Summary
Мы опишем метод для создания надежной модели церебральной венозной гипертензии у взрослых мышей. Эта модель была широко описаны и испытаны на крысах. Этот новый коллега в мышей открывает возможность использования генетически модифицированных животных, и тем самым расширяет применение модели.
Abstract
Понимание патофизиологии головного мозга артериовенозных мальформаций и артериовенозных свищей улучшилось благодаря животных моделях. Крыса модель создания искусственного свища между общей сонной артерии (ОСА) и наружной яремной вены (EJV) была широко описаны и доказал технически осуществимо. Эта конструкция вызывает последовательную мозговой венозной гипертензии (ХВГ), и, следовательно, помог изучения вклада венозной гипертензии в формирование, клинических симптомов и прогноза АВМ головного мозга и твердой мозговой оболочки АВФ. Эквивалентные модели мышей были только едва описано и показано проблемы со стенозом свища. Создан мышиной модели позволит изучение не только патофизиологии, но и потенциальные генетические методы лечения для этих цереброваскулярных заболеваний.
Мы представляем модель артериовенозной фистулы, который производит прочного внутричерепного венозной гипертензии у мышей. Микрохирургическая анастомоза оF мышиного CCA и EJV может быть затруднено из-за крошечного анатомии и часто приводит к непатентной свища. В этом протоколе шаг за шагом мы обращаемся все важные проблемы, возникшие в ходе этой процедуры. Как избежать чрезмерного втягивания вены во время экспозиции, используя 11-0 швов вместо 10-0, и делает тщательно спланированную анастомоз конец-в-бок некоторые из важных шагов. Хотя этот метод требует дополнительные микрохирургических навыков и более длительный процесс обучения, что эквивалентно у крыс, он может быть последовательно разработано.
Эта модель роман был разработан для интеграции трансгенных методов мышь с ранее хорошо зарекомендовавших экспериментальной системы, которая оказалась полезной для изучения АВМ головного мозга и дюралевые АВФ. При открытии возможности использования трансгенных мышей, более широкий спектр действующих моделей может быть достигнуто и генетические процедуры также может быть проверена. Экспериментальная конструкция также может быть дополнительно приспособлен к изучению OTее цереброваскулярные заболевания, связанные с венозной гипертензии, такие как мигрень, переходных глобальной амнезии, преходящей монокуляр слепоты и т.д.
Introduction
Животные модели головного венозной гипертензии оказались основным инструментом в понимании патофизиологии головного мозга артериовенозных мальформаций и артериовенозных свищей 1-7. Наиболее широко используется крыса модель, созданная с помощью искусственного свища между общей сонной артерии (ОСА) и наружной яремной вены (EJV), что провоцирует постоянный мозговой венозной гипертензии (ХВГ) у крыс 1,8-10. Эквивалентные модели мышей, открывая возможность использования различных штаммов трансгенных мышей, позволит в дальнейшем изучении на не только патофизиологии, но и потенциальных генетических методов лечения этих цереброваскулярных заболеваний. Кроме того, экспериментальная конструкция также может быть дополнительно приспособлен к изучению других цереброваскулярных заболеваний, связанных с венозной гипертензии, такие как мигрень, переходных глобальной амнезии, преходящей монокуляр слепоты и т.д. 11 Однако, предыдущие попытки построить эти модели мыши часпр продемонстрировали трудности, связанные с проходимости свища в связи с уменьшительным анатомии 5,12. Здесь мы опишем наш шаг за шагом протокол для успешного анастомоза мышей ОСО и EJV, что переводится в долгосрочной патентной свища и прочного венозной гипертензии у мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка мыши
- Общей анестезии у мышей с изофлуран газа. Вводите 0,15 мл внутрибрюшинно brupenorphine для управления болью. Прежде чем продолжить, убедитесь, что уровень анестезии является удовлетворительным помощью укола лапы мыши.
- Положите мышь в спинной лежачее положение с четырех конечностей фиксированных скотчем. Удалить волосы на шее и верхней части груди с помощью ножниц. Via подкожной инъекции, управлять 0,2-0,4 мл 0,9% физиологического раствора, чтобы держать мышь увлажненной во время хирургической процедуры.
- Подготовка операционного поля после строгой стерильной метода. Площадь кожного разреза должна быть очищена с 90% -ным спиртом.
2. Анатомический артерии сонной и внешним яремной вены
- Сделайте горизонтальную средней линии шейки разрез через нижнюю часть шеи мыши. После углубления рану, поднять слюнных желез и шейки мягких тканей с использованием поraction шов (рис 1). Expose правой наружной яремной вены (EJV) боковой на кивательной мышцы (СКМ). Этот шаг должен быть выполнен под микроскопом, так как чрезмерной тяги на вены может привести к его повреждению и вызвать его тромбоз.
- Осторожно рассекают правильный EJV вдоль его, конечно, от ключицы к основанию черепа. Обычно электрические биполярные щипцы, коагуляции и разделить любые ветви, чтобы подготовить соответствующий длину для последующего временного размещения клипа и анастомоза.
- Боковые трахеи и медиальнее СКМ, исследовать общую сонную артерию (CCA). Следует тщательно подвергается с ключицей просто за ее бифуркации в наружных и внутренних сонных артерий. На этом этапе внимание должно быть уделено снова, чтобы избежать чрезмерной тяги к EJV что впоследствии может поставить под угрозу проходимости анастомоза.
3. Подготовка анастомоза
- Перевязывать CCA с 10-0 NyLON просто проксимальнее ее бифуркации. Далее, применяют временный зажим над проксимальных ОСО как можно ближе к ключице, как это возможно.
- После того, как поток был прерван, секут артерию просто при бифуркации лигатуры и орошения его физиологическим раствором промыть всю оставшуюся кровь внутри просвета. Избегайте биполярной коагуляции на этом этапе, так как тепловое повреждение в стенке артерии может поставить будущее анастомоза в опасности.
- Для того чтобы улучшить видимость краев EJV, медиальной стенки отмечен синим маркером по ходу планируемого venotomy. После того, как EJV отмечен, использовать 10-0 шов лигировать дистальный конец хвостового как, насколько это возможно, и применить временный сосудистый зажим на проксимальном конце, как черепно насколько это возможно.
- С тонкой 30 G иглы и 0,5 мл шприц, внести первоначальный отверстие за отмеченный области EJV и сразу орошают полость с физиологическим раствором, чтобы избежать образования тромбов. Далее, продлить venotomy с microscissorsдо тех пор, пока длина составляет около 2-3 раз больше диаметра ОСО. Избежать резких растяжения и обратить внимание на зорко и аккуратный режущую кромку.
- Приблизительная конец ОСО к EJV. Сделайте боковой сократить разрез в конце доноров ОСО для регулировки диаметра к длине размера venotomy (рисунок 2).
4. Конец-в-бок анастомоза
- Используйте нейлоновую нить 11-0 мононити для конца в сторону анастомоза CCA-на-EJV. Наложение швов медиальной стенки анастомоза в craneo-каудальном направлении первый шаг. Каждый стежок должен быть помещен снаружи в венозной стенки первого (рис 3) и от наизнанку артериальной стенки (рисунок 4) следующего. Это будет держать узел на внешней поверхности анастомоза сосудов во все времена (рисунок 5). Либо узловые или непрерывные нити могут быть использованы, но все непрерывные нити должны быть ужесточены, как на конечной стадии.
- Ость Медиальная стенка была зашивается, повторите процедуру, начиная с хвостового для черепных с боковой стенкой. Теперь каждый стежок должен быть помещен снаружи в артериальной стенке первого и из наизнанку венозной стенки рядом. Полив засоленной поможет сохранить просвет анастомоза на видном месте во время процедуры.
- После окончания всех этапов анастомоза, удалить временный клип из вены первого и из артерии в следующем. Артериальная кровь будет течь в EJV без или с небольшим сочилась из анастомоза (Смотреть видео VH модель и VH модель 2). Минимальный кровотечение должно остановиться без использования сжатия хлопка на анастомоза. Этого следует избегать, чтобы предотвратить тромбоз вены деликатной.
- После того, как пульсирующий поток через анастомоза подтверждается и не наблюдается никакой очевидной кровотечение, орошения операционного поля с физиологическим раствором и закрыть шейки разрез с 6-0 нейлоновой нити в. Наконец, администрирование 0,15 мл больше intraperitoneal brupenorphine для послеоперационного обезболивания и 0,2-0,4 мл подкожно 0,9% физиологического раствора, чтобы пополнить потери крови во время операции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешный исход этой модели является патент артериовенозная фистула, что вызывает венозной гипертензии в мышиной мозга. Для проверки модели мы первоначально измерили внутричерепное венозное давление в сагиттальной пазухи мышей на 2, 3 и 4 недель после операции. 6 различных мышей присваивается каждой рабочей группы. Давление пазухи было 8,8 ± 1,2 мм рт.ст. в группе измеряют две недели после операции. В 6 мышей, измеренных через 3 недели после операции, давление синуса было 4,7 ± 1,4 мм рт. Наконец, 6 мышей измеряли 4 недели после операции было давление пазухи 3,9 ± 0,6 мм рт.ст. (рисунок 6). Послеоперационный 2 недели давление пазухи была значительно выше, чем давление пазухи на 3 и 4 недель (и р <0,001).
Тем не менее, комплексная методика, необходимое для измерения давления пазухи нет необходимости, чтобы обеспечить фистулы проходимости и венозной гипертензии на регулярной основе. Вместо этого, желаемый результат может быть Checked прямым проверки свища и клинических признаков венозной гипертензии у мышей.
Проходимость фистулы могут быть проверены непосредственно на конце хирургического вмешательства с помощью двух методов. Первый состоит из временного воспрепятствование EJV краниально к области anastomsis щипцами ювелира. Эта точка теперь только отток крови из ОСО. Если анастомоз конец-в-бок является патент, эластичный EJV сразу на воздушном шаре, как показано в тестовом проходимость видео 1. Второй метод осуществляется окклюзии венозных шунтов дистальнее анастомоза и медленно опорожнения или "доения" его с парой щипцов ювелира. Как показано на втором видео для теста проходимости, когда окклюзия освобожден, патент анастомоза должен быстро пополнить опустевшую сегмент.
Если модель работает, увеличение глаза мыши следует отметить 24 ч после операции. Это мау быть связано с состоящей венозного оттока от головы и шеи. Хотя оба глаза разбегаются увеличенный после операции, явление более видное место в оперированной стороне, как можно наблюдать на рисунке 7.
Рисунок 1:. Разрез кожи по горизонтали средней линии шейки разрез по нижней части шеи мыши и мягкой тяги слюнных желез подвергает правую внешнюю яремную вену (EJV). Обратите внимание на поверхностное расположение EJV, что обуславливает наличие тщательного разрез кожи, чтобы предотвратить какие-либо травмы в деликатной вены.
Рисунок 2:. Подготовка анастомоза медиальной стенки EJV был отмечен синей линией вдоль ходе плановой venotomy. Полутуши нарезанные INCIинфекции в конце доноров ОСО выполняется для регулировки диаметра артерии с длиной до venotomy.
Рисунок 3:. Вне в медиальной стенки анастомоза вшивается в craneo-каудальном направлении с 11-0 строчки сначала помещали извне в венозной стенки.
Рисунок 4:. Наизнанку Игла приводится здесь с наизнанку артериальной стенки для выполнения шва в средней стенке в соответствующим образом, чтобы узел на внешней поверхности анастомоза.
Рисунок 5: Сохранение узел за пределами Примечание хо.ж узла прерванного шва выбранной в этом случае остается снаружи просвета сосудов, чтобы избежать образования тромбов, которые закрывают свищ.
Рис. 6: Анализ Синус давление Эта диаграмма Bart графически отображает разницу в внутричерепное давление пазухи, измеренной в мм ртутного столба в 2, 3 и 4 недель после операции.
Рисунок 7:. Экзофтальм На следующий день после операции, оба глаза расширяются, но верно расширение глаз (на той же стороне в операции) является более заметным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Устойчивый головного мозга венозная гипертензия была тесно связана с более тяжелыми клиническими проявлениями и плохим прогнозом у пациентов с твердой мозговой оболочки АВФ и головного мозга АВМ 3. Эти эффекты CVH были широко изучены в моделях крыс 1,2,8. Эквивалентная модель на мышах позволили бы использование генетически модифицированных животных, которые в конечном итоге позволит анализ молекулярных путей, участвующих в патогенезе венозной гипертензии и ее отношений с твердой мозговой АВФ и АВМ головного мозга.
Здесь мы приводим метод для создания головного мозга венозной гипертензии у взрослых мышей через сонную-яремной свища конца в сторону. Эта новая модель повышает хорошо описанные модели сонной-яремной свищ у крыс путем перевода его на мышь и тем самым позволяя вышеупомянутую возможность исследовать молекулярные пути, и генной терапии.
Общие проблемы и предложения
Еще одна распространенная проБлем вредит вены с чрезмерной тяги, сжатия, или рассечение вдоль его курса. Таким образом, воздействие EJV должны быть тщательно выполнены под микроскопом, чтобы определить соответствующую плоскость диссекции. Все мелкие ветви, которые стекают в него также должны быть определены и коагулируют. Это позволит избежать неконтролируемого кровотечения требует сжатия вены и обеспечит достаточно избыточность, чтобы избежать чрезмерного напряжения.
Это не редкость, чтобы плохо функции фистулы после удаления временных клипы. В этом случае, первый шаг должен быть искать возможные точки напряжения или угловой в ОСО. Кроме того рассечение артерии или частичной резекции кивательной мышцы решит эту проблему. Однако, если снижение функции продолжается после этих маневров, тромбоз анастомоза должен быть заподозрен. В этом случае, вместо того, чтобы повторно открыть анастомоза и удаление тромба, рекомендуется выполнить новыйанастомоз краниально к предыдущей. По нашему опыту, третий анастомоза невозможно. Существует не хватает длина EJV и мышь не терпит анестезии в течение столь длительного периода времени.
Ограничения техники
Основные недостатки этой методики, включают: (1) миниатюрные анатомия сосудов требует дополнительные микрохирургических навыков и более длительный процесс обучения, чем для эквивалентного модели у крыс; (2) проходимость анастомоза нередко снижается тромбообразования и длины EJV мыши только позволит одну дополнительную попытку решить эту проблему; и (3) операция может занять до трех часов, подвергая мышь, чтобы долгое анестезии период. Однако после технических предложений предложенная выше и держать мышь тепло и увлажненной во время процедуры, патент CCA-на-EJV может быть успешно выполнена и высокий уровень выживаемости животных, достигнутых в нашем опыте.
Надежны и долговечны церебрального венозного модель гипертензии у мышей важным инструментом, который может служить широкий ряд целей в цереброваскулярной исследований 13-16. При добавлении нокаутом технологии трансгенных мышей, эта новая модель должна способствовать дальнейшему генов, связанных с в естественных условиях исследования для всех патологий, связанных с церебральным венозной гипертензии.
Ранее другие авторы описали венозный модель гипертонии у крыс и использовали ее для изучения патофизиологии дурального AVF и АВМ головного мозга 4,5,8,9. Опишем метод успешно перевести эту же модель на мышах, поэтому открытие своих потенциальных приложений для всех видов генетического тестирования лечения.
Вывод
Мы демонстрируем здесь протокол для достижения патент CCA-на-EJV анастомоза у взрослых мышей. Это свищ обеспечиваетпрочный мозг венозная гипертензия, которая была полезным инструментом для разработки различных моделей цереброваскулярных заболеваний у крыс. Предоставляя эту начальную стадию, чтобы развивать эти же модели у мышей, мы открываем возможность тестирования генетические процедуры для тех цереброваскулярных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Экспериментальные методики с лабораторными животными были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных из Университета Калифорнии, Сан-Франциско (UCSF) на.
Авторы не имеют никаких потенциальных конфликтов интересов, связанных с наркотиками и материалов, используемых в этой процедуре.
Acknowledgments
Этот проект частично поддержана NIH T32 GM008440 к Эспен Уокер, R01 NS27713 Уильяму L.Young, P01 NS44155 Уильяму L.Young и Хуа Су, R21 NS070153 Хуа SU и американской ассоциации сердца AHA 10GRNT3130004 Хуа Су. Д-р Ана Родригес-Эрнандес поддерживается за счет гранта "Обра социального La Caixa"
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Sterile Microsuture | Arosurgical Ic. | VT5A010Q10 | |
| 11-0 Sterile Microsuture | Arosurgical Ic | VT4A00N07 | |
| DUROTIP Scissors | Aesculap | BC210R | |
| Micro-Adson Tissue Forceps | Aesculap | BD510R | |
| Microscissors | Aesculap | OC496R | |
| Micro Forceps #5 Jewelers | Aesculap | BD331R | |
| Angled Jewelers Forceps | Aesculap | BD329R | |
| Micro Suture Forceps | Aesculap | BD338R | |
| DUROGRIP Needle Holder | Aesculap | BM009R |
References
- Bederson, J. B., Wiestler, O. D., Brüstle, O., Roth, P., Frick, R., Yaşargil, M. G. Intracranial venous hypertension and the effects of venous outflow obstruction in a rat model of arteriovenous fistula. Neurosurgery. 29, 341-350 (1991).
- Gao, P., Zhu, Y., Ling, F., Shen, F., Lee, B., Gabriel, R. A., Hao, Q., Yang, G. Y., Su, H., Young, W. L. Nonischemic cerebral venous hypertension promotes a pro-angiogenic stage through HIF-1 downstream genes and leukocyte-derived MMP-9. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1482-1490 (2009).
- Kim, H., Su, H., Weinsheimer, S., Pawlikowska, L., Brain Young, W. L. arteriovenous malformation pathogenesis: a response-to-injury paradigm. Acta Neurochir. Suppl. 111, 83-92 (2011).
- Lawton, M. T., Arnold, C. M., Kim, Y. J., Bogarin, E. A., Stewart, C. L., Wulfstat, A. A., Derugin, N., Deen, D., Young, W. L. Radiation arteriopathy in the transgenic arteriovenous fistula model. Neurosurgery. 62, 1129-1138 (2008).
- Lawton, M. T., Stewart, C. L., Wulfstat, A. A., Derugin, N., Hashimoto, T., Young, W. L. The transgenic arteriovenous fistula in the rat: an experimental model of gene therapy for brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 54, 1463-1471 (2004).
- Schaller, B., Graf, R., Sanada, Y., Tolnay, M., Rosner, G., Wienhard, K., Heiss, W., D, Hemodynamic changes after occlusion of the posterior superior sagittal sinus: an experimental PET study in cats. AJNR Am J Neuroradiol. 24, 1876-1880 (2003).
- Zhu, Y., Lawton, M. T., Du, R., Shwe, Y., Chen, Y., Shen, F., Young, W. L., Yang, G. Y. Expression of hypoxia-inducible factor-1 and vascular endothelial growth factor in response to venous hypertension. Neurosurgery. 59, 687-696 (2006).
- Herman, J. M., Spetzler, R. F., Bederson, J. B., Kurbat, J. M., Zabramski, J. M. Genesis of a dural arteriovenous malformation in a rat model. J. Neurosurg. 83, 539-545 (1995).
- Terada, T., Higashida, R. T., Halbach, V. V., Dowd, C. F., Tsuura, M., Komai, N., Wilson, C. B., Hieshima, G. B. Development of acquired arteriovenous fistulas in rats due to venous hypertension. J. Neurosurg. 80, 884-889 (1994).
- Yassari, R., Sayama, T., Jahromi, B. S., Aihara, Y., Stoodley, M., Macdonald, R. L. Angiographic, hemodynamic and histological characterization of an arteriovenous fistula in rats. Acta Neurochir (Wien). 146, 495-504 (2004).
- Solheim, O., Skeidsvoll, T. Transient global amnesia may be caused by cerebral vein thrombosis. Med. Hypotheses. 65, 1142-1149 (2005).
- Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. J Vasc Interv Radiol. 20, 946-950 (2009).
- Choi, E. J., Choi, E. J., Walker, E. J., Shen, F., Oh, S. P., Arthur, H. M., Young, W. L., Su, H. Minimal Homozygous Endothelial Deletion of Eng with VEGF Stimulation Is Sufficient to Cause Cerebrovascular Dysplasia in the Adult Mouse. Cerebrovascular diseases. 33, 540-547 (2012).
- Hao, Q., Su, H., Marchuk, D. A., Rola, R., Wang, Y., Liu, W., Young, W. L., Yang, G. Y. Increased tissue perfusion promotes capillary dysplasia in the ALK1-deficient mouse brain following VEGF stimulation. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, H2250-H2256 (2008).
- Su, H., Hao, Q., Shen, F., Zhu, Y., Lee, C. Z., Young, W. L., Yang, G. Y. Development of a cerebral microvascular dysplasia model in rodents. Acta Neurochir. Suppl. 105, 185-189 (2008).
- Walker, E. J., Su, H., Shen, F., Degos, V., Jun, K., Young, W. L. Bevacizumab Attenuates VEGF-Induced Angiogenesis and Vascular Malformations in the Adult Mouse Brain. Stroke; a journal of cerebral circulation. , (2012).
