Summary
Descreve-se um método para a criação de um modelo de confiança de hipertensão venosa cerebral no rato adulto. Este modelo tem sido amplamente descrita e testada em ratos. Este novo homólogo nos ratinhos abre a possibilidade de utilização de animais geneticamente modificados e, assim, alarga a aplicação do modelo.
Abstract
O entendimento da fisiopatologia das malformações arteriovenosas cerebrais e fístulas arteriovenosas melhorou graças a modelos animais. Um modelo de rato criando uma fístula artificial entre a artéria carótida comum (ACC) e da veia jugular externa (EJV) tem sido amplamente descrita e comprovada tecnicamente viável. Esta construção provoca uma hipertensão venosa cerebral consistente (CVH), e, portanto, tem ajudado a estudar a contribuição de hipertensão venosa para a formação, os sintomas clínicos, e prognóstico de MAVs cerebrais e FAV dural. Modelos de ratos equivalentes foram apenas pouco descrita e têm mostrado problemas com estenose da fístula. Um modelo murino estabelecida permitirá o estudo da fisiopatologia, não só mas também terapias genéticas potenciais para estas doenças cerebrovasculares.
Nós apresentamos um modelo de fístula arteriovenosa, que produz uma hipertensão venosa intracraniana durável no mouse. Microsurgical anastomose of o murino CCA e EJV pode ser difícil devido à anatomia diminuto e freqüentemente resultam em uma fístula não-patente. Neste protocolo passo-a-passo que enfrentar todos os desafios importantes encontrados durante este procedimento. Evitando a retracção excessiva da veia durante a exposição, utilizando suturas 11-0 10-0 em vez de, e fazendo uma anastomose cuidadosamente planeada extremo-a-lado são alguns dos passos críticos. Embora este método requer técnicas de microcirurgia avançada e uma curva de aprendizagem mais longo que o equivalente no rato, ele pode ser desenvolvido de forma consistente.
Este romance modelo foi concebido para integrar técnicas de camundongos transgênicos com um sistema experimental previamente bem estabelecida, que tem se mostrado útil para estudar AVMs cerebrais e FAV dural. Ao abrir a possibilidade de utilizar ratinhos transgénicos, um espectro mais amplo de modelos válidos, podem ser alcançados e tratamentos genéticos podem também ser testados. A construção experimental também pode ser ainda adaptado para o estudo de otsuas doenças cerebrovasculares relacionados com hipertensão venosa, como enxaqueca, a amnésia global transitória, cegueira monocular transitória, etc.
Introduction
Os modelos animais de hipertensão venosa cerebral provaram ser um instrumento fundamental para a compreensão da fisiopatologia das malformações arteriovenosas cerebrais e fístulas arteriovenosas 1-7. O mais utilizado é o modelo de rato criado através de uma fístula artificial entre a artéria carótida comum (ACC) e a veia jugular externa (EJV), o que provoca uma hipertensão venosa cerebral consistente (CVH) no rato 1,8-10. Modelos de ratos equivalentes, abrindo a possibilidade de utilizar diferentes estirpes de ratinhos transgénicos, que permitiria o estudo adicional sobre patofisiologia não só mas também terapias genéticas potenciais para estas doenças cerebrovasculares. Além disso, a construção do experimento, podem também ser ainda adaptado para o estudo de outras doenças cerebrovasculares relacionadas com a hipertensão venosa, tais como enxaqueca, amnésia global transitória, cegueira monocular transiente, etc. 11 No entanto, tentativas anteriores para construir estes modelos de ratos hav demonstrou as dificuldades com a permeabilidade da fístula devido à anatomia diminutivo 5,12. Aqui, descrevemos nosso protocolo passo-a-passo para a anastomose bem sucedida do murino CCA e EJV que se traduz em uma fístula patente a longo prazo e uma hipertensão venosa durável no mouse.
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Protocol
1. Preparar o mouse
- Induzir a anestesia geral no rato com gás isoflurano. Administrar 0,15 ml de brupenorphine intraperitoneal para controle da dor. Antes de prosseguir, verifique se o nível de anestesia é satisfatória através da punção patas do rato.
- Coloque o mouse em decúbito dorsal, com os quatro membros fixos por fita adesiva. Remover o cabelo do pescoço e parte superior do tórax, com uma tesoura. Por meio de injecção subcutânea, administrar 0,2-0,4 ml de solução salina a 0,9% para manter o rato hidratado durante o procedimento cirúrgico.
- Prepare o campo operatório seguindo um método rigoroso estéril. A área da incisão na pele deve ser limpa com álcool 90%.
2. dissecção da artéria carótida comum ea veia jugular externa
- Faça uma incisão na linha média cervical horizontal em toda a área do pescoço inferior do mouse. Depois de aprofundar a ferida, elevar as glândulas salivares e dos tecidos moles do colo do útero, usando pelorAction sutura (Figura 1). Expor a veia jugular externa direita (EJV) lateralmente ao músculo esternocleidomastóideo (SCM). Esta etapa deve ser realizada sob o microscópio, pois tração excessiva sobre a veia pode danificá-lo e induzir a sua trombose.
- Dissecar cuidadosamente o EJV direita ao longo do seu curso a partir da clavícula até a base do crânio. Normalmente pinça bipolar elétricos, coagular e dividir todas as ramificações para preparar um comprimento adequado para a colocação de clipe temporária depois e anastomose.
- Lateral para a traquéia e medial para o SCM, explorar a artéria carótida comum (CCA). Ela deve ser cuidadosamente exposta a partir da clavícula apenas para além da sua bifurcação em artérias carótidas interna e externa. Durante essa etapa, deve ser dada atenção novamente para evitar tração excessiva ao EJV que mais tarde poderão comprometer a desobstrução da anastomose.
3. Preparar a anastomose
- Ligadura da CCA com 10-0 Nylon apenas proximal à sua bifurcação. Em seguida, aplique um clipe temporária do proximal CCA tão perto da clavícula possível.
- Uma vez que o fluxo foi interrompido, transecto artéria logo abaixo da ligadura bifurcação e irrigar com soro fisiológico para lavar todo o sangue restante no interior do lúmen. Evite coagulação bipolar nesta etapa, uma vez que a lesão térmica para a parede da artéria poderia colocar o futuro anastomose em perigo.
- A fim de melhorar a visibilidade das arestas do EJV, a parede medial é marcado com uma caneta de marcação azul ao longo do curso do venotomia planeado. Uma vez que o EJV é marcado, utilizar um fio de sutura 10-0 para ligar a extremidade distal como caudal quanto possível e aplicar um grampo vascular temporária na extremidade proximal como craniano como possíveis.
- Com uma multa de 30 G agulha e seringa 0,5 ml, fazer uma abertura inicial sobre a área demarcada da EJV e imediatamente irrigar o lúmen com soro fisiológico para evitar a formação de trombos. Em seguida, estender a venotomia com a microtesouraaté que o comprimento é de cerca de 2-3 vezes o diâmetro do CCA. Evite violento alongamento e prestar atenção para manter a borda afiada e arrumado.
- Aproximar a extremidade da CCA para o EJV. Adicione uma incisão lateral de corte no final do dador CCA para ajustar o diâmetro para o comprimento para o tamanho venotomia (Figura 2).
4. End-to-side Anastomosis
- Utilize uma sutura de nylon 11-0 monofilamento para a anastomose CCA-a-EJV ponta-a-lado. Sutura-se a parede medial da anastomose numa direcção craneo-caudal é o passo inicial. Cada ponto deve ser colocado a partir de fora para dentro da parede venosa primeira (Figura 3) e a partir de dentro para fora da parede arterial (Figura 4) próxima. Isto irá manter o nó na superfície exterior dos vasos anastomóticos em todos os momentos (Figura 5). Ou interrompido ou suturas contínuas podem ser utilizados, mas todas as suturas contínuas devem ser apertados como o passo final.
- Once a parede medial foi suturada, repita o procedimento a partir do caudal para craniana com a parede lateral. Agora toda a costura deve ser colocado a partir de fora para dentro da parede arterial e primeiro a partir de dentro para fora da parede da veia próxima. Irrigação Saline vai ajudar a manter o lúmen da anastomose visível em todos os momentos durante o procedimento.
- Depois de terminar todas as etapas da anastomose, a remover o grampo temporária da veia da primeira e da artéria próxima. O sangue arterial fluirá no EJV com pouca ou nenhuma exsudação da anastomose (ver vídeos modelo VH e modelo VH 2). O sangramento mínimo deve parar sem usar compressão de algodão sobre a anastomose. Isso deve ser evitado, de modo a prevenir a trombose da veia delicada.
- Uma vez que o fluxo pulsátil através da anastomose e é confirmado e sem sangramento aparente é observada, irrigar o campo cirúrgico com solução salina e fechar a incisão cervical com uma sutura de nylon 6-0. Finalmente, administrar mais 0,15 ml de intrapbrupenorphine eritoneal para controle da dor pós-operatória e 0,2-0,4 ml de solução salina 0,9% subcutânea para reabastecer qualquer perda de sangue durante a cirurgia.
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Representative Results
Um resultado positivo do modelo é uma fístula arteriovenosa patente que induz hipertensão venosa no cérebro murino. Para validar o modelo, inicialmente medido a pressão venosa intracraniana no seio sagital dos ratos em 2, 3 e 4 semanas após a cirurgia. 6 ratinhos foram atribuídos diferentes para cada grupo de tempo. A pressão do seio foi de 8,8 ± 1,2 mm Hg no grupo medido de duas semanas após a cirurgia. Nos 6 ratos medidos 3 semanas após a cirurgia, a pressão do seio foi de 4,7 ± 1,4 mmHg. Finalmente, os ratinhos 6 medida 4 semanas após a cirurgia do seio tinha uma pressão de 3,9 ± 0,6 mmHg (Figura 6). Pós-operatória da pressão da cavidade 2 semanas era significativamente mais elevada do que a pressão na cavidade 3 e 4 semanas (ambos p <0,001).
No entanto, a técnica complexa necessária para medir a pressão da cavidade não é necessária para assegurar a patência fístula e hipertensão venosa, numa base regular. Em vez disso, o resultado desejado pode ser checked por inspeção direta da fístula e por sinais clínicos de hipertensão venosa no mouse.
A permeabilidade da fístula pode ser directamente inspeccionados no fim do procedimento cirúrgico, por dois métodos. O primeiro consiste de obstruir temporária do cranial EJV para a área de anastomsis com uma pinça de joalheiro. Este ponto é agora a única via de saída do sangue que vem do CCA. Se a anastomose término-lateral é patente, o EJV distensíveis vai inchar, imediatamente, como mostrado no vídeo teste de perviedade 1. O segundo método é realizado pela oclusão do enxerto de veia distal à anastomose e, lentamente, esvaziando-a ou "ordenha" it com um par de pinças de joalheiro. Como mostrado no segundo vídeo para teste de perviedade, uma vez que a oclusão é liberado, uma anastomose patente deve reabastecer rapidamente o segmento esvaziado.
Se o modelo estiver funcionando, o alargamento do olho do rato deve ser observado 24 horas após a cirurgia. Este may ser devido à drenagem venosa composto da cabeça e pescoço. Embora ambos os olhos obter alargada, após a cirurgia, o fenómeno é mais proeminente no lado operado como pode ser observado na Figura 7.
Figura 1:. A incisão da pele uma incisão cervical de linha média horizontal em toda a área inferior do pescoço do rato e uma tracção suave das glândulas salivares expõe a veia jugular externa direita (EJV). Observe a localização superficial do EJV que merece uma incisão na pele cuidado para evitar lesões à veia delicada.
Figura 2:. Preparação da anastomose A parede medial do EJV foi assinalada com uma linha azul ao longo do curso do venotomia planeado. A inci lado de cortemento no final do dador CCA é realizada para ajustar o diâmetro da artéria com o comprimento para a venotomia.
Figura 3:. Fora-in A parede medial da anastomose está sendo suturado num sentido craneo-caudal com o ponto 11-0 primeiro colocado de fora para dentro da parede venosa.
Figura 4:. Dentro Saída A agulha é conduzido aqui a partir de dentro para fora da parede arterial para completar um fio de sutura na parede medial, de forma adequada para manter o nó na superfície exterior da anastomose.
Figura 5: Manter o nó fora Nota ho.w o nó da sutura interrompida escolhida neste caso permanece fora do lúmen das embarcações para evitar a formação de trombos que obstruem a fístula.
Figura 6:. Análise de pressão Sinus Este gráfico Bart apresenta graficamente a diferença na pressão da cavidade intracraniana medido em mmHg em 2, 3 e 4 semanas após a cirurgia.
Figura 7:. Proptose Um dia após a cirurgia, os dois olhos são ampliadas, mas o alargamento do olho direito (ipsilateral à cirurgia) é mais proeminente.
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Discussion
Hipertensão venosa cerebral sustentada foi intimamente relacionada com as manifestações clínicas mais graves e mau prognóstico em pacientes com FAV dural e MAVs cerebrais 3. Estes efeitos da CVH têm sido amplamente estudado em modelos de ratos 1,2,8. Um modelo equivalente no rato permitiria o uso de animais geneticamente modificados que acabaria por permitir a análise das vias moleculares envolvidas na patogênese da hipertensão venosa e sua relação com a FAV dural e AVM cérebro.
Aqui, nós relatamos um método para criar hipertensão venosa cerebral no rato adulto através de uma carótida-jugular fístula end-to-side. Este novo modelo melhora as modelos carótida-jugular fístula bem descritos no rato, traduzindo-a para o mouse e permitindo, assim, a possibilidade de investigar vias moleculares e terapias genéticas acima mencionado.
Problemas comuns encontrados e Sugestões
Outro pro comumblema está prejudicando a veia com tração excessiva, compressão, ou dissecção ao longo de seu curso. Portanto, a exposição EJV deve ser cuidadosamente realizada sob o microscópio para identificar o plano apropriado de dissecção. Todos os pequenos ramos que drenam para ele também deve ser identificado e coagulado. Isso irá evitar hemorragia descontrolada exigindo compressão da veia e irá fornecer redundância suficiente para evitar o excesso de tensão.
Não é incomum ter má função da fístula após a remoção dos grampos temporários. Neste caso, o primeiro passo deve ser procurar possíveis pontos de tensão ou angulação no CCA. Além disso dissecção da artéria ou ressecção parcial do músculo esternocleidomastóideo vai resolver esse problema. No entanto, se a função pobre continua após estas manobras, deve-se suspeitar de trombose da anastomose. Nesse caso, em vez de reabertura do local da anastomose e remover o trombo, que recomendam a realização de um novoanastomose craniana à anterior. Em nossa experiência, uma terceira anastomose é impossível. Não há comprimento suficiente do EJV e o rato não tolerar a anestesia por um longo período de tempo.
Limitações da técnica
As principais limitações da técnica incluem: (1) o diminutivo anatomia dos vasos requer técnicas de microcirurgia avançada e uma curva de aprendizagem mais longo do que para o modelo equivalente no rato; (2) a desobstrução da anastomose é muitas vezes comprometida por formação de trombos e o comprimento do EJV rato só permitirá uma tentativa extra para resolver esta questão; e (3) a cirurgia pode demorar até três horas, expondo o mouse para um período longo de anestesia. No entanto, seguindo as sugestões técnicas acima proposto e mantendo o mouse quente e hidratado durante o procedimento, uma patente CCA-to-EJV pode ser realizada com sucesso e uma elevada taxa de sobrevivência dos animais obtidos em nossa experiência.
Um modelo venosa cerebral confiável e durável hipertensão em ratos é uma importante ferramenta que pode atender a uma ampla série de efeitos em pesquisa cerebrovascular 13-16. Ao adicionar a tecnologia nocaute de camundongos transgênicos, este novo modelo deverá facilitar ainda mais a pesquisa in vivo relacionado ao gene para todas as patologias associadas à hipertensão venosa cerebral.
Anteriormente, outros autores têm descrito o modelo de hipertensão venosa no rato e tê-lo usado para estudar a fisiopatologia da dural AVF e AVM cérebro 4,5,8,9. Vamos agora descrever o método de traduzir com sucesso este mesmo modelo para os ratos, portanto, abrindo as suas potenciais aplicações para todos os tipos de testes de tratamento genético.
Conclusão
Nós demonstramos aqui um protocolo para conseguir uma patente CCA-to-EJV anastomose no rato adulto. Essa fístula fornecea hipertensão venosa cerebral durável que tem sido uma ferramenta útil para desenvolver diferentes modelos de doenças cerebrovasculares no rato. Ao fornecer este passo inicial para desenvolver esses mesmos modelos nos camundongos, abrimos a possibilidade de testar tratamentos genéticos para as doenças cerebrovasculares.
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Disclosures
Os procedimentos experimentais com animais de laboratório foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animal Institucional da Universidade da Califórnia, em San Francisco (UCSF).
Os autores não têm potenciais conflitos de interesse relacionados com os medicamentos e materiais utilizados neste procedimento.
Acknowledgments
Este projeto é parcialmente financiado pelo NIH T32 GM008440 para Espen Walker, R01 NS27713 para William L.Young, P01 NS44155 para William L.Young e Hua Su, R21 NS070153 para Hua SU e pela American Heart Association AHA 10GRNT3130004 para Hua Su. Dr Ana Rodríguez-Hernández é apoiado por uma bolsa da "Obra La social Caixa"
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Sterile Microsuture | Arosurgical Ic. | VT5A010Q10 | |
| 11-0 Sterile Microsuture | Arosurgical Ic | VT4A00N07 | |
| DUROTIP Scissors | Aesculap | BC210R | |
| Micro-Adson Tissue Forceps | Aesculap | BD510R | |
| Microscissors | Aesculap | OC496R | |
| Micro Forceps #5 Jewelers | Aesculap | BD331R | |
| Angled Jewelers Forceps | Aesculap | BD329R | |
| Micro Suture Forceps | Aesculap | BD338R | |
| DUROGRIP Needle Holder | Aesculap | BM009R |
References
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