Summary
前庭毛细胞功能分析是复杂的，最难的部分颅骨，颞骨岩部内位置较深。功能最全的毛细胞的研究已经用毛细胞急性分离。在这里，我们描述了一个半完整的小鼠前庭上皮细胞的电生理和双光子显微镜研究编制。
Abstract
了解前庭毛细胞的功能在正常条件下，或外伤，疾病，老化破坏这种功能如何预防方法和/或新的治疗策略的发展是一个重要的步骤。然而，大多数看着前庭功能异常的研究还没有在细胞水平上，但主要集中在行为检测前庭功能障碍，如步态分析和前庭眼反射性能。虽然这项工作已经取得了宝贵的数据，会发生什么事情出错时，几乎没有信息搜集功能障碍的根本原因。集中在细胞和亚细胞过程背后前庭功能的研究，大部分都依赖于毛细胞急性分离的，没有他们的突触连接和支持细胞环境。因此，重大的技术挑战已经在准备访问极其敏感的前庭毛细胞aration至少打乱，生理。在这里，我们展示了一个半完整编制的鼠标前庭感觉上皮细胞，保留局部微环境，包括毛细胞/初级传入神经复合物。
Introduction
尽管前庭系统的重大贡献，我们的日常生活中，一个清醒的认识过程负责前庭功能明显下降，随着年龄的增长仍然是难以捉摸的。这种缺乏知识的原因之一是，在前庭功能下降，几乎完全被探索使用行为分析，包括前庭眼反射（VOR），精确的外在前庭功能的指标，但提供有限的内在因素的变化洞察。这是我们了解前庭毛细胞功能健康，疾病或衰老的一个主要障碍。
虽然已经有许多研究个别前庭毛细胞，一大缺憾一直依赖急性毛细胞制剂，其中毛细胞和从他们的正常的环境中，通过机械和/或酶处理甚至萼传入终端被删除。这种方法不可避免地BLY破坏毛细胞和花萼，毛细胞和支持细胞之间的微妙微架构。半完整的准备1-5和鼠标一个孤立的迷宫准备6随着时代的发展，现在有机会学习各种形式的突触通信的条件下，更接近于体内 。事实上，林等人 （2011）表现出显着的差异，在我前庭毛细胞相比那些仍然嵌入神经 上皮的全细胞电流记录急性分离型。具体而言，钾被认为积聚在细胞间隙，毛细胞和萼传入神经 之间，并显着改变毛细胞响应7。这种类型的信息将是不可能取得未经半完好无损的在前庭感觉上皮这里描述的制备。我们证明了半完整编制鼠标嵴3，显示全细胞膜片电，代表结果和双光子钙成像。
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Protocol
1。动物
- 小鼠获得了来自澳大利亚啮齿动物中心（ARC澳大利亚珀斯）和悉尼大学博世动物设施在一个正常的12小时的光/暗周期与环境富集举行。所有的实验是由悉尼大学动物伦理委员会的批准。
- 雄性和雌性小鼠（C57/BL6）被用于所有的实验中是常用的，因为该菌株进行遗传操作的背景，可以视为等同野生型 8-9。
2。组织编制
- 准备300毫升的甘油的人工脑脊液（ACSF）组成的（以mM计）：26的NaHCO 3，11葡萄糖，250份甘油，2.5氯化钾，1.2的NaH 2 PO 4，1.2的MgCl 2，CaCl 2的 2.5。在此之前加入的CaCl 2，气体卡波金（95％O 2和5％CO 2）的解决方案，以建立应用7.4和H的，避免钙质沉淀（混浊）。冻结的溶液在-80℃的冰箱中45分钟，使冰形成浆料。
- 深麻醉小鼠通过腹腔注射氯胺酮（100毫克/千克）（帕内尔，亚历克斯，澳大利亚）。
- 一旦后肢捏反射消失杀头鼠标使用的是锋利的不锈钢剪刀，并用刀片（四舍五入＃22），暴露颅骨矢状切开皮肤。在这一点上和整个步骤2.3-2.8颅，脑，及相关的前庭器官应保持尽可能凉爽，由冰冷学联组织在普通的应用程序。
- 使用标准模式剪刀尖臂（FST），加拿大北温哥华做一个小切口在颅骨的Lambda和切沿矢状缝。确保大脑不是“拖”在此步骤中的剪切刀片。
- 小心剥离的顶骨，横向和枕骨posterio的的RLY使用，浅弯皮尔逊咬骨钳（FST）。
- 然后，使用一个小的不锈钢刮勺轻轻抬起大脑从中间和后颅窝的表面，暴露vestibulocochlea的神经（CNVIII）内耳和脑干中的一对细的虹膜剪切的中间。切割神经初级传入和他们与毛细胞的轴突最大限度地减少不必要的紧张。
- 第八CN横断脑全盘被删除。
- 前庭迷路中颅窝清晰可见，与耳蜗指向前内侧。咬骨钳才轻轻抓住前半规管和横向拉切除两侧的前庭迷路。
- 沉浸在解剖盘冰冷的，连续毒气学联第2.1节中描述的的切除迷宫（ 图1）。在立体显微镜下，按住迷宫烹调的基础上，通过抓住耳蜗。用细镊子刮去骨覆盖前半规管壶腹。一旦实现一个小洞，在骨开始滑动骨离壶腹。时应注意，不要推，通过骨钳，因为这可能会导致损坏底层膜迷路和感觉上皮。的前部和相邻的水平半圆形膜管壶腹继续 执行此过程，直到露出（ 图2）。
图1。小鼠离体前庭迷路。左面板）示意图小鼠离体前庭迷路。重要的参考点访问前庭感觉上皮细胞，耳蜗，前壁，水平半规管实验室ELED。星号表示半规管壶腹的前庭感觉上皮。右面板）的显微照片，从1个月大的小鼠的孤立前庭迷路。
图2。曝光的膜前庭迷路。骨覆前水平半规管壶腹被划伤，露出黑色/ 棕色斑点膜壶腹及相关壶腹的神经（CNVIII）。底部面板中的示意性表示的结构中的高亮区域的显微照片，显示的关系半规管的管道壶腹和CNVIII的。
- 用细镊子，轻轻抬起壶腹及相关囊远离骨迷路，确保中部地区壶腹（CONTA矿业感觉上皮）没有被损坏。在某些情况下，可能需要削减的半圆形的膜管与虹膜剪，以释放从骨壶腹近端部分。
- 包含两个壶腹和囊Leibovitz的L-15培养基（Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州）到培养皿充满了黑社会转移。使用光纤“背光”组织。这使得感觉上皮内壶腹嵴清晰的可视化。
- 斑点的椭圆囊的“屋脊”之称的罚款虹膜剪小心地做一个切口。屋顶的前，后水平壶腹继续通过此切口。使切口尽可能靠近边缘的感觉上皮尽可能不接触（ 图3A）。确保有膜覆盖的感觉上皮无件（ 图3B）
- 孤立半完整的准备转移到一个小GLASL-15的媒体充满了S-有底录音室。称取下来使用网格固定的扁平的U形的铂丝（ 图3B）的细尼龙纤维编制。理想情况下，纤维的网格不应该覆盖在感觉上皮，但是在某些情况下，更多的稳定性是必需的，横切的感觉上皮可能优选的单纤维。
图3。前庭感觉上皮。示意图的半完整的准备和电极配置的分离的半完整的制备 。壶腹嵴上覆有“封顶”的感觉上皮（绿色）的表面露出半完整的'黑社会'准备前（AC）和水平（HC）嵴（囊的显微照片。掩盖是后腿交流）。注意用于录音室的基础上制备固定的尼龙纤维。比例尺：100微米。C.记录电极放置在一个单独的前庭毛细胞。比例尺：15微米。
3。电
- 灌注的半完整的连续含氧的L-15培养基的制备。该媒体包含pH指示剂（酚红）和颜色的介质应监测整个录音。与氧的pH值应为7.3-7.4，对应的红色的颜色。
- 从1.5毫米（1.19 mm内径）硼硅酸盐玻璃上的微量拉马（成茂，日本，PP-830型），实现了使用一个两步骤的协议（加热步骤1：72;和热步骤2：50）准备记录移液管最终3-4MΩ阻抗。
- 填充有3-4毫米的氟化钾为基础的内部含有（以mM）110 KF，氯化钾12 27氢氧化钾，氯化钠，10 HEPES，10 EGTA，1.8 MgCl 2的溶液的吸液管柄，3个D-葡萄糖，钠-ATP和2，pH为7.4，用KOH。
- 包裹柄部的移液管的2-3倍，并尽可能远的前端尽可能用封口膜的细带绝缘的电极，并缩小移液器电容。
- 吸管放置在感觉上皮一个堂堂正正的显微镜（奥林巴斯BX51）在低功率放大倍率（5倍）。切换到高功率（40X）和一个附加的CCD相机，可视个别前庭毛细胞。
- 仓移液管上的膜用显微操纵器（萨特仪器，加利福尼亚州，美国）的可视化毛细胞（ 图3C）。一旦千兆欧姆密封件来实现，适用于通过吸液管保持器上的吸入口的负压用少量的细胞膜破裂。
- 请使用标准的8-9技术的全细胞电压钳记录。
4。双光子显微镜
- 准备一个0.9％的生理盐水溶液含有5毫米俄勒冈绿488 BAPTA-1（OGB-1; hexapotassium盐; Invitrogen公司，德国）。
- 虽然仍然淹没，放置到一小块滤纸（4X4毫米，厚0.8微米的微孔，德国），确保，感觉上皮通畅的从上面的“封顶”半完整的黑社会准备。
- 再有5微升5mM的溶液中合成的硅酸钙转移到盐水覆盖基铂电极（7微升）的脉冲发生器和一个宽带放大器的组合构成的电穿孔，滤纸及其制备和盖指示剂染料俄勒冈绿488 BAPTA-1（ 图4）。
图4。散装电。电配置的横截面示意图。半完整的制剂（*）被放置在一张滤纸浸入DY钙E（俄勒冈绿488 BAPTA-1）和2铂电极之间施加电流。改编自Briggman和欧拉，2011年10。
- 在距离约2毫米的基极，带来顶级的铂电极平行小心，不要破坏的准备方向与俄勒冈绿488 BAPTA-1解决方案时。
- 整个编制参数的电流，+13 V，10毫秒的脉冲宽度，频率1赫兹，10个方波脉冲电流脉冲通过一个简短的10-11。
- 在底部的玻璃有底录音室充满了L-15培养基，放置一个小的硅油和位置的半完整的制剂轻拍到它，从而也确保了感觉上皮来自上述通畅。为了确保整个成像稳定性，在准备取代尼龙网格如上所述（见2.13点）。
- 使用双光子显微镜，光学录音自发neous Ca2 +活动的感觉上皮（ 图7），使用标准的成像协议10-11。
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Representative Results
前庭毛细胞的电生理特性依赖于它们所嵌入的7上的复杂的微体系结构。 图5示出了半完整的前庭上皮细胞的制备，可用于区分不同的我发细胞（ 图5A），II型毛细胞（ 图5B），萼初级传入神经 （ 图5C），基于特征的全细胞电导。这些特性包括去极化过程中一个明显的“凹陷”和大型“崩溃”的尾电流I型毛细胞，存在暂时性内向钠电流代表萼初级传入神经 的动作电位（箭图5C）。
该制剂也可以被用来量化老化对个别前庭毛细胞类型的影响。 图6比较的电导（FIGURE 6A）和失活特性（ 图6B），Ⅱ型前庭毛细胞在年轻和年纪较大的老鼠从负的静息电位去极化反应步骤。对于II型毛细胞 - 最不敏感的亚型显着的差异，并未观察到任何参数（见讨论）。
除了 全细胞特性的分析，半完整的制剂还适合大规模分析毛细胞功能的亚细胞机制。 图7示出了差的钙本地化I型毛细胞和萼主传入，以及在这些细胞内的钙的亚细胞组织。 图7A示出了在一个单独的I型毛细胞的100mM的KCl此外钙荧光的变化。这种变化的时间过程是绘制在图7B。重要的是，编写，离子允许调查毛细胞活性亚细胞分辨率，同时在多个单元格，并在“接近正常”环境（ 图7C） -没有的功能可以使用孤立的毛细胞和单细胞电生理。
图5。全细胞电流记录在鼠标前庭感觉上皮的毛细胞。A.全细胞电流记录从I型前庭毛细胞的特点是“崩溃”大尾电流（箭头）。B.全细胞电流记录II型前庭毛细胞。注意的情况下尾电流瞬态钠介导的电流（箭头）下面去极化负的静息电位（-120 mV）的特点是从花萼初级传入神经C.全细胞记录。所有细胞ERE在-60 mV举行。
图6。 A. I / V 灵敏度和II型年轻和年纪较大的老鼠的毛细胞失活的比较。II型记录的毛细胞从年轻（1个月）及以上（9个月）小鼠响应关系去极化持续增加。 Ⅱ型毛细胞的平均电导和灭活率在年轻和年老的老鼠在100毫秒I / V曲线。
图7。 A.半完整的小鼠前庭感觉上皮制备双光子钙成像。顶部左侧面板）的双光子显微照片，显示BAPTA-1俄勒冈州的绿色钙激活响应正常的L-15灌流（顶部）或L-15的含100mM氯化钾（底部）。箭头表示一个单独的毛细胞之前和之后的另外的KCl。右上面板）的细胞内钙荧光曲线突出。C.底部面板）的双光子显微镜的感觉上皮俄勒冈绿488 BAPTA-1个人的头发细胞装载底板插图：钙的亚细胞定位的I型毛细胞的细胞质中（箭头）或萼初级传入神经 周围的类型我的头发细胞（双箭头）。
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Discussion
我们平衡感的机制已经收到了有限的关注相比，与其他的感官系统， 例如视觉和听觉系统。的调查研究，在前庭平衡功能的变化，大多数都集中行为的措施，包括前庭眼反射，平衡的前庭毛细胞本身的基本构建块不完整的知识。这些研究都集中在毛细胞几乎每年都这样做急性分离的毛细胞，从他们的家乡环境中删除。在这篇文章中，我们展示了一个半完整编制的鼠标前庭感觉上皮细胞，扩大在这些基础研究。
前庭毛细胞相对强劲，半完整的准备的效用严重依赖于切除的速度。通常情况下，准备将保持在袋鼠可行米温切除后一段时间约2-5小时。因此，减少动物安乐死录音时所花费的时间是至关重要的。切除可以比较容易和快3周龄小鼠（5-7分钟总），但在旧的动物变得越来越困难在9个月大的老鼠（最多25分钟）。在这些年长的动物，解剖温度是一个重要的决定因素 - 确保编制不断沐浴在冰冷的含氧学联正常代谢过程中被禁止。
正如3.1节中所述的准备，不断灌注含氧Leibovitz的培养基，L-15，全细胞电压钳记录，用玻璃微电极充满了KF内部解决方案12。已被证明这种外部和内部环境的组合，以提供更稳定的和较长的持续时间比其他钾为基础的内部和/或林格氏的录音基于外解决方案13-14。这种稳定性是至关重要的长的协议，需要分别使用膜片钳和双光子技术毛细胞的电生理特性和钙动力学研究。
半完整的准备的根本目的是尽可能少的干扰前庭毛细胞研究提供了一个模型。虽然编制提供了明显的优势超过毛细胞急性分离-例如，全动态，全细胞电流仅透露使用半完整的准备，3，7 -无法避免的干扰。首先，它是很难删除“屋脊”之称壶腹（大概附吸盘）自发毛细胞信号的影响进行评估。在正常生理条件下，毛细胞反应的吸盘/头发束复杂的弯曲。如果没有这种复杂可以想象的是，自然头发的cel升信号可能不能代表体内条件。的半完整的制剂中的第二个，电生理记录大多局限于自发性活动或响应的测量，模拟自然的活动（ 即直流注入毛细胞或机械弯曲的发束）。因此，它是不可能的毛细胞研究的基础属性在现实生活中的激活（ 即头部运动）。然而，半完整的准备，代表了一种新的工具，以帮助我们了解毛细胞功能，并为今后的研究打开一个途径。
的半完整的制剂提供了超过急性分离的毛细胞制剂的一个主要优点是，它允许同时由多个毛细胞和/或它们相关联的初级传入的录音。使用双或多细胞膜片钳记录技术，此功能提供了一种手段，评估直接毛细胞/初级传入神经信号，无法实现的东西，可以与传统的孤立的准备。此外，使用双光子显微镜，半完整的制剂允许的亚细胞功能，同时测量整个感觉上皮的完全程度。这意味着，有关钙信号和细胞代谢迅速，在上下文中可以累计。最后，使用鼠标可以进行有针对性的遗传操作（ 如绿色荧光蛋白作为标记类型标记的钙结合蛋白表达我的毛细胞和初级传入萼）。半完整的准备差异研究毛细胞和初级传入的活动，同时提供了一种方法。仅凭这一点，就如何前庭毛细胞和初级传入的相互作用来检测，然后被传输到大脑的头部和身体的位置编码信息提供了丰富的新信息。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
这项工作的资金提供了一个加内特凋谢和罗德尼·威廉姆斯纪念基金会项目资助R. Lim和AJ营。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A | |
References
- Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
- Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).
- Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).
- Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).
- Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).
- Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
- Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
- Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
- Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
- Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
- Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
