Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En Isoleret Semi-intakt Forberedelse af Mouse vestibulære Sensory epitel for Elektrofysiologi og høj opløsning To-foton mikroskopi

doi: 10.3791/50471 Published: June 13, 2013

Summary

Analyse af vestibulære hår celle funktion kompliceres af deres placering dybt inde den sværeste del af kraniet, den petrous tindingebenet. De fleste funktionelle hår celle undersøgelser har brugt akut isolerede hårceller. Her beskriver vi en semi-intakt forberedelse af muse vestibulære epitel for elektrofysiologiske og to-foton mikroskopi studier.

Abstract

Forståelse vestibulære hårceller fungerer under normale forhold, eller hvordan traumer, sygdom og aldring forstyrre denne funktion er et afgørende skridt i udviklingen af ​​forebyggende tiltag og / eller nye terapeutiske strategier. Imidlertid har de fleste af undersøgelserne ser på unormal vestibulære funktion ikke været på celleniveau, men primært fokuseret på adfærdsmæssige analyser af vestibulære dysfunktion såsom gangart analyser og vestibulo-okular refleks ydeevne. Mens dette arbejde har givet værdifulde data om, hvad der sker, når tingene går galt, er lidt information udledes om de underliggende årsager til dysfunktion. Af de undersøgelser, der fokuserer på cellulære og subcellulære processer, der ligger til grund for vestibulære funktion, har de fleste påberåbt akut isolerede hårceller, blottet for deres synaptiske forbindelser og støtte celle miljø. Derfor har en stor teknisk udfordring været adgang til de udsøgt følsomme vestibulære hårceller i et prepredelsen, der er mindst forstyrret, fysiologisk. Her viser vi en semi-intakt forberedelse af muse vestibulære sensoriske epithel, der bevarer det lokale mikro-miljø, herunder hår celler / primære afferente komplekser.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

På trods af den betydelige bidrag vestibulære system i vores hverdag, er fortsat en klar forståelse af de processer, der er ansvarlige for det konstaterede fald i vestibulære funktion med alderen undvigende. En af grundene til denne mangel på viden er, at faldet i vestibulære funktion er næsten udelukkende blevet undersøgt ved hjælp af adfærdsmæssige assays, herunder vestibulo-okulære refleks (VOR), en præcis indikator for ydre vestibulære funktion, men giver begrænsede indsigt i de ændringer af interne komponenter . Dette er en væsentlig hindring for vores forståelse af vestibulære hår celle funktion i sundhed, sygdom eller aldring.

Mens der har været mange undersøgelser af individuelle vestibulære hårceller, har en stor mangel været afhængighed af akutte hår cellepræparationer, hvor hårceller og endda baegerblade afferente terminaler fjernet fra deres normale miljø via mekanisk og / eller enzymatisk behandling. Sådanne tilgange inevitaligt forstyrre den fine mikroarkitektur mellem hår celle og blomsterbægeret, og hår celle og støtte celle. Med udviklingen af semi-intakte præparater 1-5, og en isoleret mus labyrint forberedelse 6, er der nu en mulighed for at undersøge de forskellige former for synaptisk kommunikation under forhold, som i højere grad ligner dem in vivo. Faktisk viste Lim et al. (2011) markante forskelle i helcelle strømninger optaget fra akut isolerede type I vestibulære hårceller i forhold til dem, der forblev indlejret i neuroepithelium. Specifikt kalium menes at akkumulere i det intercellulære rum mellem håret celle og blomsterbægeret afferent og væsentligt ændre hår celle respons 7.. Denne type oplysninger ville være umuligt at opnå uden den semi-intakte forberedelse af vestibulære sensoriske epithel beskrevet her. Vi viser den semi-intakte forberedelse af muse crista 3, Og viser repræsentative resultater opnået fra helcelle-patch elektrofysiologi, og to-foton calcium imaging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. Dyr

  1. Mus blev opnået fra den australske Rodent Center (ARC, Perth, Australien) og afholdes på University of Sydney Bosch Animal Facility på en normal 12-timers lys / mørke-cyklus med miljøberigelse. Alle beskrevne eksperimenter blev godkendt af The University of Sydney Animal Ethics Committee.
  2. Mandlige og kvindelige mus (C57/Bl6) blev anvendt til alle eksperimenter, da denne stamme er almindeligt anvendt som baggrund for genetisk manipulation, og kan betragtes som svarende til vild-type 8-9.

2.. Tissue Forberedelse

  1. Forbered 300 ml af en glycerol-baseret kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) bestående af (i mM): 26 NaHCO3, 11 glucose, 250 glycerol, 2,5 KCI, 1,2 NaH 2 PO 4, 1,2 MgCl2, og 2,5 CaCl2. Før tilsætningen af CaCl2, gas opløsningen med carbogen (95% O2 og 5% CO 2) at etablere en pH på 7,4 og undgå calciumudfældning (uklarhed). Nedfryses i en -80 ° C fryser i 45 minutter, således at en sjapis dannes.
  2. Dybt bedøve mus med ketamin (100 mg / kg) (Parnell, Alexandria, Australien) via en intra-peritoneal injektion.
  3. Når hind-limb knivspids reflekser er fraværende halshugge mus under anvendelse skarpe rustfrit stål saks og gøre en sagittal incision i huden ved hjælp af et barberblad (afrundet # 22) for at eksponere kraniet. På dette punkt, og gennem hele trin 2,3-2,8 kranie hvælving, hjerne og underliggende vestibulære apparat bør holdes så køligt som muligt ved regelmæssig anvendelse af iskold ACSF over vævet.
  4. Brug den spidse arm af standard mønster saks (FST, North Vancouver, Canada) lave et lille snit i kraniet på Lambda og klippe langs sagittale sutur. Sørg for, at hjernen ikke er "trukket" af den skæreklingen under dette trin.
  5. Træk forsigtigt den parietale knogler væk sideværts og nakkeknude posteriorly bruger lavvandet bend Pearson Rongeurs (FST).
  6. En lille rustfrit stål spatel anvendes derefter til forsigtigt løfte hjernen fra overfladen af ​​den midterste og bageste kranielle fossae, og den blottede vestibulocochlea nerve (CNVIII) afskårne midtvejs mellem det indre øre og hjernestammen med et par fine iris saks. Skæring denne nerve minimerer unødig spænding på axoner de primære afferente og deres forbindelser med hårceller.
  7. Efter transection af KN VIII hjernen er fjernet i toto.
  8. Det vestibulære labyrint er nu tydeligt synlig i midten kranielle grube, med cochlea pegende anteromedially. Rongeur hver side af den vestibulære labyrint før forsigtigt udtagelse ved at gribe den forreste halvrunde kanalen og trække sideværts.
  9. Fordyb det udskårne labyrinter (figur 1) i en dissekere skål indeholdende den iskolde, kontinuerligt gasset ACSF beskrevet i afsnit 2.1. Under et stereomikroskop, hold labyrinten tilbunden af ​​skålen ved at gribe cochlea. Brug fine tænger til at skrabe væk på knoglen overliggende forreste halvrunde kanalen ampulla. Når en lille hul i knoglen opnås begynde flick knoglen væk fra ampulla. Der bør udvises forsigtighed for ikke at skubbe pincet gennem knoglen, da dette kan forårsage skade på den underliggende membranøs labyrint og sensoriske epithel. Fortsætte denne fremgangsmåde, indtil både den forreste og tilstødende vandrette halvcirkelformede membranous kanaler og ampullae udsættes (figur 2).

Figur 1
Figur 1. Det isolerede mus vestibulære labyrint. A. Venstre panel) Skematisk fremstilling af den isolerede mus vestibulære labyrint. Vigtige referencepunkter for at få adgang til vestibulære sensoriske epithel, cochlea, anterior, og vandrette halvrunde kanaler er labeled. Stjerner angiver halvrunde kanalen ampulla indeholdende det vestibulære sensoriske epithel. B. Højre panel) mikrofotografi af det isolerede vestibulære labyrint fra en 1-måneder gamle mus.

Figur 2
Figur 2. Eksponering af Membranøs vestibulære labyrint. Knoglen overliggende forreste og horisontale halvcirkelformede kanalen ampullae er blevet ridset bort for at afsløre den sort / brun-plettet membranøs ampullae og tilhørende ampullary nerver (CNVIII). Den skematiske i det nederste panel repræsenterer strukturerne i det fremhævede område af mikrofotografiet og viser forholdet mellem de halvcirkulære kanalen kanaler til ampullae og CNVIII.

  1. Hjælp af fine tænger, løftes forsigtigt ampullae og tilhørende utricle væk fra den benede labyrint, der sikrer, at den centrale region af ampullae (contalingen den sensoriske epithel) ikke er beskadiget. I nogle tilfælde den proximale del af den halvcirkulære membranøs kanal kan være nødvendigt at klippe med iris saks at frigive ampullae fra knoglen.
  2. Overfør triade indeholdende de to ampuller og utricle i en petriskål fyldt med Leibovitz L-15 dyrkningsmedium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Brug et fiberoptisk til "baggrundsbelysning" vævet. Dette tillader klar visualisering af crista indeholder sensoriske epithel i ampuller.
  3. Omhyggeligt lave et snit i plettet "tag" af utricle med de fine iris saks. Fortsæt denne indsnit gennem taget af den forreste og derefter vandret ampullae. Gør snittet så tæt på kanten af den sensoriske epithel som muligt uden at kontakte det (figur 3A). Sikre, at der ikke er nogen stykker af membranen ligger over sensoriske epithel (figur 3B).
  4. Overfør isolerede semi intakt præparat til en lille GLAss-bund optagelse kammer fyldt med L-15 medie. Tynger forberedelse ved et gitter af fine nylonfibre sikret til en fladtrykt U-formet platintraad (figur 3B). Ideelt set bør fibrene i gitteret ikke ligge over den sensoriske epithel, men i nogle tilfælde, hvor mere stabilitet er påkrævet,. En enkelt fiber transecting den sensoriske epithel måske foretrukket

Figur 3
Figur 3. Det isolerede semi-intakt forberedelse af vestibulære sensoriske epithel. A. Skematisk fremstilling af semi-intakte forberedelse og elektrode konfiguration. Ampulla overliggende crista har været "de-overdækket" for at blotlægge overfladen af sensoriske epithel (grøn). B. mikrofotografi af den semi-intakte triaden forberedelse viser den forreste (ac) og horisontal (hc) crista (utricle tildækket behind ac). Bemærk nylonfiberproduktionsniveauet bruges til at fastgøre præparatet til bunden af ​​optagelsen kammeret. Målestok:. 100 um C. En elektrode placeret på en individuel vestibulære hår celle. Scale bar: 15 pm.

3.. Elektrofysiologi

  1. Perfundere semi-intakte præparat med kontinuerligt iltet L-15 medium. Medierne indeholder en pH-indikator (phenolrødt) og farve af mediet bør overvåges under hele optagelserne. PH med ilt bør være 7,3-7,4, og svarer til en rød farve.
  2. Forbered optagelse pipetter fra 1,5 mm (1,19 mm), borsilikatglas hjælp af en to-trins protokol (varme trin 1: 72, og varme trin 2: 50) på en mikropipette aftrækker (Narishige, Japan, model PP-830) for at opnå en endelig impedans 3-4 MOhm.
  3. Fyld skaft af pipetten med 3-4 mm Kaliumfluorid-baserede indre opløsning indeholdende (i mM) 110 KF, 12 KCI, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1,8 MgCl2,3 D-glucose og 2 Na-ATP, pH 7,4 med KOH.
  4. Wrap skaft pipetten 2-3 gange og så langt ned til spidsen som muligt med en tynd strimmel af parafilm at isolere elektroden og reducere pipette kapacitans.
  5. Placer pipetten over sensoriske epithel under lav forstørring (5X) på en opretstående mikroskop (Olympus BX51). Skift til høj effekt (40X) og visualisere de enkelte vestibulære hårceller med en vedhæftet CCD kamera.
  6. Position pipetten på membranen af en visualiseret hår celle (figur 3C) med en mikromanipulator (Sutter Instruments, Californien, USA). Når en gigaohm tætning opnås, brud cellemembranen med en lille mængde af undertryk påføres gennem en sugeåbning på pipetteholder.
  7. Make whole-cellespændingsværdier clamp optagelser med standardteknikker 8-9.

4.. To-foton mikroskopi

  1. Forbered en 0,9% saltvandsopløsning indeholdende 5 mM Oregon Green488 BAPTA-1 (OGB-1, hexapotassium salt Invitrogen, Tyskland).
  2. Mens stadig oversvømmet, placere "de-tag" semi-intakte triade forberedelse på et lille stykke filtrerpapir (4X4 mm, 0,8 um tyk, Millipore, Tyskland) at sikre, at den sensoriske epithel er uhindret fra oven.
  3. Overfør filtrerpapir og forberedelse på saltvand dækket basen platinelektroden (7 pi) af en elektroporator bestående af en kombination af en impulsgenerator og en bredbåndet forstærker, og dækkes med et yderligere 5 pi 5 mM opløsning af det syntetiske calcium indikatorfarvestof Oregon Green 488 BAPTA-1 (figur 4).

Figur 4
Figur 4.. Bulk elektroporation. A. skematisk viser tværsnit af elektroporation konfiguration. Den semi-intakte forberedelse (*) placeres på et stykke filtrerpapir nedsænkes i calcium dI (Oregon Green 488 BAPTA-1) og strøm anvendes mellem 2 platinelektroder. Tilpasset fra Briggman og Euler 2011 10..

  1. Bring den øverste platinelektroden parallelt med bunden elektrode i en afstand på ca 2 mm, og pas på ikke at forstyrre orienteringen af ​​præparatet, når kontakt med Oregon Green 488 BAPTA-1 løsning er foretaget.
  2. Passere en kort strømimpuls tværs forberedelse (Parametre for den aktuelle, +13 V, 10 msek puls bredde, 1 Hz frekvens, 10 firkantpulser) 10-11.
  3. På bunden af ​​et glas bund optagelse kammer fyldt med L-15 medium, placere en lille DAB af siliconeolie og position semi-intakte forberedelse på det, hvilket igen sikrer, at den sensoriske epithel er uhindret fra oven. For at sikre stabilitet i hele billedbehandling, udskift nylon net over præparatet som beskrevet ovenfor (se punkt 2.13).
  4. Brug af to-foton mikroskop gør optiske optagelser af Spontaneous calcium aktivitet i den sensoriske epithel (figur 7) ved anvendelse af standard billeddannende protokoller 10-11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De elektrofysiologiske egenskaber af vestibulære hårceller er afhængige af komplekse mikroarkitektur, hvori de er indlejret 7.. Figur 5 viser, at den semi-intakte vestibulære epitel præparat kan anvendes til at skelne mellem type I hårceller (figur 5A), type II hårceller (fig. 5B), og Bægeret primære afferente (5C) baseret på karakteristiske helcelle konduktanser. Disse karakteristika omfatter en udtalt "synke" under depolarisering og store "kollapser" halestrømme i type I håret celle, og tilstedeværelsen af forbigående indad natrium strømme repræsenterer virkningspotentialer i Bægeret primære afferent (pil i figur 5C).

Præparatet kan også bruges til at kvantificere virkningen af befolkningens aldring på de enkelte vestibulære hår celletyper. Figur 6 sammenligner ledningsevne (FIGUR 6A) og inaktivering karakteristika (fig. 6B) af type II vestibulære hårceller i respons til trin depolarisering fra en negativ hvilende potentiale hos unge og ældre mus. For type II hårceller - den mindst følsomme subtype-signifikante forskelle blev ikke observeret i enten parameter (se diskussionen).

Ud over analyse af helcelle-egenskaber, også den semi-intakte præparat egner sig til storstilet analyse af subcellulære mekanismer bag hår cellefunktion. Figur 7 viser forskellen lokalisering af calcium til type I hårceller og blomsterbæger primær afferente, såvel som sub cellulære organisering af calcium i disse celler. Figur 7A viser ændringen i calcium fluorescens i en individuel type I hår celle til tilsætning af 100 mM KCI. Tidsforløbet af denne ændring er afbildet i figur 7B. Vigtigere er det, preparation giver mulighed for undersøgelse af hår celle aktivitet ved subcellulær opløsning i flere celler samtidigt, og i en "nær normal" miljø (figur 7C) - en funktion ikke muligt ved hjælp af isolerede hårceller og enkelt celle elektrofysiologi.

Figur 5
Figur 5. Helcelle strømme optaget fra hårceller i muse vestibulære sensoriske epitel. A. Hele celle strømme optaget fra en type I vestibulære hårceller er kendetegnet ved store "kollapse" hale strømninger (Pil). B. Helcelle strømme optaget fra en type II-vestibulære hår celle. Bemærk fraværet af halestrømme. C. Hele celle optagelse fra en Bægeret primær afferent karakteriseres ved forbigående natrium-medierede strømme (Arrow) efter depolarisering fra en negativ hvilende potentiale (-120 mV). Alle celler wførend afholdt på -60 mV.

Figur 6
Figur 6.. Sammenligning af følsomhed og inaktivering type II hårceller fra unge og ældre mus. A. I / V relationer til type II hårceller optaget fra unge (1 måned) og ældre (9 måned) mus i svar på den stigende depolarisering varighed. B. Den gennemsnitlige ledningsevne og inaktivering forholdet af type II hårceller i unge og gamle mus baseret på 100 msek I / V kurver.

Figur 7
Figur 7. To-foton calcium billeddannelse af semi-intakte mus vestibulære sensoriske epithel forberedelse. A. Øverst til venstre panel) to-foton mikrografer viser BAPTA-1 Oregon Green calcium aktivering i respons til normal L-15 perfusat(Øverst) eller L-15 indeholdende 100 mM KCl (nederst). Pile viser en individuel hår celle før og efter tilsætning af KCl. B. Øverst til højre panel) Calcium fluorescens profil af cellen fremhævet i A. C. Bundpanel) To-foton mikrograf af den sensoriske epithel viser Oregon Green 488 BAPTA-1 loading af individuelle hårceller Bundpanel Indsat:. Subcellulære lokalisering af calcium til type I håret cellecytoplasma (pil) eller Bægeret primære afferent omgiver en type I hår celle (dobbelte pile).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De mekanismer, der ligger til grund vores følelse af balance har fået begrænset opmærksomhed i sammenligning med andre sansesystemer, fx visuelle og auditive systemer. Af de undersøgelser, der har undersøgt ændringer i vestibulære eller balance funktion, har de fleste fokuseret på adfærdsmæssige foranstaltninger, herunder vestibulo-okulær refleks, med ufuldstændig viden om de grundlæggende byggesten for betalingsbalancestatistik, det vestibulære hårceller selv. Disse undersøgelser, der har koncentreret sig om hårcellerne har næsten altid gjort det ved hjælp af akut isolerede hårceller fjernet fra deres oprindelige miljø. I denne artikel vil vi vise en semi-intakt forberedelse af muse vestibulære sensoriske epithel, som udvider disse fundament studier.

Mens vestibulære hårceller er relativt robust, nytten af ​​den semi-intakte forberedelse er kritisk afhængig af hastigheden af ​​excision. Typisk vil et præparat forbliver levedygtige på room temperatur i en periode på ca 2-5 timer efter excision. Derfor minimere den tid taget fra når dyret aflivet til optagelsen er altafgørende. Excision kan være forholdsvis let og hurtigt for en 3 uger gamle mus (5-7 min i alt), men bliver gradvist mere vanskeligt i en ældre dyr (op til 25 min i 9 måneder gamle mus). I disse ældre dyr, er dissektion temperatur en kritisk faktor - ved at sikre, at præparatet stadighed er badet i iskoldt iltede aCSF normale kataboliske processer hæmmes.

Som beskrevet i afsnit 3.1 præparatet var konstant gennemskyllet med iltet Leibovitz s medium, L-15, og hele cellespændingsværdier clamp optagelser blev foretaget ved hjælp glasmikroelektroder fyldt med KF intern løsning 12.. Denne kombination af ydre og indre miljø har vist sig at give mere stabile og længere varighed optagelser end andre kalium-baserede interne og / eller Ringersbaserede ekstracellulære løsninger 13-14. Denne stabilitet er afgørende for de lange protokoller, der er nødvendige for at studere elektrofysiologiske egenskaber og calcium dynamik hårceller hjælp patch-clamp og to-foton teknikker hhv.

Det grundlæggende mål med den semi-intakte forberedelse er at tilvejebringe en model for studiet af vestibulære hårceller, der forstyrres så lidt som muligt. Mens forberedelsen giver klare fordele i forhold til akut isolerede hårceller - for eksempel er den fulde dynamik helcelle strømme kun afsløret ved brug af semi-intakte præparat 3, 7 - forstyrrelser ikke kan undgås. Først er det vanskeligt at vurdere virkningen af ​​at fjerne "tag" af ampulla (og formentlig vedlagte cupula) på spontan hår celle signalering. Under normale fysiologiske betingelser, svare hårceller til bøjning af cupula / hårbundt kompleks. Uden dette kompleks er det tænkeligt, at spontan hår cell signalering kan ikke være repræsentativt for in vivo. Sekund, elektrofysiologiske optagelser i semi-intakte forberedelse er for det meste begrænset til målinger af spontan aktivitet eller reaktioner på simulerede naturlige aktivitet (dvs. jævnstrøms injektioner i håret celle eller mekanisk bøjning af hår bundter). Derfor er det ikke muligt at studere de underliggende hår celleegenskaber reaktion på real-life aktivering (dvs. hoved bevægelser). Ikke desto mindre er den semi-intakte præparat repræsenterer et nyt værktøj til at hjælpe os med at forstå hår celle funktion, og åbner en række muligheder for fremtidig forskning.

En stor fordel, at den semi-intakte præparat giver over akut isolerede hår cellepræparater er at det giver samtidige optagelser fra flere hårceller og / eller deres tilknyttede primære afferenter. Ved hjælp af to eller multi-celle patchclamping optagelse teknikker denne funktion giver mulighed for at vurderedirekte hår celle / primær afferent signalering, noget der ikke kan opnås med traditionelle isolerede præparater. Desuden, ved hjælp af to-foton mikroskopi semi-intakte præparat muliggør samtidig måling af sub-cellulær funktion tværs det fulde omfang af den sensoriske epithel. Det betyder, at oplysninger om calcium signalering og cellulære stofskifte kan være opsamlet hurtigt, og i sammenhæng. Endelig med mus muliggør målrettet genetisk manipulation (f.eks grønt fluorescerende protein tagged til calretinin udtryk som en markør for type I hårceller og baegerblade primære afferenter). Den semi-intakte præparat tilvejebringer en metode til at studere aktiviteten af ​​hårceller og primære afferente differentielt, og samtidigt. Dette alene ville give et væld af nye oplysninger om, hvordan vestibulære hårceller og primære afferenter sammen for at opdage og derefter indkode oplysninger fremsendes til hjernen om hoved og krop position.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Finansieringen af ​​dette arbejde blev leveret af en Garnett Passe og Rodney Williams Memorial Foundation Project tilskud til R. Lim og AJ Camp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Leibovitz medium L-15 Sigma Aldrich L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green Invitrogen O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope Leica Microsystems A60S
Upright microscope Olympus BX51WI
Two-photon microscope Olympus/La Vision BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps FST 11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs FST 16221-14
Standard Pattern Scissors FST 14001-12
InstraTECH A-D converter HEKA ITC-18
Sutter Micromanipulator Sutter MP-225/M
multiclamp amplifier Axon Instruments 700B
Data acquisition software (electrophysiology) Axograph N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon) Max Planck innovation N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
  2. Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, (2009).
  3. Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, (2009).
  4. Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, (2010).
  5. Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, (2010).
  6. Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
  7. Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
  8. Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
  9. Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
  10. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  11. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
  12. Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
  13. Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
  14. Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
En Isoleret Semi-intakt Forberedelse af Mouse vestibulære Sensory epitel for Elektrofysiologi og høj opløsning To-foton mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).More

Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter