Summary
We beschrijven een methode waarbij een betrouwbaar model van cerebrale veneuze hypertensie bij volwassen muizen. Dit model wordt algemeen beschreven en getest in de rat. Deze nieuwe tegenhanger in de muizen opent de mogelijkheid om genetische gemodificeerde dieren en daardoor verbreedt de toepassing van het model.
Abstract
Het begrip van de pathofysiologie van hersenen arterioveneuze misvormingen en arterioveneuze fistels heeft dankzij diermodellen verbeterd. Een rat model creëren van een kunstmatige fistel tussen de gemeenschappelijke halsslagader (CCA) en de externe halsader (EJV) is op grote schaal beschreven en bleek technisch haalbaar is. Dit construct veroorzaakt een consistente cerebrale veneuze hypertensie (CVH), en derhalve heeft bijgedragen bestuderen van de bijdrage van veneuze hypertensie vorming, klinische symptomen en prognose hersenen AVM en durale AVFs. Gelijkwaardig muizen modellen zijn alleen nauwelijks beschreven en hebben aangetoond moeite met stenose van de fistel. Een gevestigde muizenmodel zal de studie van niet alleen pathofysiologie, maar ook de potentiële genetische therapieën voor deze cerebrovasculaire ziekten mogelijk.
We geven een voorbeeld van arterioveneuze fistels die een duurzaam intracraniële veneuze hypertensie produceert de muis. Microchirurgische anastomose of de muizen CCA en EJV moeilijk kan te wijten zijn aan verkleinwoord anatomie en vaak resulteren in een niet-patent fistel. In deze stap voor stap protocol richten we alle belangrijke uitdagingen die tijdens deze procedure. Te hoge terugtrekken van de ader tijdens de belichting, met 11-0 hechtingen plaats van 10-0 en maken een zorgvuldig geplande end-to-side anastomose zijn enkele cruciale stappen. Hoewel deze methode vereist geavanceerde microchirurgische vaardigheden en een langere leercurve het equivalent in de rat, kan consequent worden ontwikkeld.
Deze nieuwe model is ontworpen om transgene muizen technieken integreren met een eerder gevestigde experimentele systeem dat nuttig hersenen AVM en durale AVFs studie is gebleken. Door het openen van de mogelijkheid om transgene muizen, kan een breder spectrum van geldige modellen worden verwezenlijkt en genetische behandelingen kunnen ook getest. De experimentele construct kan verder worden aangepast aan de studie van othaar cerebrovasculaire ziekten die verband houden met veneuze hypertensie zoals migraine, voorbijgaande globale amnesie, voorbijgaande monoculaire blindheid, enz.
Introduction
Diermodellen van cerebrale veneuze hypertensie hebben bewezen een belangrijk instrument in het begrip van de pathofysiologie van hersenen arterioveneuze misvormingen en arterioveneuze fistels 1-7 zijn. De meest gebruikte is het rattenmodel gemaakt door een kunstmatige fistel tussen de halsslagader (CCA) en de uitwendige halsader (EJV), die een consistente cerebrale veneuze hypertensie (CVH) in de rat 1,8-10 veroorzaakt. Equivalent muizen modellen, door het openen van de mogelijkheid om verschillende transgene muizenstammen, zou verdere studie niet alleen pathofysiologie, maar ook de potentiële genetische therapieën voor deze cerebrovasculaire ziekten mogelijk. Bovendien is de experimentele construct kan ook verder aangepast aan de studie van andere cerebrovasculaire aandoeningen gerelateerd aan veneuze hypertensie zoals migraine, Algemeen geheugenverlies, voorbijgaande monoculaire blindheid, etc. 11 Echter, eerdere pogingen construeren deze muizen modellen have aangetoond dat de problemen met de doorgankelijkheid van de fistel als gevolg van het verkleinwoord anatomie 5,12. Hier beschrijven we stap voor stap protocol voor een succesvolle anastomose van de muizen CCA en EJV die zich vertaalt in een langdurige octrooi fistel en een duurzame veneuze hypertensie bij de muis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de muis
- Induceren algemene anesthesie in de muis met isofluraan gas. Injecteren 0,15 ml intraperitoneale brupenorphine voor pijnbestrijding. Voordat u verder gaat, controleer dan of de anesthesie niveau bevredigend is door een prik poten van de muis.
- Plaats de muis dorsale decubitus met de vier door plakband vast ledematen. Verwijder het haar van de hals en de borst met een schaar. Subcutaan toedienen 0,2-0,4 ml 0,9% zoutoplossing om de muis gehydrateerd tijdens de chirurgische procedure te houden.
- Bereid de operatieve veld na een strikt steriele methode. Het gebied van de huid incisie worden gereinigd met 90% alcohol.
2. Opheldering van de halsslagader en de externe halsader
- Wordt horizontale middellijn cervicale incisie in het onderste hals van de muis. Na verdieping van de wond, verheffen de speekselklieren en cervicale zacht weefsel door tenraction hechtdraad (figuur 1). Bloot te leggen van de juiste externe halsader (EJV) lateraal van de M. sternocleidomastoideus (SCM). Deze stap moet worden uitgevoerd onder de microscoop, omdat overmatige tractie over de ader kan het beschadigen en veroorzaken de trombose.
- Ontleden zorgvuldig de juiste EJV zijn loop van het sleutelbeen aan de schedelbasis. Meestal elektrische bipolaire tang, stollen en verdeel dat takken tot een adequate lengte voor te bereiden op de latere tijdelijke clip plaatsing en anastomose.
- Lateraal van de luchtpijp en mediaal van de SCM, verken de gemeenschappelijke halsslagader (CCA). Het dient voorzichtig bloot van het sleutelbeen tot net voorbij de vertakking in de externe en interne halsslagaders. Tijdens deze stap dient aandacht weer aan overmatige trekkracht op de EJV die later kunnen compromitteren de doorgankelijkheid van de anastomose voorkomen.
3. Voorbereiden van de Anastomosis
- Afbinden het CCA met 10-0 Nylon proximaal aan de vertakking. Breng vervolgens tijdelijk clip over de proximale CCA zo dicht bij het sleutelbeen mogelijk.
- Zodra de stroom is onderbroken, doorsnijden de slagader net onder de splitsing ligatuur en irrigeren het met een zoutoplossing te spoelen eventuele resterende bloed in het lumen. Vermijd bipolaire coagulatie in deze stap, aangezien thermische schade aan de slagaderwand de toekomst anastomose in gevaar kunnen brengen.
- Om de zichtbaarheid van de randen van de EJV verbeteren, wordt de mediale wand gemarkeerd met een blauwe markering pen langs de loop van de geplande venotomie. Zodra de EJV gemarkeerd, gebruikt een 10-0 hechtdraad aan het distale uiteinde zo caudale mogelijk ligeren en breng een tijdelijke vasculaire clip op het proximale uiteinde zo craniale mogelijk.
- Met een fijne 30 G naald en 0,5 ml spuit, maken een eerste diafragma over het gemarkeerde gedeelte van het EJV en onmiddellijk irrigeren het lumen met zoutoplossing om stolselvorming te voorkomen. Vervolgens breiden de venotomie met de microscissorstotdat de lengte is ongeveer 2-3 maal de diameter van de CCA. Vermijd hevige stretching en aandacht besteden aan een scherpe en nette snede te houden.
- Geschatte het einde van de CCA naar de EJV. Voeg een gen zijdelingse insnijding in het donor einde van de CCA naar de diameter aan te passen aan de lengte van de venotomie grootte (figuur 2).
4. End-to-side anastomose
- Gebruik een 11-0 monofilament nylon hechtdraad voor de CCA-to-EJV end-to-side anastomose. Hechten van de mediale wand van de anastomose in een craneo-caudale richting is de eerste stap. Elke steek moet van worden aangebracht buiten in de veneuze wand eerste (figuur 3) en van binnenuit de arteriële wand (figuur 4) volgende. Dit zal de knoop houden aan de buitenzijde van de anastomose schepen te allen tijde (figuur 5). Ofwel onderbroken of continue hechtingen worden gebruikt, maar continue hechtingen worden vastgezet als de laatste stap.
- Onvu de mediale wand is gehecht, herhaalt u de procedure vanaf caudaal naar craniaal de laterale wand. Nu moet elke steek van buiten-in de vaatwand eerste en van binnenuit de veneuze muur naast geplaatst worden. Zoute irrigatie zal helpen om het lumen van de anastomose te allen tijde zichtbaar tijdens de procedure.
- Na alle stappen van de anastomose, verwijdert de tijdelijke clip van de ader eerste en de slagader volgende. Het arteriële bloed stroomt in de EJV met geen of weinig lekt uit de anastomose (zie video VH model en VH-2-model). De minimale bloeden moet stoppen zonder het gebruik van katoen compressie over de anastomose. Dit moet worden vermeden om trombose van de delicate ader voorkomen.
- Eenmaal pulserende stroom door de anastomose wordt bevestigd en zonder duidelijke bloeden wordt waargenomen, irrigeren het chirurgische veld met een zoutoplossing en sluit de cervicale incisie met een 6-0 nylon hechtdraad. Tenslotte, toedienen 0,15 ml meer intraperitoneal brupenorphine voor postoperatieve pijnbestrijding en 0,2-0,4 ml subcutaan 0,9% zoutoplossing om enig bloedverlies te vullen tijdens de operatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een succesvolle uitkomst van het model is een octrooi arterioveneuze fistel dat veneuze hypertensie induceert in de muizen hersenen. Om het model te valideren we aanvankelijk gemeten intracraniale veneuze druk in het sagittale sinus van de muizen op 2, 3 en 4 weken na de operatie. 6 verschillende muizen werden toegewezen aan elke tijdsvariant. De sinus druk was 8,8 ± 1,2 mmHg in de groep gemeten twee weken na de operatie. In de 6 muizen gemeten 3 weken na de operatie, de sinus druk was 4,7 ± 1,4 mmHg. Tenslotte, de 6 muizen gemeten 4 weken na de operatie had een sinus druk van 3,9 ± 0,6 mmHg (figuur 6). Postoperatieve 2 weken sinusdruk was significant hoger dan sinus druk bij 3 en 4 weken (beide p <0,001).
De ingewikkelde technieken nodig zijn om de sinus druk te meten is niet nodig fistula doorgankelijkheid en veneuze hypertensie zorgen regelmatig. In plaats daarvan kan het gewenste resultaat zijn checked door directe inspectie van de fistel en klinische symptomen van veneuze hypertensie bij de muis.
De openheid van de fistel kan direct aan het einde van de chirurgische procedure worden geïnspecteerd door twee methoden. De eerste bestaat uit tijdelijke belemmeren de EJV craniaal van de anastomsis met een juwelierstangetje. Dit punt is nu de enige uitstroom van het bloed afkomstig van de CCA. Als de end-to-side anastomose is octrooi, zal de uitzetbare EJV onmiddellijk ballon uit, zoals aangegeven in de doorgankelijkheid testvideo 1. De tweede methode wordt uitgevoerd door het afsluiten van de ader graft distaal van de anastomose en langzaam leeg te maken of "melken" het met een pincet juwelier. Zoals in de onderste Video patency test, nadat de occlusie wordt vrijgegeven, een octrooi anastomose moet snel bijvullen de geleegde segment.
Indien het model werkt, moet uitbreiding van de muis oog op gewezen 24 uur na de operatie. Deze maY gevolg bestaat veneuze afvoer van hoofd en nek. Hoewel beide ogen worden vergroot na de operatie, het fenomeen is meer prominent op de geopereerde zijde zoals kan worden waargenomen in figuur 7.
Figuur 1:. Huidincisie Een horizontale middellijn cervicale incisie over het lagere nek van de muis en een zachte tractie van de speekselklieren onthult de juiste externe halsader (EJV). Let op de oppervlakkige ligging van het EJV dat een zorgvuldige huidincisie om eventuele verwondingen aan de delicate ader voorkomen garandeert.
Figuur 2:. Voorbereiden van de anastomose heeft de mediale wand van de EJV zijn gemarkeerd met een blauwe lijn langs de loop van de geplande venotomie. Een side-cut incisie in het donor einde van de CCA wordt uitgevoerd om de diameter van de slagader te passen aan de lengte van de venotomie.
Figuur 3:. Buiten in de mediale wand van de anastomose wordt gehecht in een craneo-caudaal met 11-0 steek eerste geplaatst buiten in de veneuze wand.
Figuur 4:. Inside-out naald wordt hier gereden van binnenuit de vaatwand om een hechting te voltooien in de mediale wand op de geschikte manier om de knoop op het buitenoppervlak van de anastomose te houden.
Figuur 5: Het houden van de knoop buiten Opmerking ho.w de knoop van de onderbroken hechtdraad in dit geval gekozen blijft buiten het lumen van de vaartuigen te trombusvorming dat de fistel zou af te sluiten te voorkomen.
Figuur 6:. Sinusdruk analyse Dit Bart diagram geeft grafisch het verschil in de intracraniale sinus tegendruk in mmHg bij 2, 3 en 4 weken na de operatie.
Figuur 7:. Proptosis Een dag na de operatie, beide ogen zijn vergroot, maar het rechter oog uitbreiding (ipsilateraal aan de operatie) is meer prominent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aanhoudende cerebrale veneuze hypertensie is nauw verwant met meer ernstige klinische manifestaties en slechte prognose bij patiënten met durale AVFs en hersenen AVM 3. Deze effecten van CVH zijn uitgebreid bestudeerd in rat modellen 1,2,8. Een equivalent model in de muis is het gebruik van genetisch gemodificeerde dieren die uiteindelijk zou de analyse van moleculaire wegen betrokken bij de pathogenese van veneuze hypertensie en de relatie met durale AVF en hersenen AVM mogelijk.
Hier melden wij een methode waarbij cerebrale veneuze hypertensie bij volwassen muizen via een end-to-side carotis-jugularis fistel. Dit nieuwe model verbetert de goed beschreven carotis-halsader fistel modellen in de rat door het te vertalen naar de muis en waardoor de eerder genoemde mogelijkheid van een onderzoek naar de moleculaire pathways en gentherapieën.
Voorkomende problemen en suggesties
Een andere veel voorkomende probleem wordt beschadiging van de ader met overmatige trek-, compressie, of dissectie zijn loop. Daarom moet de EJV belichting zorgvuldig worden uitgevoerd onder de microscoop om het juiste niveau van dissectie identificeren. Alle kleine takken die afwateren in het moet ook worden geïdentificeerd en gecoaguleerd. Dit voorkomt ongecontroleerde bloeden waarbij compressie van de ader en zal voldoende redundantie te verstrekken aan overmatige spanning te voorkomen.
Het is niet ongewoon om een slechte werking van de fistel hebben na de tijdelijke clips verwijderen. In dit geval moet de eerste stap zijn op zoek naar mogelijke punten van spanning of hoeking in de CCA. Verdere dissectie van de slagader of gedeeltelijke resectie van de sternocleidomastoideus dit probleem oplossen. Echter, als een slechte functie blijft na deze manoeuvres, trombose van de anastomose site moet worden vermoed. In dat geval, in plaats van heropening van de anastomose en de verwijdering van de trombus, echter raadzaam nieuwanastomose craniaal van de vorige. In onze ervaring, een derde anastomose is onmogelijk. Er is niet genoeg lengte van de EJV en de muis niet tolereren verdoving voor zo'n lange tijd.
Beperkingen van de Techniek
De belangrijkste beperkingen van deze techniek omvatten: (1) de kleine anatomie van de vaartuigen vereist geavanceerde microchirurgische vaardigheden en een langere leercurve dan het equivalent model in de rat; (2) de doorgankelijkheid van de anastomose wordt vaak aangetast door trombusvorming en de lengte van de muis EJV laat alleen een extra poging dit probleem op te lossen; en (3) de operatie kan tot drie uur, het blootstellen van de muis op een lange narcose periode. Echter, na de technische bovenstaande suggesties voorgesteld en het houden van de muis warm en gehydrateerd tijdens de procedure, kan een patent CCA-to-EJV goed worden uitgevoerd en een hoge overlevingskans van de behaalde resultaten in onze ervaring dieren.
Een betrouwbare en duurzame cerebrale veneuze hypertensie model bij muizen is een belangrijk instrument dat een breed aantal doelen kan dienen bij cerebrovasculaire onderzoek 13-16. Door toevoeging knockout technologie van transgene muizen, moet dit nieuwe model verder-verwant in vivo onderzoek van alle pathologieën geassocieerd met cerebrale veneuze hypertensie vergemakkelijken.
Eerder hebben andere auteurs het veneuze hypertensie model in de rat beschreven en hebben het gebruikt om de pathofysiologie van durale AVF en hersenen AVM 4,5,8,9 bestuderen. We beschrijven nu de methode succesvol vertalen hetzelfde model voor de muizen derhalve opent de potentiële toepassingen allerlei genetische modificatie tests.
Conclusie
We tonen hier een protocol om een patent CCA-to-EJV anastomose in de volwassen muis te bereiken. Deze fistel biedteen duurzame hersenen veneuze hypertensie, dat is een nuttig instrument om verschillende cerebrovasculaire ziekte modellen te ontwikkelen bij de rat. Door deze eerste stap diezelfde modellen te ontwikkelen in de muizen, hebben we de mogelijkheid te testen genetische behandelingen voor die cerebrovasculaire aandoeningen openen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De experimentele procedures met proefdieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Californië, San Francisco (UCSF).
De auteurs hebben geen potentiële belangenconflicten in verband met de drugs en materialen die worden gebruikt in deze procedure.
Acknowledgments
Dit project wordt gedeeltelijk ondersteund door NIH T32 GM008440 om Espen Walker, R01 NS27713 aan William L.Young, P01 NS44155 aan William L.Young en Hua Su, R21 NS070153 naar Hua SU en door de American Heart Association AHA 10GRNT3130004 naar Hua Su. Dr Ana Rodríguez-Hernández wordt ondersteund door een subsidie van "Obra Social La Caixa"
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Sterile Microsuture | Arosurgical Ic. | VT5A010Q10 | |
| 11-0 Sterile Microsuture | Arosurgical Ic | VT4A00N07 | |
| DUROTIP Scissors | Aesculap | BC210R | |
| Micro-Adson Tissue Forceps | Aesculap | BD510R | |
| Microscissors | Aesculap | OC496R | |
| Micro Forceps #5 Jewelers | Aesculap | BD331R | |
| Angled Jewelers Forceps | Aesculap | BD329R | |
| Micro Suture Forceps | Aesculap | BD338R | |
| DUROGRIP Needle Holder | Aesculap | BM009R |
References
- Bederson, J. B., Wiestler, O. D., Brüstle, O., Roth, P., Frick, R., Yaşargil, M. G. Intracranial venous hypertension and the effects of venous outflow obstruction in a rat model of arteriovenous fistula. Neurosurgery. 29, 341-350 (1991).
- Gao, P., Zhu, Y., Ling, F., Shen, F., Lee, B., Gabriel, R. A., Hao, Q., Yang, G. Y., Su, H., Young, W. L. Nonischemic cerebral venous hypertension promotes a pro-angiogenic stage through HIF-1 downstream genes and leukocyte-derived MMP-9. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1482-1490 (2009).
- Kim, H., Su, H., Weinsheimer, S., Pawlikowska, L., Brain Young, W. L. arteriovenous malformation pathogenesis: a response-to-injury paradigm. Acta Neurochir. Suppl. 111, 83-92 (2011).
- Lawton, M. T., Arnold, C. M., Kim, Y. J., Bogarin, E. A., Stewart, C. L., Wulfstat, A. A., Derugin, N., Deen, D., Young, W. L. Radiation arteriopathy in the transgenic arteriovenous fistula model. Neurosurgery. 62, 1129-1138 (2008).
- Lawton, M. T., Stewart, C. L., Wulfstat, A. A., Derugin, N., Hashimoto, T., Young, W. L. The transgenic arteriovenous fistula in the rat: an experimental model of gene therapy for brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 54, 1463-1471 (2004).
- Schaller, B., Graf, R., Sanada, Y., Tolnay, M., Rosner, G., Wienhard, K., Heiss, W., D, Hemodynamic changes after occlusion of the posterior superior sagittal sinus: an experimental PET study in cats. AJNR Am J Neuroradiol. 24, 1876-1880 (2003).
- Zhu, Y., Lawton, M. T., Du, R., Shwe, Y., Chen, Y., Shen, F., Young, W. L., Yang, G. Y. Expression of hypoxia-inducible factor-1 and vascular endothelial growth factor in response to venous hypertension. Neurosurgery. 59, 687-696 (2006).
- Herman, J. M., Spetzler, R. F., Bederson, J. B., Kurbat, J. M., Zabramski, J. M. Genesis of a dural arteriovenous malformation in a rat model. J. Neurosurg. 83, 539-545 (1995).
- Terada, T., Higashida, R. T., Halbach, V. V., Dowd, C. F., Tsuura, M., Komai, N., Wilson, C. B., Hieshima, G. B. Development of acquired arteriovenous fistulas in rats due to venous hypertension. J. Neurosurg. 80, 884-889 (1994).
- Yassari, R., Sayama, T., Jahromi, B. S., Aihara, Y., Stoodley, M., Macdonald, R. L. Angiographic, hemodynamic and histological characterization of an arteriovenous fistula in rats. Acta Neurochir (Wien). 146, 495-504 (2004).
- Solheim, O., Skeidsvoll, T. Transient global amnesia may be caused by cerebral vein thrombosis. Med. Hypotheses. 65, 1142-1149 (2005).
- Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. J Vasc Interv Radiol. 20, 946-950 (2009).
- Choi, E. J., Choi, E. J., Walker, E. J., Shen, F., Oh, S. P., Arthur, H. M., Young, W. L., Su, H. Minimal Homozygous Endothelial Deletion of Eng with VEGF Stimulation Is Sufficient to Cause Cerebrovascular Dysplasia in the Adult Mouse. Cerebrovascular diseases. 33, 540-547 (2012).
- Hao, Q., Su, H., Marchuk, D. A., Rola, R., Wang, Y., Liu, W., Young, W. L., Yang, G. Y. Increased tissue perfusion promotes capillary dysplasia in the ALK1-deficient mouse brain following VEGF stimulation. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, H2250-H2256 (2008).
- Su, H., Hao, Q., Shen, F., Zhu, Y., Lee, C. Z., Young, W. L., Yang, G. Y. Development of a cerebral microvascular dysplasia model in rodents. Acta Neurochir. Suppl. 105, 185-189 (2008).
- Walker, E. J., Su, H., Shen, F., Degos, V., Jun, K., Young, W. L. Bevacizumab Attenuates VEGF-Induced Angiogenesis and Vascular Malformations in the Adult Mouse Brain. Stroke; a journal of cerebral circulation. , (2012).
