 RAD52已被广泛研究，它的作用在线粒体DNA重组（ 图1）。重组Mgm101可以准备通过三个步骤（ 图2）。这是促进所使用的MBP的标记策略，允许以可溶形式表达在Mgm101从标签的蛋白水解裂解，随后被释放（ 图3）。
在一个典型的制备方法中，约2-3毫克，MBP-Mgm101融合可以被回收后，直链淀粉的亲和层析从细菌培养1升。 SDS-PAGE凝胶上，MBP-Mgm101的〜70 kDa的（ 图4）检测到的一个主要带。如果树脂被适当地洗涤洗脱前，由其他蛋白质的污染是最小的。断前蛋白酶裂解后，MBP和Mgm101的分离和显示为42 kDa和28 kDa的条带分别在SDS-PAGE（ 图5A）。在消化不完全的情况下，如由一〜70 kDa条带的存在下，延伸的额外的断前蛋白酶消化忠告。
对于阳离子交换色谱裂解MBP-Mgm101的，MBP的是不保留的盐的应用前由列（ 图6）。通常情况下，Mgm101洗脱用500mM的盐没有明显的污染，MBP（ 图5B）。一个微小的峰值在300 mM的某个可见，对应的微量未裂解的MBP的Mgm101的的融合。这是可能的一个在该馏分Mgm101是，污染的DNA结合的亲和力，从而降低了向列的约束。因此，阳离子交换树脂是一个必要的步骤，以减少DNA污染。
图7示出的最后一个步骤Mgm101纯化，通过尺寸排阻色谱法。 Mgm101低聚物通常在单分散峰洗脱〜400 kDa的。经常看到一些突变形式的Mgm101之间的尺寸增加V0（空隙容积）和400 kDa的高峰。这样做的原因仍是未知数。突变影响低聚Mgm101可能诱导洗脱的V0级分中的聚集体的形成。但是，我们从来没有见过峰对应单体Mgm101的。 mgm101单体是有可能在溶液中不稳定。
将纯化的Mgm101具有高的单链DNA的结合亲和力（ 图8）。基于滴定的游离的单链DNA在凝胶上的单链DNA的结合亲和力的可估计。的Mgm101/ssDNA复杂迁移不佳出来的井。一种可能的解释是，Mgm101带正电荷的和多个亚基的Mgm101到单链DNA的结合，中和其负电荷的蛋白质/ DNA复合物的电泳条件下不动。当适当的准备，Mgm101结合单链DNA与KD〜200纳米。
图9示出通过负染透射电子显微镜的纯化Mgm101的直接结构可视化。为直径为约20 nm的大环低聚物，新鲜制备Mgm101主要存在。相反，老年Mgm101样品形成压缩细丝。这些长丝不形成环的简单堆叠的。显然长丝中的螺旋图案。调制成丝过程的条件，目前正在调查中。可取的做法是，该蛋白质量检查在SDS-PAGE后，孵育在4℃下老化样品之前，通过电子显微镜分析。
RAD52 RAD51重组重组站点上装载作为一个仲裁者，在CA简图如图1所示。nonical同源重组途径（左图），促进单链退火独立Rad51蛋白（右图）。
图2。总体方案编制重组Mgm101的。 Mgm101首先在大肠杆菌中表达大肠杆菌中的MBP融合的形式。通过超声处理的细菌细胞裂解。应用的DNase I消化，减少对DNA的污染。该MBP的Mgm101的融合，然后从贫DNA的溶胞产物通过使用直链淀粉柱纯化。经过蛋白水解切割，Mgm101被释放，并通过阳离子交换色谱分离从MBP。这一步是必要的，以进一步减少污染DNA。洗脱下来的Mgm101馏分，然后使其通过的Superose 6制备级柱纯化至均一。
图3。的Mgm101表达质粒pMAL-C2E MGM101的物理图。断前MBP和Mgm101之间蛋白酶的切割位点被指示。的蛋白水解切割产率MBP和Mgm101，其分子量分别为42和28 kDa的。
图4示出，的MBP-Mgm101的直链淀粉的亲和层析后的融合蛋白的纯度的SDS-PAGE电泳。通过测量280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度，约5μg的Mgm101在凝胶上被加载。凝胶用考马斯亮蓝染色。
图5。Mgm101 SDS-PAGE分析。 A）从MBP-Mgm101的融合蛋白与断前蛋白酶裂解后释放Mgm101。用蛋白酶O / N，消化后的等分试样约含5μg的蛋白质在凝胶上被加载。通过考马斯亮蓝染色的凝胶。 mgm101迁移稍慢于预期大小为28kDa，由于标准SDS-PAGE条件下的整体正电荷的蛋白质。 B）通过阳离子交换色谱分离后从MBP Mgm101。
图6表示MBP的为Mgm101，通过阳离子交换色谱分离的色谱图。在切割的MBP-Mgm101被注入到一个生物量程赠送宏观准备高S墨盒多次。步骤盐梯度5毫米，300毫米，500毫米，750毫米和1000毫米的NaCl，然后应用。 点击这里查看larer图 。
图7色谱图洗脱档案Mgm101低聚物在校准SUPEROSE 6制备级列。色谱法是通过在流速为0.5ml /分钟。观察到的峰〜400 kDa的洗脱下来的Mgm101的。 V0：空隙容积。， 点击这里查看larer图 。
图8。电泳迁移率显示，纯化Mgm101拥有强大的单链DNA结合活性的检测。 1.25×10 -3 2，1mM EDTA的溶液，pH值8.0，10％甘油，1mM DTT的50微克/毫升牛血清白蛋白;和1mM PMSF。在室温下温育30分钟后，将样品加载到6％非变性丙烯酰胺凝胶上，并运行在0.5X TBE缓冲液中，在4℃下
图9显示出新鲜的组织结构（左图）和老年（右图）Mgm101的电子显微照片。负染透射电子显微镜进行了使用在JEM-2100透射电子显微镜（JEOL）制工作在200千伏。对于负染色老化Mgm101，蛋白质被储存在4℃下在的GF缓冲液（20mM的MOPS，pH值7.0; 1氯化钠50毫米，5毫米β-巯基乙醇，1 mM的EDTA，pH值7.4和0.2毫米PMSF）分析前4周。 （礼貌的斯蒂芬·威尔肯斯博士）。
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Discussion
它一直是一个挑战，产生一个稳定的，原生的重组Mgm101蛋白E.大肠杆菌可能是由于其在细菌细胞中的不溶性。在这份报告中，我们表明，MBP融合战略使蛋白质表示在相当高的水平。通过负染色透射电子显微镜和尺寸排阻色谱法，我们以前曾表明，MBP的融合蛋白在体外 18形成均匀的低聚物。这是可能的折叠和低聚Mgm101的，可能比较慢线粒体基质相比，细菌细胞中。 unoligomerized Mgm101可迅速形成聚集体， 在体内有毒。 ，MBP的标记可能保持Mgm101一种可溶性的构象，允许生产齐聚，并减少其毒性。
质量好Mgm101制剂的一个重要标准是通过DNA的污染最小。 A 280 / A
我们以前曾表明，贮存在4℃下Mgm101了几个星期，诱导形成的长的螺旋形灯丝17。的连续长纤维形成的机理还不是很清楚。过成丝会影响蛋白质的溶解度。因此，强烈建议新鲜制备的Mgm101蛋白质的等分试样，然后存储在液氮中快速冷冻，在-80℃下存储u的6-12个月后的蛋白质的DNA结合活性保持不变NDER这些条件。
该协议也可用来制备突变体蛋白的Mgm101。低聚状态的稳定性Mgm101频繁的突变的影响。轻度突变可能会导致部分从MBP的裂解后的纯化的蛋白质沉淀。在这些情况下，增加至6升培养体积，以便有足够的稳定的尺寸排阻色谱法纯化的蛋白质的产率。严重影响低聚反应的突变可能允许生产的蛋白质在MBP的稠合的形式，但蛋白质可能并不稳定后，去除MBP的。
总之，目前的协议是可靠的，它允许低聚环在大肠杆菌中大Mgm101的高水平表达大肠杆菌 。此协议可适于Mgm101直向同源物20，21和其他寡聚蛋白的生产，特别是当在细菌细胞中的这些蛋白质的溶解度低。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
我们感谢斯蒂芬·威尔肯斯在透射电子显微镜的帮助。这项工作是支持由国家机构卫生部授予R01AG023731的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
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