Summary
Vi beskriver en metode for å lage en pålitelig modell for cerebral venøs hypertensjon hos voksne mus. Denne modellen er blitt omfattende beskrevet og testet i rotte. Denne nye motstykke i mus åpner muligheten for å bruke genetisk modifiserte dyr og derved utvider anvendelser av modellen.
Abstract
Forståelsen av patofysiologien av hjerne arteriovenøse misdannelser og arteriovenøse fistler har forbedret takket være dyremodeller. En rottemodell skape en kunstig fistel mellom den felles karotidarterie (CCA) og den ytre halsvenen (EJV) er blitt omfattende beskrevet og vist seg å være teknisk mulig. Denne konstruksjonen provoserer en konsistent cerebral venøs hypertensjon (CVH), og derfor har hjulpet studere bidraget av venøs hypertensjon til formasjon, kliniske symptomer, og prognose av hjerne AVMs og dural AVFs. Tilsvarende mus modeller har blitt bare knapt beskrevet og har vist problemer med stenose i fistel. En etablert murine modell ville tillate studiet av ikke bare patofysiologi men også potensielle genetiske terapi for disse cerebrovaskulære sykdommer.
Vi presenterer en modell av arteriovenøs fistel som gir en holdbar intrakranial venøs hypertensjon hos mus. Mikrokirurgisk anastomose of den murine CCA og EJV kan være vanskelig på grunn av minimale anatomi og ofte resultere i en ikke-patent fistel. I denne steg-for-steg-protokollen tar vi alle de viktige utfordringene som oppstår i løpet av denne prosedyren. Unngå for sterk tilbaketrekning av venen under eksponeringen, ved hjelp av 11-0 suturer i stedet for 10-0, og gjør et nøye planlagt ende-til-side anastomose er noen av de kritiske trinn. Selv om denne fremgangsmåten krever avanserte mikroevner og en lengre lærekurve som tilsvarer hos rotte, kan den gjennomgående utvikles.
Denne romanen modellen er designet for å integrere transgene mus teknikker med en tidligere veletablert eksperimentelt system som har vist seg nyttig å studere hjerne AVMs og dural AVFs. Ved å åpne muligheten for bruk av transgene mus, kan oppnås et bredere spektrum av gyldige modeller og genetiske behandlinger kan også bli testet. Den eksperimentelle konstruksjonen kan også bli ytterligere tilpasset til studiet av othennes cerebrovaskulære sykdommer relatert med venøs hypertensjon som migrene, forbigående global amnesi, forbigående monocular blindhet, etc.
Introduction
Dyremodeller av cerebral venøs hypertensjon har vist seg å være et viktig verktøy i forståelsen av patofysiologien av hjerne arteriovenøse misdannelser og arteriovenøse fistler 1-7. Den mest brukte er rottemodell opprettet gjennom en kunstig fistel mellom den felles karotidarterie (CCA) og den ytre halsvenen (EJV), som provoserer en konsistent cerebral venøs hypertensjon (CVH) i rotte 1,8-10. Tilsvarende mus modeller, ved å åpne muligheten for å bruke forskjellige transgen musestammer, ville tillate videre studier på ikke bare patofysiologi men også potensielle genetiske behandlingsformer for disse cerebrovaskulære sykdommer. Videre eksperimentell konstruksjon kan også bli ytterligere tilpasset til studiet av andre cerebrovaskulære sykdommer relatert med venøs hypertensjon som migrene, forbigående global amnesi, forbigående monocular blindhet, etc. 11 Men tidligere forsøk på å konstruere disse mus modeller have demonstrerte vanskelighetene med åpenheten til det fistel på grunn av den bittelille anatomi 5,12. Her beskriver vi vår trinn-for-trinn-protokollen for en vellykket anastomose i muse CCA og EJV som oversetter i et langsiktig patent fistel og en holdbar venøs hypertensjon hos mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klar Mouse
- Indusere narkose i musen med isofluran gass. Injisere 0,15 ml intraperitoneal brupenorphine for smertebehandling. Før du fortsetter, sjekk om anestesi nivået er tilfredsstillende ved stikk musens poter.
- Sette musen i ryggleie, med de fire lemmer fastsatt av teip. Fjerne hår av halsen og den øvre del av brystet med en saks. Via subkutan injeksjon administreres 0,2 til 0,4 ml av 0,9% saltløsning for å holde musen hydrert i løpet av den kirurgiske prosedyren.
- Klargjør operative feltet etter en streng steril metode. Området av huden innsnitt skal rengjøres med 90% alkohol.
2. dissekere arteria carotis communis og Ekstern jugularvenen
- Lage en horisontal midtlinje cervical snitt over nedre nakken på musa. Etter utdype såret, heve spyttkjertlene og cervical bløtvev ved hjelp vedraction sutur (figur 1). Eksponere riktig ytre halsvenen (EJV) lateralt for sternocleidomastoideus muskelen (SCM). Dette trinnet skal utføres under mikroskopet, siden overdreven trekkraft over venen kan skade den og indusere sin trombose.
- Dissekere nøye rett EJV langs elva fra krageben til skallebasis. Vanligvis elektriske bipolar tang, koagulere og dele noen grener for å forberede en tilstrekkelig lengde for senere midlertidig klippet plassering og anastomose.
- Lateral til luftrøret og medialt til SCM, utforske den felles karotidarterie (CCA). Det bør være nøye utsatt fra krageben til bare utover sin delinger inn i de eksterne og interne carotis. Under dette trinnet, bør det legges vekt på nytt for å unngå overdreven trekkraft til EJV som senere kunne kompromittere åpenheten til anastomosen.
3. Klar Anastomose
- Ligate CCA med 10-0 Nylon bare proksimalt for sin delinger. Deretter gjelder en midlertidig holderen over den proksimale CCA så nær krageben som mulig.
- Når strømmen er blitt avbrutt, skjære over arteria like under forgreningen ligatur og vanne den med saltoppløsning for å vaske ut eventuelle gjenværende blod inne i lumen. Unngå bipolar koagulering i dette trinnet, siden termisk skade på blodåreveggen kunne sette fremtiden anastomose i fare.
- For å forbedre synligheten av kantene av EJV, er mellomveggen er merket med en blå tusjpenn langs løpet av den planlagte venotomy. Når EJV er markert, kan du bruke en 10-0 sutur for å ligere den distale enden som hale som mulig og bruke en midlertidig vaskulær klipp på den proksimale enden som kranie som mulig.
- Med en fin 30 G nål og 0,5 ml sprøyte, foreta en første åpning i løpet av det markerte området av EJV og umiddelbart vanne lumen med saltvann for å unngå blodpropp dannelse. Deretter forlenge venotomy med microscissorsinntil lengden er omtrent 2 til 3 ganger diameteren av CCA. Unngå voldelig stretching og ta hensyn til å holde en skarp og ryddig cutting edge.
- Tilnærmet slutten av CCA til EJV. Foreta en side snitt snitt i donor enden av CCA å justere diameteren til lengden til venotomy størrelse (figur 2).
4. Ende-til-side Anastomose
- Bruke et monofilament nylon 11-0 sutur for CCA-til-EJV ende-til-side anastomose. Sy den mediale vegg av anastomosen i en cráneo-caudal retning er det første trinnet. Hver maske bør plasseres utenfra-i veneveggen først (figur 3) og fra innsiden ut arterieveggen (figur 4) neste. Dette vil holde knuten på den utvendige overflate av de anastomotisk fartøy til enhver tid (figur 5). Enten avbrutt eller kontinuerlig suturer kan benyttes, men alle kontinuerlige suturer skal strammes som det siste trinnet.
- ONCE mediale vegg har blitt sydd, gjenta prosedyren fra hale til kranie med sideveggen. Nå hver maske bør plasseres utenfra-i arterieveggen først og fra innsiden ut veneveggen neste. Saltvann vanning vil bidra til å holde hulrommet i anastomosen er synlig til enhver tid i løpet av prosedyren.
- Etter å ha fullført alle trinnene i anastomosen, fjerne den midlertidige klipp fra venen først og fra arterien neste. Den arterielle blod vil strømme inn i EJV med ingen eller liten rant fra anastomosen (se video VH modell og VH-modell 2). Minimal blødning bør slutte uten å bruke bomull kompresjon over anastomosen. Dette må unngås for å forhindre trombose i den skjøre vene.
- Når pulsatil strømme gjennom anastomose er bekreftet og ingen åpenbar blødning er observert, vanne den kirurgiske feltet med saltvann og lukke livmorhals snittet med en 6-0 nylon sutur. Til slutt, administrere 0,15 ml mer av intraperitoneal brupenorphine for postoperativ smertebehandling og 0,2-0,4 ml subkutan 0,9% saltvann til å fylle eventuelle blodtap under operasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et vellykket resultat av modellen er et patent arteriovenøs fistel som induserer venøs hypertensjon hos murine hjernen. Å validere modellen vi først målte intrakranielt venetrykk i sagital sinus av musene på to, tre og fire uker etter operasjonen. 6 forskjellige mus ble tildelt hver gang gruppen. Sinus Trykket var 8,8 ± 1,2 mmHg i gruppen målt to uker etter operasjonen. I de seks mus målte tre uker etter operasjonen, sinus press var 4,7 ± 1,4 mmHg. Til slutt måles de 6 mus fire uker etter operasjonen hadde en sinus trykk på 3,9 ± 0,6 mmHg (figur 6). Postoperativ 2 ukers sinus trykket var betydelig høyere enn sinus trykk ved 3 og 4 uker (både p <0,001).
Imidlertid er den komplekse teknikk som kreves for å måle sinus trykket ikke er nødvendig for å sikre åpenhet fistel og venøs hypertensjon på en regelmessig basis. I stedet kan det ønskede resultatet være checked ved direkte inspeksjon av fistelen og ved kliniske tegn på venøs hypertensjon hos mus.
Åpenheten til fistelen direkte kan kontrolleres ved slutten av den kirurgiske prosedyren av to metoder. Den første består av midlertidig hindrer EJV kranie til anastomsis område med en gullsmed tang. Dette punktet er nå den eneste strøm av blodet kommer fra CCA. Dersom ende-til-side anastomose er patentet vil det distensible EJV umiddelbart ballongen ut som vist i åpenhetstest video 1. Den andre metoden blir utført ved okkludering av venen pode distalt for anastomose og langsomt tømmes eller "melking" it med et par av gullsmed tang. Som vist på den andre videoen for åpenhetstest, når okklusjon er utgitt, en patent anastomose bør raskt fylle den tomme segmentet.
Dersom modellen fungerer, bør utvidelse av musen øye bemerkes 24 timer etter operasjonen. Dette may skyldes består venøs drenering av hode og nakke. Selv om begge øynene få forstørret etter operasjonen, er fenomenet mer fremtredende på operert side som kan observeres i figur 7.
Fig. 1: Hud innsnitt En horisontal midtlinje cervikalt snitt på tvers av den nedre halsområdet av mus, og en myk trekkraft fra spyttkjertlene eksponerer den høyre eksterne halsvene (EJV). Legg merke til den overfladiske plasseringen av EJV som garanterer et forsiktig snitt i huden for å forhindre eventuelle skader på den delikate blodåre.
Figur 2:. Klar anastomose Den mediale vegg av EJV har blitt markert med en blå linje langs løpet av den planlagte venotomy. En side-cut INCIsjon i donor-enden av CCA er utført for å justere diameteren av arterien til lengden til venotomy.
Figur 3:. Outside-in Den mediale vegg av anastomosen blir sutureres i en cráneo-kaudal retning med 11-0 sting først plassert fra utsiden-i veneveggen.
Fig. 4: Innvendig ut Nålen drives her fra innsiden ut arterieveggen for å fullføre en sutur i mellomveggen på en passende måte for å holde knuten på den utvendige overflate av anastomosen.
Figur 5: Holde knuten utenfor Obs ho.w knute av den avbrutte sutur som er valgt i dette tilfellet forblir utenfor hulrommet i skip for å unngå trombedannelse som ville tilstoppe fistelen.
Figur 6:. Sinus press analyse Dette bart diagrammet grafisk forskjellen i intrakranielt sinus trykket målt i mmHg ved 2, 3 og 4 uker etter operasjonen.
Figur 7:. Proptosis En dag etter operasjonen, begge øynene er forstørret men høyre øye utvidelse (ipsilaterale til klinikken) er mer fremtredende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vedvarende cerebral venøs hypertensjon er nært beslektet med mer alvorlige kliniske manifestasjoner og dårlig prognose hos pasienter med dural AVFs og hjerne AVMs tre. Disse effektene av CVH har vært mye studert i rottemodeller 1,2,8. En tilsvarende modell i musen ville tillate bruk av genmodifiserte dyr som til slutt ville tillate analyse av molekylære stier involvert på patogenesen av venøs hypertensjon og dens forhold til dural AVF og hjerne AVM.
Her rapporterer vi en fremgangsmåte for å lage cerebral venøs hypertensjon hos voksne mus ved en ende-til-side karotid-jugulare fistel. Denne nye modellen forbedrer velbeskrevne carotis-vena fistula modeller i rotte ved å oversette det til musen og dermed lar de nevnte muligheten for å undersøke molekylære stier og genterapi.
Vanlige problemer og forslag
En annen vanlig proproblemstilling er ødeleggende venen med overdreven trekkraft, komprimering, eller disseksjon langs elva. Derfor må EJV eksponeringen utføres nøye under mikroskopet for å identifisere den aktuelle plan disseksjon. Alle de små greiner som drenerer inn i det bør også bli identifisert og koaguleres. Dette vil unngå ukontrollert blødning som krever komprimering av venen og vil gi nok redundans for å unngå overdreven spenning.
Det er ikke uvanlig å ha dårlig funksjon av fistelen etter fjerning av de midlertidige mene. I dette tilfellet bør det første skrittet være lete etter mulige poeng av spenning eller vinkling i CCA. Ytterligere disseksjon av arterien eller delvis reseksjon av sternocleidomastoideus muskelen vil løse dette problemet. Men hvis dårlig funksjon fortsetter etter disse manøvrene, trombose i anastomosestedet må bli mistenkt. I dette tilfellet, i stedet for gjenåpning anastomosestedet og fjerning av tromben, anbefales det å utføre en nyanastomose kranie til den forrige. I vår erfaring, er en tredje anastomose umulig. Det er ikke nok lengde EJV og musen tolererer ikke anestesi for en så lang tidsperiode.
Begrensninger av teknikken
De viktigste begrensninger av denne teknikk omfatter: (1) den lille anatomi av fartøyene krever avanserte mikroevner og en lengre lærekurve enn for tilsvarende modell i rotte; (2) åpenheten av anastomosen er ofte svekket av trombedannelse og lengden av muse EJV vil bare tillate en ekstra forsøk på å løse dette problemet; og (3) kirurgi kan ta opptil tre timer, utsette musen til en lang anestesi periode. Men etter de tekniske forslag foreslått ovenfor og holde musen varm og hydrert under prosedyren, kan et patent CCA-til-EJV bli vellykket utført og høy overlevelse av dyrene som er oppnådd i vår erfaring.
En pålitelig og holdbar cerebral venøs hypertensjon modell hos mus er et viktig verktøy som kan tjene en bred rekke formål i cerebrovaskulær forskning 13-16. Ved tilsetning av knockout-teknologi av transgene mus, bør denne nye modellen lette videre gen-relatert in vivo-undersøkelser for alle patologier assosiert med cerebral venøs hypertensjon.
Tidligere har andre forfattere beskrevet den venøse hypertensjon modellen i rotte og har brukt det til å studere patofysiologien av dural AVF og hjerne AVM 4,5,8,9. Vi nå beskrive metoden for å kunne oversette dette samme modell til mus, derfor åpner sine potensielle bruksområder for alle typer genetisk behandling testing.
Konklusjon
Vi viser her en protokoll for å oppnå et patent CCA-til-EJV anastomose i voksen mus. Dette fistel giren holdbar hjerne venøs hypertensjon som har vært et nyttig verktøy for å utvikle ulike cerebrovaskulære sykdomsmodeller i rotte. Ved å gi denne første skrittet for å utvikle de samme modellene i mus, åpner vi muligheten for å teste genetiske behandlinger for de cerebrovaskulære sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De eksperimentelle prosedyrer med forsøksdyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of California, San Francisco (UCSF).
Forfatterne har ingen potensielle interessekonflikter knyttet til narkotika og materialer som brukes i denne prosedyren.
Acknowledgments
Dette prosjektet er delvis støttet av NIH T32 GM008440 til Espen Walker, R01 NS27713 til William L.Young, P01 NS44155 til William L.Young og Hua Su, R21 NS070153 til Hua SU og av American Heart Association AHA 10GRNT3130004 til Hua Su. Dr Ana Rodríguez-Hernández er støttet av en bevilgning fra "Obra Social La Caixa"
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Sterile Microsuture | Arosurgical Ic. | VT5A010Q10 | |
| 11-0 Sterile Microsuture | Arosurgical Ic | VT4A00N07 | |
| DUROTIP Scissors | Aesculap | BC210R | |
| Micro-Adson Tissue Forceps | Aesculap | BD510R | |
| Microscissors | Aesculap | OC496R | |
| Micro Forceps #5 Jewelers | Aesculap | BD331R | |
| Angled Jewelers Forceps | Aesculap | BD329R | |
| Micro Suture Forceps | Aesculap | BD338R | |
| DUROGRIP Needle Holder | Aesculap | BM009R |
References
- Bederson, J. B., Wiestler, O. D., Brüstle, O., Roth, P., Frick, R., Yaşargil, M. G. Intracranial venous hypertension and the effects of venous outflow obstruction in a rat model of arteriovenous fistula. Neurosurgery. 29, 341-350 (1991).
- Gao, P., Zhu, Y., Ling, F., Shen, F., Lee, B., Gabriel, R. A., Hao, Q., Yang, G. Y., Su, H., Young, W. L. Nonischemic cerebral venous hypertension promotes a pro-angiogenic stage through HIF-1 downstream genes and leukocyte-derived MMP-9. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1482-1490 (2009).
- Kim, H., Su, H., Weinsheimer, S., Pawlikowska, L., Brain Young, W. L. arteriovenous malformation pathogenesis: a response-to-injury paradigm. Acta Neurochir. Suppl. 111, 83-92 (2011).
- Lawton, M. T., Arnold, C. M., Kim, Y. J., Bogarin, E. A., Stewart, C. L., Wulfstat, A. A., Derugin, N., Deen, D., Young, W. L. Radiation arteriopathy in the transgenic arteriovenous fistula model. Neurosurgery. 62, 1129-1138 (2008).
- Lawton, M. T., Stewart, C. L., Wulfstat, A. A., Derugin, N., Hashimoto, T., Young, W. L. The transgenic arteriovenous fistula in the rat: an experimental model of gene therapy for brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 54, 1463-1471 (2004).
- Schaller, B., Graf, R., Sanada, Y., Tolnay, M., Rosner, G., Wienhard, K., Heiss, W., D, Hemodynamic changes after occlusion of the posterior superior sagittal sinus: an experimental PET study in cats. AJNR Am J Neuroradiol. 24, 1876-1880 (2003).
- Zhu, Y., Lawton, M. T., Du, R., Shwe, Y., Chen, Y., Shen, F., Young, W. L., Yang, G. Y. Expression of hypoxia-inducible factor-1 and vascular endothelial growth factor in response to venous hypertension. Neurosurgery. 59, 687-696 (2006).
- Herman, J. M., Spetzler, R. F., Bederson, J. B., Kurbat, J. M., Zabramski, J. M. Genesis of a dural arteriovenous malformation in a rat model. J. Neurosurg. 83, 539-545 (1995).
- Terada, T., Higashida, R. T., Halbach, V. V., Dowd, C. F., Tsuura, M., Komai, N., Wilson, C. B., Hieshima, G. B. Development of acquired arteriovenous fistulas in rats due to venous hypertension. J. Neurosurg. 80, 884-889 (1994).
- Yassari, R., Sayama, T., Jahromi, B. S., Aihara, Y., Stoodley, M., Macdonald, R. L. Angiographic, hemodynamic and histological characterization of an arteriovenous fistula in rats. Acta Neurochir (Wien). 146, 495-504 (2004).
- Solheim, O., Skeidsvoll, T. Transient global amnesia may be caused by cerebral vein thrombosis. Med. Hypotheses. 65, 1142-1149 (2005).
- Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. J Vasc Interv Radiol. 20, 946-950 (2009).
- Choi, E. J., Choi, E. J., Walker, E. J., Shen, F., Oh, S. P., Arthur, H. M., Young, W. L., Su, H. Minimal Homozygous Endothelial Deletion of Eng with VEGF Stimulation Is Sufficient to Cause Cerebrovascular Dysplasia in the Adult Mouse. Cerebrovascular diseases. 33, 540-547 (2012).
- Hao, Q., Su, H., Marchuk, D. A., Rola, R., Wang, Y., Liu, W., Young, W. L., Yang, G. Y. Increased tissue perfusion promotes capillary dysplasia in the ALK1-deficient mouse brain following VEGF stimulation. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, H2250-H2256 (2008).
- Su, H., Hao, Q., Shen, F., Zhu, Y., Lee, C. Z., Young, W. L., Yang, G. Y. Development of a cerebral microvascular dysplasia model in rodents. Acta Neurochir. Suppl. 105, 185-189 (2008).
- Walker, E. J., Su, H., Shen, F., Degos, V., Jun, K., Young, W. L. Bevacizumab Attenuates VEGF-Induced Angiogenesis and Vascular Malformations in the Adult Mouse Brain. Stroke; a journal of cerebral circulation. , (2012).
