Summary
Análise da função das células ciliadas vestibular é complicada por sua localização profunda na parte mais difícil do crânio, no osso temporal petroso. A maioria dos estudos com células capilares funcionais têm utilizado intensamente as células ciliadas isoladas. Aqui nós descrevemos uma preparação semi-intactos do epitélio vestibular rato para estudos eletrofisiológicos e de microscopia de dois fótons.
Abstract
Compreender as células ciliadas vestibulares funcionar em condições normais, ou como trauma, doenças e envelhecimento interromper esta função é um passo vital para o desenvolvimento de abordagens preventivas e / ou estratégias terapêuticas. No entanto, a maioria dos estudos com vista a função vestibular anormal não ter sido a nível celular, mas focado principalmente em ensaios comportamentais de disfunção vestibular, tais como análises de marcha e desempenho reflexo vestíbulo-ocular. Embora este trabalho rendeu dados valiosos sobre o que acontece quando as coisas dão errado, pouca informação é recolhida sobre as causas da disfunção. Dos estudos que incidem sobre os processos celulares e subcelulares que fundamentam função vestibular, a maioria têm contado com agudamente células ciliadas isoladas, desprovidas de suas conexões sinápticas e meio ambiente da célula de apoio. Por isso, um grande desafio técnico tem sido o acesso às células ciliadas vestibulares extremamente sensíveis em uma preparaçãoparação que é menos interrompido, fisiologicamente. Aqui demonstramos uma preparação semi-intactas do mouse vestibular epitélio sensorial que mantém o micro-ambiente local, incluindo células ciliadas / complexos aferentes primários.
Introduction
Apesar da contribuição significativa do sistema vestibular em nossas vidas cotidianas, um claro entendimento dos processos responsáveis pelo declínio observado na função vestibular com a idade são ainda imperceptíveis. Uma das razões para essa falta de conhecimento é que o declínio da função vestibular foi quase exclusivamente explorado utilizando testes comportamentais, incluindo o reflexo vestíbulo-ocular (RVO), um indicador preciso da função vestibular extrínseca, mas fornece informações limitadas sobre as mudanças de componentes intrínsecos . Este é um grande impedimento para a nossa compreensão da função das células ciliadas vestibular na saúde, doença ou envelhecimento.
Embora tenha havido muitos estudos sobre as células ciliadas vestibulares individuais, uma grande lacuna tem sido o recurso a preparações de células capilares agudas, onde as células do cabelo e terminais aferentes até cálice são removidos do seu ambiente normal através de tratamento mecânico e / ou enzimático. Tais abordagens inevitably perturbar a microarquitetura delicado entre células ciliadas e cálice, e os cabelos célula e célula de apoio. Com o desenvolvimento de preparações semi-intactas 1-5, e um isolado do rato de preparação de labirinto 6, existe agora uma oportunidade de estudar as diversas formas de comunicação sináptica sob condições que se aproximam mais in vivo. Na verdade, Lim et al. (2011) mostrou diferenças marcantes nas correntes de células inteiras gravadas de tipo agudo isolado I células ciliadas vestibulares em comparação com aqueles que permaneceram incorporado dentro do neuroepithelium. Especificamente, o potássio é pensado que se acumulam no espaço intercelular, entre a célula de cabelo e cálice aferentes, e altera significativamente a resposta das células ciliadas 7. Este tipo de informações pode ser impossível de obter, sem a preparação de semi-intacta do epitélio sensitivo vestibular descrito aqui. Nós demonstramos a preparação semi-intactas do mouse crista 3E mostram resultados representativos obtidos patch-célula inteira eletrofisiologia e de imagem de cálcio de dois fótons.
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Protocol
1. Animais
- Camundongos foram obtidas a partir do Centro de Rodent australiano (ARC, Perth, Austrália) e realizada na Universidade de Sydney Bosch Biotério em um claro / escuro ciclo normal de 12 horas, com enriquecimento ambiental. Todos os experimentos descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Sydney animal.
- Os ratinhos macho e fêmea (C57/BL6) foram utilizadas para todas as experiências uma vez que esta estirpe são comumente usados como pano de fundo para a manipulação genética, e podem ser consideradas equivalentes à estirpe selvagem 8-9.
2. Preparação de tecidos
- Preparar 300 ml de um fluido à base de glicerol cefalorraquidiano artificial (ACSF), constituído por (em mM): 26 de NaHCO3, 11 de glucose, 250 glicerol, 2,5 de KCl, 1,2 de NaH 2 PO 4, 1,2 MgCl 2, CaCl 2 e 2,5. Antes da adição de CaCl2, de gás a solução com carbogénio (95% O 2 e 5% de CO 2) para estabelecer apPrecipitação de cálcio de 7,4 H e evitar (nebulosidade). Congelar a solução num congelador -80 ° C durante 45 min de modo a que uma suspensão de gelo é formada.
- Profundamente anestesiar os ratos com cetamina (100 mg / kg) (Parnell, Alexandria, Austrália) por meio de uma injecção intra-peritoneal.
- Uma vez hind-membros reflexos pitada são ratos decapitar ausentes usando tesoura de aço inoxidável afiadas e fazer uma incisão na pele sagital utilizando uma lâmina de barbear (arredondado # 22) para expor o crânio. Neste ponto e em todo passos 2,3-2,8 a calota craniana, cérebro e aparelho vestibular subjacente deve ser mantido o mais fresco possível através da aplicação regular de ACSF gelada sobre o tecido.
- Usando o braço pontas de tesouras padrão normal (FST, North Vancouver, Canadá), fazer uma pequena incisão no crânio, lambda e cortar ao longo da sutura sagital. Assegure-se que o cérebro não é "arrastada" pela lâmina de corte durante este passo.
- Retire cuidadosamente os ossos parietais de distância lateralmente e do osso occipital posteriorly usando rasa curva Pearson fórceps (FST).
- Uma pequena espátula de aço inoxidável, é, então, usado para levantar cuidadosamente o cérebro a partir da superfície das fossas craniana média e posterior, e o nervo vestibulocochlea exposta (CNVIII) cortada a meio caminho entre o ouvido interno e do tronco cerebral com um par de tesouras finas íris. Cortar esse nervo minimiza tensão indevida sobre os axônios dos aferentes primários e suas conexões com as células ciliadas.
- A seguir à transecção de CN VIII do cérebro é removido in toto.
- O labirinto vestibular é agora claramente visível na fossa craniana média, com a cóclea apontando ântero. Rongeur cada lado do labirinto vestibular antes da excisão suavemente segurando o canal semicircular anterior e puxando lateralmente.
- Mergulhe os labirintos excisadas (Figura 1), em um prato de dissecação contém a gelada, ACSF continuamente gaseados descrito na seção 2.1. Sob um microscópio estereoscópico, segure o labirinto paraa base do prato de preensão da cóclea. Use uma pinça fina para raspar no osso que recobre a ampola do canal semicircular anterior. Uma vez que um pequeno buraco no osso é conseguida começam a apertar o osso ampulífuga. O cuidado deve ser tomado para não empurrar a pinça através do osso, pois isso pode causar danos ao labirinto membranoso subjacente e epitélio sensorial. Continuar este procedimento até que tanto a anterior e condutas membranosas semicirculares horizontais adjacentes e ampolas estão expostos (Figura 2).
Figura 1. O isolado do mouse labirinto vestibular. A. Painel esquerdo) Representação esquemática do isolado do mouse labirinto vestibular. Importantes pontos de referência para acessar o epitélio sensorial vestibular, a cóclea, anterior e horizontal canais semicirculares são laboratórioELED. Os asteriscos indicam a ampola do canal semicircular contendo o epitélio sensitivo vestibular. B. Painel) Fotomicrografia direito do labirinto vestibular isolado de um rato de 1 mês de idade.
Figura 2. Exposição do labirinto vestibular Membranous. O osso que recobre a ampola do canal semicircular anterior e horizontal foram riscados para revelar as ampolas membranoso preto / marrom manchada e os nervos ampulares associados (CNVIII). O esquema no painel inferior mostra as estruturas da região em destaque da fotomicrografia e mostra a relação entre as condutas do canal semicircular para a ampola e CNVIII.
- Utilizando uma pinça fina, levante suavemente a ampolas e utrículo associado longe do labirinto ósseo, garantindo que a região central do ampolas (ContaIning o epitélio sensorial) não está danificado. Em alguns casos, a parte proximal da conduta membranoso semicircular pode ter de ser cortado com tesoura de íris para libertar as ampolas a partir do osso.
- Transferir a tríade contendo os dois ampolas e utrículo em uma placa de Petri cheia de meio L-15 de cultura de Leibovitz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Use uma fibra óptica para "backlight" do tecido. Isto permite a visualização clara da crista contendo o epitélio sensorial dentro da ampola.
- Cuidadosamente fazer uma incisão na salpicado "telhado" do utrículo com a tesoura de íris finas. Continuar desta incisão através do telhado do anterior e, em seguida, as ampolas horizontal. Adicione a incisão o mais próximo possível da borda do epitélio sensorial quanto possível, sem contacto que (Figura 3A). Certifique-se de que não existem pedaços de membranas que recobrem o epitélio sensorial (Figura 3B)
- Transferir a preparação de semi isolado intacto a uma pequena glascâmara de gravação s de fundo cheio de L-15 mídia. Pesam-se a preparação utilizando uma grelha de fibras de nylon finas garantidos a um fio de platina em forma de U achatada (Figura 3B). Idealmente, as fibras da rede não deverá sobrepor-se ao epitélio sensorial, no entanto, em alguns casos em que é necessária uma maior estabilidade, uma única fibra atravessa em epitélio sensorial talvez preferida.
Figura 3. A preparação semi-isolado intacto do epitélio. A. Representação esquemática sensitivo vestibular da preparação semi-intactos e configuração do eléctrodo. A ampola que recobre a crista tem sido "des-coberta" para expor a superfície do epitélio sensorial (verde). B. Fotomicrografia da preparação semi-intacto "tríade" mostrando a anterior (AC) e horizontal (hc) crista (utrículo obscurecida sertraseiras ac). Note-se a fibra de nylon utilizados para garantir que a preparação da base da câmara de gravação. Barra de escala:. 100 mM C. Um eletrodo de registro posicionado em uma célula de cabelo vestibular individual. Barra de escala: 15 mM.
3. Eletrofisiologia
- Perfundir a preparação semi-intacta, com continuamente oxigenada L-15 médio. Os meios de comunicação contém um indicador de pH (vermelho de fenol), e de cor do meio devem ser monitorizados ao longo das gravações. O pH com o oxigénio deve ser 7,3-7,4 e corresponder a uma cor vermelha.
- Prepare a gravação pipetas de 1,5 mm (1,19 milímetros ID) de vidro de borosilicato usando um protocolo de duas etapas (passo de calor 1: 72, e passo de calor 2: 50) em um extractor de micropipeta (Narishige, Japão, modelo PP-830) para alcançar um impedância final 3-4 mohms.
- Encher a haste da pipeta com 3-4 mm de solução interno baseado em fluoreto de potássio contendo (em mM) 110 KF, 12 KCl, 27 de KOH, 1 de NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1,8 MgCl2,3 D-glicose, 2 e Na-ATP, pH 7,4 com KOH.
- Enrole a haste da pipeta 2-3 vezes e, tanto para baixo até a ponta quanto possível, com uma tira fina de parafilme para isolar o eléctrodo e reduzir a capacitância pipeta.
- Posicione a pipeta sobre o epitélio sensorial sob a ampliação de baixa potência (5X) em um microscópio vertical (Olympus BX51). Mudar para alta potência (40x) e visualizar as células ciliadas vestibulares individuais com uma câmera CCD anexo.
- Posição pipeta sobre a membrana de uma célula de cabelo visualizado (figura 3C), utilizando um micromanipulador (Sutter Instruments, Califórnia, EUA). Uma vez que o selo é conseguida gigaohm, ruptura da membrana celular, com uma pequena quantidade de pressão negativa aplicada através de uma porta de sucção no suporte da pipeta.
- As gravações de fixação de tensão de células inteiras, utilizando técnicas padrão de 8-9.
4. Dois fótons de microscopia
- Prepara-se uma solução salina a 0,9% contendo 5 mM de verde de Oregon488 BAPTA-1 (OGB-1; sal hexapotassium; Invitrogen, Alemanha).
- Enquanto ainda submerso, coloque a preparação tríade semi-intacta "des-coberta" em um pequeno pedaço de papel de filtro (4x4 mm, 0,8 mm de espessura; Millipore, Alemanha), garantindo que o epitélio sensorial é desobstruída de cima.
- Transferir o papel de filtro e a preparação para o eléctrodo de platina de base coberto salina (7 ul) de um electroporador que consiste na combinação de um gerador de impulsos e um amplificador de banda larga e tampa com mais 5 mL de solução a 5 mM do cálcio sintético Indicador de corante verde de Oregon 488 BAPTA-1 (Figura 4).
Figura 4. Massa de electroporação. A. esquemática, que mostra a secção transversal da configuração de electroporação. A preparação semi-intacta (*) é colocada sobre um pedaço de papel de filtro mergulhados em cálcio dye (verde Oregon 488 BAPTA-1) ea corrente aplicada entre os dois eléctrodos de platina. Adaptado de Briggman e Euler, 2011 10.
- Traga o início platina eléctrodo paralelo com o eléctrodo de base, a uma distância de cerca de 2 mm, tendo o cuidado de não perturbar a orientação da preparação quando em contato com o Verde 488-BAPTA uma solução Oregon é feita.
- Passe um pulso de corrente em breve a preparação (Parâmetros para o atual, 13 V, 10 ms de largura de pulso, freqüência de 1 Hz, 10 pulsos de onda quadrada) 10-11.
- Na parte inferior de uma câmara de registo com fundo de vidro cheio com meio L-15, colocar uma pequena pincelada de óleo de silicone e a posição da preparação semi-intacto na, novamente assegurar que o epitélio sensorial está desobstruído a partir de cima. Para garantir estabilidade em toda imagem, substituir a rede de nylon sobre a preparação como descrito acima (ver ponto 2.13).
- Usando um microscópio de dois fotões fazer gravações ópticas espontaneamenteactividade cálcio percutânea no epitélio sensorial (Figura 7), utilizando protocolos padrão de imagem 10-11.
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Representative Results
As propriedades electrofisiológicas de células ciliadas vestibulares são dependentes da micro-arquitectura complexa dentro do qual estão incorporados 7. Figura 5 mostra que a preparação epitélio vestibular semi-intactos podem ser usados para diferenciar entre células ciliadas do tipo I (Figura 5A), as células ciliadas do tipo II (Figura 5B), e o cálice aferente primário (Figura 5C), com base em condutâncias de células inteiras característicos. Estas características incluem um pronunciado "afundamento" durante a despolarização e grandes "colapsar" correntes da cauda do tipo I de células ciliadas, e a presença de correntes de sódio activo transientes que representam os potenciais de acção em aferente primário cálice (seta na Figura 5C).
A preparação pode também ser utilizada para quantificar os efeitos do envelhecimento sobre tipos de células ciliadas vestibulares individuais. Figura 6 compara a condutância (Figura 6A) e inactivação características (Figura 6B) de células ciliadas vestibulares do tipo II, em resposta à despolarização da etapa a partir de um potencial de repouso negativo em ratos jovens e mais velhos. Para que as células ciliadas do tipo II - o menos sensível as diferenças subtipo significativas não foram observadas em qualquer dos parâmetros (ver discussão).
Além da análise das propriedades de células inteiras, a preparação de semi-intacto também se presta a análise em grande escala dos mecanismos subjacentes à função subcelulares de células ciliadas. Figura 7 mostra a localização diferencial de cálcio para as células ciliadas do tipo I e do cálice primário aferentes, bem como a organização de sub-celular de cálcio dentro destas células. Figura 7A mostra a alteração na fluorescência de cálcio num tipo de célula particular eu cabelo para a adição de 100 mM de KCl. O curso de tempo da mudança está representada na Figura 7B. É importante ressaltar que o preparatíon permite a investigação da atividade de células ciliadas em resolução subcelular, em várias células simultaneamente, e em um ambiente de "quase normal" (Figura 7C) - uma característica não é possível usar células ciliadas isoladas e único eletrofisiologia celular.
Figura 5. Correntes de células completas a partir de células ciliadas registada no epitélio sensitivo vestibular rato. A. correntes de células completas gravada a partir de um tipo I de células ciliadas vestibular caracterizada por grandes "colapsar" correntes da cauda (seta). B. As correntes de células completas gravada a partir de um tipo II vestibular células ciliadas. Note-se a ausência de correntes de cauda. C. gravação de células inteiras de um aferente primário cálice caracterizado por correntes transitórias de sódio mediadas (seta) após a despolarização de um potencial de repouso negativo (-120 mV). Todas as células were realizada a -60 mV.
Figura 6. Comparação da sensibilidade e da inativação de células ciliadas do tipo II de ratos jovens e idosos. A. relações I / V para as células ciliadas do tipo II gravadas de jovens (1 mês) e mais velhos (9 meses) ratos em resposta ao aumento da duração da despolarização. B. A proporção média de condutância e inactivação de células ciliadas do tipo II em ratos jovens e velhos com base nas curvas I / V 100 mseg.
Figura 7. Dois fótons de imagem de cálcio do mouse vestibular preparação epitélio sensorial semi-intactas. A. Painel superior esquerdo) microscopia de dois fótons mostrando-1 BAPTA Oregon ativação cálcio verde em resposta ao normal L-15 perfusato(Em cima) ou L-15, contendo KCl a 100 mM (em baixo). As setas indicam uma célula de cabelo individual, antes e após a adição de KCl. B. Painel superior direito) Cálcio perfil de fluorescência da célula em destaque na A. C. Painel inferior) micrografia de dois fótons do epitélio sensorial mostrando Oregon Verde 488-BAPTA um carregamento de células ciliadas individuais inferior do painel Detalhe:. Localização subcelular de cálcio do tipo I citoplasma das células ciliadas (seta) ou o primário aferente cálice em torno de um tipo de Eu células ciliadas (setas duplas).
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Discussion
Os mecanismos subjacentes a nosso senso de equilíbrio têm recebido pouca atenção em comparação com outros sistemas sensoriais, por exemplo, os sistemas visual e auditivo. Dos estudos que investigaram alterações na função vestibular ou de equilíbrio, a maioria focada em medidas comportamentais, incluindo o reflexo vestíbulo-ocular, com conhecimento incompleto dos blocos de construção fundamentais da balança as próprias células ciliadas vestibulares. Esses estudos que se concentraram nas células ciliadas têm quase sempre feito usando células ciliadas agudamente isolados retirados de seu ambiente nativo. Neste artigo, vamos demonstrar uma preparação semi-intactas do mouse vestibular epitélio sensorial que se expande sobre esses estudos de fundação.
Enquanto as células ciliadas vestibulares são relativamente robusto, a utilidade da preparação semi-intacto é criticamente dependente da velocidade de excisão. Tipicamente, uma preparação será permanecem viáveis em room A temperatura durante um período de cerca de 2-5 horas após a excisão. Portanto, a minimização do tempo gasto a partir de quando o animal é sacrificado para gravação é primordial. A excisão pode ser relativamente fácil e rápido para um rato de 3 semanas de idade (total de 5-7 minutos), mas torna-se progressivamente mais difícil, em um animal mais velho (até 25 min em 9 meses de idade, os ratos). Nestes animais mais velhos, a temperatura de dissecção é um determinante crítico - assegurando que a preparação seja continuamente banhada geladas ACSF oxigenado processos catabólicos normais são inibidas.
Tal como descrito na secção 3.1, a preparação foi continuamente perfundidos com oxigenado meio Leibovitz L-15, e as gravações de fixação de células inteiras de tensão foram feitas usando microeléctrodos de vidro cheios com solução de KF interno 12. Esta combinação de ambientes externos e internos foi mostrada para proporcionar gravações mais estáveis e de longa duração do que outros componentes internos à base de potássio e / ou de Ringersoluções extracelulares baseados 13-14. Esta estabilidade é crucial para as longas protocolos necessários para estudar as propriedades eletrofisiológicas e dinâmicas de cálcio das células ciliadas usando patch-clamp e técnicas de dois fótons, respectivamente.
O objectivo fundamental da preparação semi-intacto é proporcionar um modelo para o estudo de células ciliadas vestibulares que é perturbada tão pouco quanto possível. Embora a preparação proporciona vantagens claras sobre as células ciliadas agudamente isolados - por exemplo, a dinâmica total das correntes de células completas são revelados apenas utilizando a preparação de semi-intacto 3, 7 - perturbações não pode ser evitado. Primeiro, é difícil de avaliar o impacto da remoção do "telhado" da ampola (e, presumivelmente, a cúpula anexa) na sinalização de células ciliadas espontânea. Sob condições fisiológicas normais, as células ciliadas responder à flexão do complexo feixe cúpula / cabelo. Sem este complexo é concebível que cel cabelo espontâneal sinalização podem não ser representativos de condições in vivo. Em segundo lugar, registros eletrofisiológicos na preparação semi-intactas são mais limitados a medições de atividade espontânea ou respostas a atividade natural simulado (ou seja, as injeções de corrente contínua na célula cabelo ou flexão mecânica de feixes de cabelo). Portanto, não é possível estudar as propriedades das células capilares subjacentes em resposta à activação da vida real (isto é, os movimentos da cabeça). No entanto, a preparação semi-intacta representa uma nova ferramenta para nos ajudar a entender a função das células ciliadas, e abre uma série de possibilidades para pesquisas futuras.
Uma grande vantagem de que a preparação de semi-intacto fornece mais de preparações de células ciliadas agudamente isolados é que ele permite múltiplas gravações simultâneas de células capilares e / ou os seus aferentes primários associados. Usando técnicas de dupla ou multi-cell patch clamp gravação esse recurso fornece um meio de avaliardirectamente células ciliadas / sinalização aferente primário, algo que não pode ser conseguido com preparações tradicionais isoladas. Além disso, utilizando a microscopia de dois fotões, a preparação de semi-intacta permite a medição simultânea da função de sub-celular em toda a extensão do epitélio sensorial. Isto significa que a informação sobre a sinalização de cálcio e o metabolismo celular pode ser acumulado rapidamente e dentro do contexto. Finalmente, usando ratinhos permite a manipulação genética alvo (por exemplo, a proteína verde fluorescente marcado para expressão calretinina como um marcador para o tipo I, as células do cabelo e aferentes primárias cálice). A preparação semi-intacto proporciona um método para estudar a actividade de células ciliadas e aferentes primárias diferencialmente, e simultaneamente. Isso por si só, daria uma riqueza de novas informações a respeito de como as células ciliadas vestibulares e aferentes primários interagem para detectar e codificar a informação a ser transmitida para o cérebro sobre a cabeça e posição do corpo.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O financiamento para este trabalho foi fornecido por uma Garnett Passe e Rodney Williams Memorial Foundation projeto de Subsídio à R. Lim e AJ Camp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A | |
References
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