Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Biosensor לאיתור של חיידקי סטפילוקוקוס עמידים לאנטיביוטיקה

Published: May 8, 2013 doi: 10.3791/50474
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University, 2Clinical Research Laboratory, 81st Medical Group, Keesler Air Force Base

Summary

biosensors phage ממוסס וחרוזים נוגדנים מסוגלים להבחין בין Methicillin עמיד (MRSA) וחיידקים סטפילוקוקוס רגישים. לפאגים היו משותקים על ידי שיטת אנגמיור-Blodgett על גבי משטח של חיישן microbalance גביש קוורץ ועבדו כבדיקות סטפילוקוקוס מגוון רחבות. חרוזים נוגדנים לזהות MRSA.

Abstract

Bacteriophage ממס הפך מבני שיש מגוון רחב של זני מארח סטפילוקוקוס וחלבון פניצילין מחייב (PBP 2a) חרוזים לטקס מצומדות נוגדנים כבר נוצלו ליצירת biosensor המיועד לאפליה של Methicillin עמיד (MRSA) ו-S רגיש (MSSA) . מיני aureus 1,2. לפאגים ממוסס הוסבו spheroids phage על ידי מגע עם ממשק מים, כלורופורם. monolayers אליפטית הפאג הועברה על גבי משטח biosensor על ידי טכניקת 3 אנגמיור-Blodgett (LB). את biosensors נוצר נבחן על ידי microbalance קוורץ גביש עם מעקב פיזור (QCM-D) כדי להעריך אינטראקציות חיידקים-phage. אינטראקציות חיידקים אליפטית הובילו לתדר תהודה מופחת ועלייה באנרגיה פיזור עבור שניהם זני MRSA ו MSSA. לאחר מחייב חיידקים, חיישנים אלה נחשפו בהמשך לפניצילין, מחייב חלבון נוגדן לטקס חרוזים. חיישנים ניתח עם MRSA הגיבו לPBP חרוזים נוגדני 2a; למרות חיישנים נבדקו עם MSSA לא נתנו שום תגובה. הבחנה ניסיונית זו קובעת חד משמעית אפליה בין methicillin עמיד וס הרגישים זני סטפילוקוקוס. מחויב באותה מידה ולא כרוך bacteriophages לדכא התפתחות חיידקים על משטחים ובהשעיות מים. ברגע שהם שינו phages ממוסס לתוך spheroids, הם שומרים על פעילות ממס החזקה שלהם ולהראות יכולת ללכוד חיידקים גבוהה. ניתן יהיה לנצל את spheroids phage והפאג לבחינות ולעיקור של מיקרואורגניזמים עמידים לאנטיביוטיקה. יישומים אחרים עשויים לכלול שימוש בטיפול bacteriophage ומשטחי מיקרוביאלית.

Introduction

זנים עמידים של סטפילוקוקוס Methicillin הוצעו כגורם חיוני בזיהומים והתפרצויות nosocomial 4-8. דרכים נפוצות להכרה בהתנגדות methicillin, כגון בדיקת דיסק דיפוזיה oxacillin אגר מסך, או microdilution מרק, להסתמך על תנאי תרבות מותאמים כדי לשפר את הביטוי של התנגדות. שינויים כוללים ניצול של oxacillin, דגירה על 30 או 35 מעלות צלזיוס ולא 37 מעלות צלזיוס, וההכללה של NaCl למדיום הגידול. יתר על כן, לזיהוי נכון של סוגים של טכניקות אלה, תקופת דגירה ארוכה של 24 שעות, במקום 16 עד 18 שעות נדרשת. טכניקות מהירות עם רמה (> 96%) מתאימה לרגישות לזיהוי של התנגדות methicillin כוללות טכניקות microdilution אוטומטיות כגון כרטיס יטק GPS-SA, מערכת Staph ATB המהירה, ומערכת לוח Microscan המהירה אשר מייצרות תוצאות לאחר 3-11 שעות 9-11. קריסטל M RSA מזהה מערכת היא שיטה מהירה המבוססת על הכרה בצמיחתו של ס ' aureus בנוכחות של 2% NaCl ו 4 מ"ג של oxacillin לליטר עם חיישן חמצן הקרינה רגיש. רגישויות טענו נעות בין% 91 עד 100 לאחר 4 שעות של דגירה 12-14. שיטות פנוטיפי אלה מוגבלות בדיוקים שלהם על ידי ההשפעה של זנים נפוצים שמבטאים התנגדות הטרוגנית. לכן, השיטות הטובים ביותר המקובלת להכרה בהתנגדות methicillin היא ההכלאה PCR או DNA של גן Meca 15. עם זאת טכניקה זו דורשת ה-DNA מטוהר והוא רגיש מאוד למוספים שונים (זיהומים), הכוללים 16 פסולת תא.

יתר על כן, שיטות אלה צריכים זמן רב לבצע. אסטרטגיות להכרה של מוצר גן Meca, 2a PBP החלבון, יכולה להיות מנוצלים כדי לקבוע התנגדות ועשויות להיות אמינה יותר בהשוואה לשיטות בדיקה רגילה 17.

S = "jove_content"> זה היה שהוצג קודם לכן, כי יכול להיות מנוצל bacteriophage 12600 כמו בדיקה לזיהוי זני סטפילוקוקוס, כולל אלה שיש methicillin התנגדות 1,2,18. בעבודה זו אנו מציעים שיטה חדשנית בהכרה הספציפית וזיהוי של MRSA, כגון הכרה בחיידקים יחד עם קונפורמציה של MRSA בזמן אמת. למטרה הספציפית הזה ס (PBP 2 א) היה בשימוש bacteriophage aureus עם ספקטרום רחב של מארחים (כולל זני MRSA) בשילוב עם נוגדן חד שבטי כנגד חלבון. PBP 2a הוא חלבון דופן תא ואת זה הוא הגורם של התנגדות לאנטיביוטיקה של MRSA. עם זאת נוגדן 2a PBP אינו ספציפי עבור ס aureus מאז כמה חיידקים אחרים יש חלבונים מחייבים אנטיביוטיקה עם דמיון רצף לPBP 2a 19,20. כתוצאה מכך בעבודה זו, ש ' היו בשימוש bacteriophage aureus ונוגדנים כנגד חלבון 2a PBP. כדי להיות מסוגל לפתח biosensor לספציפיקאלי לאתר ולזהות MRSA מכשיר עם פעולת שני שלבים נוצלה. הצעד הראשון בשימוש ס monolayer aureus bacteriophage כמו בדיקה חיישן, ואילו בשלב השני הועסק 2a נוגדנים ספציפיים PBP. לכן, צעד אחד יכיר ס חיידק סטפילוקוקוס, כאחד האחר יהיה רגיש לחלבון לאנטיביוטיקה המחייב. כאשר אותות שהתקבלו משני צעדים הם חיוביים, הוא מציין את הגילוי הספציפי של MRSA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכין את הקרקע

  1. השג סוג זן ס aureus ATCC 12600, ש ' aureus 27690 וBacillus subtilis ATCC ATCC 6051. זנים עמידים methicillin של ס ' aureus - MRSA1, 2 MRSA, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, 34 MRSA, MRSA 45, ב ' anthracis סטרן, סלמונלה typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, פרוטאוס מיראביליס, Klebsiella pneumoniae 13882; הפאג ממס 12600.
  2. השג חרוזים לטקס מצומדות נוגדני 2a PBP.
  3. הכן NZY בינונית כמתואר 21.
  4. השג פתרון פוספט שנאגרו מלוח (PBS).
  5. הכן מים deionized כsubphase לmonolayer תצהיר אנגמיור-Blodgett (LB).

2. הרבייה bacteriophage וטיטרציה

  1. דגירה 5 מ"ל של תרבות הלילה של ס ' aureus ATCC 12600 (3.6 x 10 8 יחידות מושבה להרכיב (CFU) / מ"ל) עם 500 μl של הפאג (3 x 10 9 </ Sup> PFU / מ"ל) במדיום NZY 500 מ"ל ב2 ליטר פלאק בייקר-חממה ב 37 ° C במשך הלילה.
  2. צנטריפוגה התרבות ב 4424 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  3. supernatant מחדש centrifuged ב11,325 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  4. supernatant דרך מסנן 0.22 מיקרומטר Millipore מסנן.
  5. צנטריפוגה תסנין ב75,395 XG במשך 1.5 שעות.
  6. ממיסים בגלולה 100 μl של מים מזוקקים.
  7. הכן פי 10 דילולים של השעיה הפאג במדיום NZY.
  8. צלחת 1 מ"ל של התרבות (ON) הלילה של ס ' aureus ATCC 12600 על כל אחת מצלחות עם 2 אגר NZY כדי לוודא שכל המשטח מכוסה. הסר את עודף התרבות ולתת המשטח יבש למשך 30 דקות.
  9. Spot מדגם (10 μl) של דילול הפאג המתאים על פני השטח של הצלחת ולדגור על 37 המעלות צלזיוס במשך 18-24 שעות.
  10. לבחון את היווצרות הפלאק ולחשב את כייל הפאג. titers bacteriophage (T) נאמדים על הבסיס של מספר plaques (N) שהוקם ל10 μl נפח (V) של השעיה הפאג והגורם לדילול (F). כייל היה מחושב על ידי נוסחה:. ט = N / (vxF) לדוגמה, עבור מספר לוחות 75 בדילול 10 -7 והנפח 10 μl (-3 מ"ל 10 x 10), כייל שווה 75 / (10 x 10 x 10 -3 -7) = 7.5 X 10 10 יחידות להרכיב לוחית (PFU) לכל מ"ל של השעיה.

3. הפאג זהב משותק

  1. חתיכות נקיים מצופות זהב 60 מ"מ קוורץ (2) על ידי פלזמה תחריט בארגון במשך 10 דקות ולאחר מכן לעקר עבור 6 שעות תחת אור UV בארון סטרילי.
  2. הוסף 50 מיקרוליטר של 10 ההשעיה הפאג x 9 PFU / 1 מ"ל למשטח הזהב של כל חתיכה בצלחת פטרי סטרילית, ולאחר מכן דגירה הלילה בתא לח בטמפרטורת חדר.
  3. הסר וכיילת את ההשעיה הפאג שנותר.
  4. לשטוף חתיכות עם הפאג כרוך 5 פעמים עם PBS להסיר מאוגדphage.

4. בדיקה של infectivity הפאג משותק על משטח יבש

  1. מורחים תרבות O / N של S. Aureus ATCC 12600 על גבי צלחת אגר NZY ולאפשר ייבוש.
  2. מניחים פיסת זהב עם הפאג משותק על פני צלחת.
  3. שים לב לאזור של תמוגה לאחר הדגירה 12 שעות על 37 מעלות צלזיוס, שמציין infectivity.
  4. השתמש בחתיכות זהב מכוסות ללא הפאג בניסויים שליטים.

5. בדיקה של פעילות ממס של הפאג חינם וכרוך בנוזלים

  1. הוסף תרבות על ש ' aureus 12,600-10 מיליליטר ATCC של NZY בכל ארבע צלוחיות 300 sidearm מ"ל (6 x 10 6 CFU / מ"ל בבקבוק אחד).
  2. הוסף בשתי צלוחיות 2 x 10 6 pfu / מ"ל של הפאג ללא תשלום.
  3. השתמש בשתי צלוחיות האחרות כקבוצת ביקורת.
  4. לפקח על מהלך הזמן של ס ' תמוגה תא aureus עבור 570 דקות על ידי מדידת צפיפות אופטית (OD 600) במרווחי זמן של 30 דקות לכל צלוחיות.
  5. קח מדידה סופית ב 24 שעות.
  6. חזור על שלבי 5.1-5.5, אבל להשתמש בחתיכות זהב עם phages מאוגד במקום phages החופשי, וחתיכות זהב ללא הפאג בצלוחיות בקרה.

6. אובדן phages הכרוכים במהלך הדגירה

  1. הוסף 50 μl של 10 הפאג PFU / מיליליטר 1 x 9 על פני השטח של תכשיט זהב סטרילי בצלחת פטרי הממוקמת בתא לח למשך לילה בטמפרטורת חדר.
  2. הסר את ההשעיה עם הפאג מאוגד ממשטח הזהב וכייל.
  3. שטוף את פיסת הזהב עם הפאג כרוך 5 פעמים עם PBS ומקום בפתרון NZY 1 מ"ל בשפופרת 15 מ"ל שבייקר-אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות.
  4. לקבוע את כייל של הפאג המנותק כפי שמתואר ב2.

7. הכנת הפאג spheroids

  1. שילוב של 400 μl של השעיה 12600 הפאג מניות (10 11 PFU / מ"ל) עם נפח שווה של כלורופורם כיתה spectrophotometric בבקבוקון 1 מ"לבטמפרטורת חדר.
  2. בעדינות מערבולת ההשעיה הפאג, כלורופורם 5-6 פעמים (5 מרווחי שניות) על פני משך דקה אחת.
  3. אפשר השעיה לייצוב למשך 30 שניות ולאחר מכן פיפטה של ​​השלב העליון המכיל spheroids היה pipetted זמנים להכנת שכבה.
  4. קח כמה מיקרוליטר של ההשעיה spheroids לשידור במיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
  5. השתמש השעיה אליפטית שנותרה לייצור biosensor.

8. הכנת biosensor

  1. חיישנים נקיים QCM-D על ידי פלזמה התחריט בארגון ל10 דקות נקיות PDC-32G Harrick פלזמה.
  2. יש לשטוף את החיישן עם הקסאן כדי להסיר כל זיהומים אורגניים.
  3. להכין ולנקות שוקת של האיזון כפי שמתואר בסרט 22.
  4. מלא שוקת LB עם פתרון subphase ולנקות אותו עם מחסום שוקת ולייצב את השוקת ב20 ± 0.1 ° C
  5. מורחים 300 aliquot μl של הפאג 12600 בsuspensi המימיתב (10 11 PFU / מ"ל) על גבי subphase LB.
  6. הכן monolayer הפאג על פתרון subphase LB על ידי מתן 300 aliquot μl של השעיה מימית הפאג 12600 (10 11 PFU / מ"ל) כדי להפעיל את מוט זכוכית wettable נוטה שטבל באופן חלקי לsubphase 22,23.
  7. לייצב את monolayer המוכנה למשך 10 דקות, ולאחר מכן לדחוס אותו בשיעור של 30 מ"מ / דקה (45 ס"מ 2 / דקות), עד שלחץ קבוע 19 N / M הוא השיג.
  8. בצע תצהיר סרט אנכי על גבי חיישן QCM-D, בניצב בשיעור של 4.5 מ"מ / דקה ברציפות על ידי טבילת חיישן ולצאת מmonolayer שבע פעמים. מיקרוסקופ אלקטרונים של הופקד monolayers phage לפני חשיפה לדגימות חיידקים הראתה כי השכבות היו רציפה, הומוגנית ואחידים (מידע לא מוצג).
  9. חזור על שלבי 4.5-4.8 עם השעיה אליפטית הפאג כי הוא מוכן ב3.
  10. השתמש biosensors phage מפוברק לזיהוי MRSA, אלקטרוןמיקרוסקופיה, וellipsometry.

9. בדיקת biosensor, אפליה של Methicillin עמיד וחיידקים סטפילוקוקוס רגישים

  1. בפרוטוקול זה, biosensors עם הפאג ללא שינוי והשינוי וspheroids phage מוכן. משמש microbalance גביש קוורץ עם ארבעה תאי חיישני זרימה לפקח מחייב של חיידקים לפאג משותק על משטח חיישן QCM. חרוזים לטקס מצומדות PBP 2a נוגדנים מנוצלים ללהיפלות בין Methicillin עמיד (MRSA) וחיידקים סטפילוקוקוס רגישים. כל המדידות שנערכו במצב הזרימה (50 μl / min) בשעה 5 מגה הרץ.
  2. להקים תדר תהודה קו בסיס של חיישן QCM במים (~ 30 דקות).
  3. צייר השעיה של תאי חיים Methicillin סטפילוקוקוס חיידקים רגישים במים (10 9 CFU / מ"ל) באמצעות תא הבדיקה.
  4. ברציפות לעקוב אחר שינויים בתדר התהודה החיישנים ופיזור אנרגיה לצליל עילי, USIng התוכנה ש-Soft.
  5. כאשר השינויים בתדר התהודה החיישנים והפיזור הגיעו לרמות רוויה, להוסיף את ההשעיה של חרוזים לטקס PBP נוגדנים מצומדות (6.77 x10 10 חרוזים / מ"ל) לזרימה במהלך הניטור הרציף של תדר ופיזור.
  6. חזור על שלבי 9.2-9.5 לתאים חיידקיים עמידים Methicillin (MRSA).
  7. הגדר שינוי תדר דרך השינוי ההמוני עקב חיידקים מחייבים ידי Sauerbrey המשוואה 24,25 Δf =-Δm xn / C, כאשר C הוא רגישות מסה קבוע (בשעה 5 מגה הרץ הרץ x -1 C = 17.7 ng x ס"מ -2 ), מ 'הוא מסה וn הוא מספר הנימה (n = 1).
  8. הגדר שינוי בזבוז אנרגיה (Δ ד ') מרישום הדעיכה מעריכית של תנודה (תדר ומשרעת ריסון, אשר אפשרו כימות של האנרגיה התפוגגה ומאוחסנות באותה תקופה אחד מתנודה,E התפוגגה ומאוחסן E, בהתאמה: Δ D = E התפוגג / 2 מאוחסן πE. Δ D נמדד ביחידות פיזור (DU), אחד DU = 10 -6 יחידות יחסית).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפאג הוכיח פעילות ממס נגד כל הזנים שנבדקו של ס ' aureus, כולל זני MRSA, כפי שעולים מבדיקת מקום הפאג. גדלי פלאק בדרך כלל נע בין 5 עד 15 מ"מ. לא נמצאה פעילות נגד בדיקת תרבויות אחרות (טבלת 1).

צמיחה נורמלית של ס ' aureus ATCC 12600 במדיום NZY בייקר-אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס מוצגת באיור 1 א (עקומה שכותרתו על ידי חוגים ריקים). מספר החיידקים גדל מ 3.2 x 10 6-4.0 x 10 8 CFU / מ"ל. איור 1 א (עקומה מסומנת על ידי עיגולים מלאים) מציג את התוצאות של שיתוף הטיפוח של 2.0 x 10 6 PFU / מ"ל החופשי הפאג בו זמנית הוסיף עם אותו ריכוז של ס ' aureus ATCC 12600. הפאג, משותק על משטח הזהב, הוכיח פעילות ממס דומה עם פעילותו של הפאג בהשעיה (איור 1 א, שכותרתו על ידי עקומת משולשים עליונים למטה). הפאג המשותק נשאר התולעת כאשר פיסת הזהב עם הפאג שימש לראשונה ב24 שעות גדלה ניסוי, אז זה נשטף 5 פעמים ומאוחסן בPBS במשך 6 ימים ב4 מעלות צלזיוס, ובסופו שימוש חוזר עם השעיה חיידקים טריות. (איור 1 א, שכותרתו על ידי עקומת משולשים למעלה). נראה כי phages המשותק להזריק DNA שלהם בחיידקים, ומשאיר capsids הריק, שהם מסוגלים להדביק חיידק חדש. אנו משערים כי phages משותק על משטח זהב שימש כ" מזרזי "ראשוניים כדי להדביק כמה חיידקים, אשר יוצרים phages חינם אלה בתורו פוגעים בחיידקים חדשים וכן הלאה. לכן, רוב phages המשותק היו כנראה לא השתמשו בניסוי ראשון של 24 שעות הולך וגדל, ולכן, יכול להיות מנוצל בפעם שנייה. צפיפות השטח של phages שהופקד על ידי ספיחה הפיסית הייתה על ~ 0.7 חלקיקים הפאג / 2 מיקרומטר. ריכוז זה גבוה, אבל זה יכול לגדול עד 10 פעמים 2. לכן, צלחת הזהב יכולה לשלב שלשת של phages קיימא חינם שפורסם על ידי חיידקים נגועים בניסוי הראשון של 24 שעות הולך וגדל.

איור 1 מציג את אזור תמוגה סביב פיסת הזהב, המציין כי phages המשותק היו מסוגל lysing תאים חיידקיים. בניסויים השליטים, צלחת הזהב הריקה לא לעכב את צמיחת חיידקים. ומכאן הירידה האפקטיבית של התפתחות חיידקים מצאו בשיתוף התרבות של חיידקים וphage משותקים היא תוצאה של אינטראקציה העיקרית של חיידקים מושעים מים וphage המאוגד כפי שמוצג באיור 1 ג. ניתוק הפאג ממשטח הזהב בשיתוף הדגירה של הפאג וחיידקים מאוגדים היה קטן. על מנת להעריך כמה phages היו מנותק ממשטח הזהב במהלך דגירה, דגימות עם הפאג מאוגד היו שקועים בפתרון NZY, מזועזע שבייקר-אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות, וריכוז הפאג חופשי בsupernatant הוערך. אנחנו קבענו כי 4.1 x 10 7 PFU היה bounד לחתיכת 60 מ"מ 2 זהב (~ חלקיק הפאג / 2 מיקרומטר 0.7), כאשר רק 3 x 10 4 PFU היו מנותק (% ניתוק 0.007).

השידור וסריקת micrographs אלקטרונים של הפאג ממס ללא פגע 12600 על פני מצע הזהב מוצג באיורי 2 א ו -2. כאשר ההשעיה הפאג הייתה נתון לטיפול כלורופורם, המראה הפיזי הפאג היה שונה. הזנב התכווץ באורכו ולהתעבה. ראש polygonal הפך מעוגל (איורים 2D ו2E). אנחנו נקראים הפאג שונה מבני ממס "אליפטית" דומה לשמו של כלורופורם טופל הפאג פילמנטיות 26. למרות השינויים המבניים המשמעותיים כתוצאה מטיפול בכלורופורם, ממס אליפטית הפעילות נמדדת על ידי מספרי פלאק לא השתנתה (איורים 2 ג ו2F). פעילות ממס הממוצעת של הפאג וspheroids היו (7.4 ± 1.5 (SD)) x 10 10 (N = 4) ו( 7.5 ± 1.0 (SD)) x 10 10 (N = 7), PFU / מ"ל. ברמה 0.05, את פעילותם של הפאג וspheroids לא היו שונים משמעותי (איור 2 ג ו2F).

חיישני QCM עם phages ממוסס משותק לא הראו שינויים משמעותיים בתדר התהודה או בזבוז אנרגיה כאשר הם נחשפו לMRSA (איור 3 א). נתונים אלה מצביעים על כך שאינטראקצית MRSA / הפאג הביאה לשום שינוי מסה פי QCM, ובכל זאת את micrographs האלקטרונים של biosensors assayed הודעה חשף משמעותי מחייב חיידקים על פני השטח החיישן (איור 3).

כאשר מתלי MRSA הוזרקו לתוך תא הזרימה אליפטית עם biosensors phage, ירידה משמעותית בתדירות (f Δ ≈ -105 הרץ) וגידול בפיזור (ΔD ≈ 26 DU) נצפו (איור 3 ג). בעקבות אינטראקציות (MRSA) מחייבות אליפטית בקטריאלי phage, assayed sensors נחשפו להשעיות חרוזים לטקס מצומדות נוגדני PBP2a. MRSA אלה assayed biosensors הגיב להשעיות חרוזים הלטקס מצומדות נוגדני PBP2a, שכן ירידה נוספת בתדר (f Δ ≈ -45 הרץ) וגידול בפיזור (ΔD ≈ 15 DU) נצפה (איור 3 ג). כריכה של MRSA לphage בדיקות וחרוזים לטקס מצומדות PBP2a נוגדנים אושרה באמצעות חקירות מיקרוסקופ אלקטרונים סורקות (איור 3D).

כאשר biosensor אליפטית הפאג נחשף להשעיות MSSA, ירידה משמעותית בתדירות (f Δ ≈ -200 הרץ) וגידול בפיזור (ΔD ≈ 55 DU) נצפו (איור 3E). בעקבות אינטראקציות מחייבות אליפטית-MSSA phage, חיישני assayed היו תיגר עם מתלי חרוזים לטקס מצומדות נוגדני PBP2a. בתחילה, MSSA assayed biosensor הראה ארעיים של קצרגידול בתדירות ובירידה בפיזור. לאחר כמה דקות של אינטראקציות חרוזים לטקס מצומדות נוגדני PBP2a MSSA ודקות, תדירות חזרו לפרסם רמות נוגדני מבוא PBP2a, אבל האנרגיה מפזר מוגברת (איור 3E). עקידת MSSA לבדיקות phage אושרה במיקרוסקופיית אלקטרונים, אך לא מחייבת בין MSSA וחרוזים לטקס מצומדות PBP2a נוגדנים נצפה (איור 3F). פרופיל עובי Ellipsometric, מפת עובי 3D של phages ממוסס וחיידקים סטפילוקוקוס מוצגים איורים משלימים S1 ו S2.

בעקבות קשר של חיישנים עם phages המשותק LB או spheroids להשעיה של 10 9 תאים / מ"ל של MRSA או MSSA, החיידקים נצפו להיקשר phages או spheroids בצפיפות (ρ) של 9.1 x 10 7 (MRSA / phages שלם), 7.9 x 10 7 (MRSA / spheroids), ו7.2 x 10 7 (MSSA / spheroids) תאים / 2 ס"מ. בתוךבדיקות באמצעות 5 phages ממוסס שונה ו -2 חיידקים מארחים 27, חוקרים נתון phages משותק על ידי שיטה מחייבת קוולנטיים ל10 / 9 תאי חיידקי מ"ל, וקבעו את יעילות לכידת הפאג בטווח של 2.5-8.9 () x 10 5 תאים / 2 ס"מ . יעילות לכידת הפאג מוצגת בעבודה זו היא ~ 100 פעמים גבוהה יותר.

מארח להתאמץ פרטי מתח רגישות Methicillin רגישות הפאג
ס aureus 12600 ATCC S +
ס aureus 27690 ATCC S +
ס aureus 10292 IA S +
10378 IA S +
ס aureus 10497 IA S +
ס aureus 10686 IA S +
ס aureus 1 MRSA AU R +
S.aureus MRSA 2 AU R +
ס aureus MRSA 5 AU R +
ס aureus MRSA 13 AU R +
S.aureus MRSA 26 AU R +
ס aureus MRSA 34 AU R +
ס aureus MRSA 45 AU R +
B. anthracis סטרן AU NA -
סלמונלה typhimurium LT2 AU NA -
Shigella flexneri לא ידוע AU NA -
Yersinia enterocolitica לא ידוע AU NA -
פרוטאוס מיראביליס לא ידוע AU NA -
Klebsiella pneumoniae 13882 AU NA -
Bacillus subtilis 6051 ATCC NA -

טבלת מס '1. רגישות הפאג של 12600 של חיידקיםרכבות IA - שבודד מבעלי החיים;. AU - גביית חיידקי תרבות של אוניברסיטת אובורן, NA - אינו ישימה; - פעילות ממס של הפאג הוגדרה על ידי היווצרות הפלאק, +, רגישה, -, לא רגישה. תרבויות לילה של זנים שנבדקו היו מצופה על את הצלחות עם אגר NZY. לאחר המשטח התייבש, מדגם (10 μl) של 10 השעיה 11 PFU הפאג זוהה על פני השטח של הצלחת. צלחות הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18-24 שעות. פעילות ממס של phages זוהתה על ידי היווצרות של פלאק.

איור 1
איור 1. מאפיינים של זיהומיים הפאג המאוגד והחופשי. צמיחת חיידקי א בהעדר (עיגולים ריקים) ונוכחות (עיגולים מלאים) של הפאג חופשי, בנוכחותו של הפאג חייבים משטח זהב (למעלה עד TRiangles), ובנוכחותו של הפאג חייב משטח זהב אחרי 6 שעות ב 4 ° C (מלמעלה למטה משולשים). הוספה: הקו (1) מראה התאמה ליניארית של אין צמיחת נתוני ניסוי phage למשוואה (4) (R = -0.99, p <0.0001). הקו (2) מציג כושר של הנתונים הניסיוניים של התפתחות חיידקים בנוכחות הפאג החופשית לאותה המשוואה. מתמיד התפתחות חיידקים (K) בהעדר ונוכחותו של הפאג חופשי, הם 0.88 ושווים 0.64, (-0.048, שלב ירידה). נציגי נתונים של שלושה ניסויים עצמאיים מוצגים בלוח א 'בממוצע מדידות OD 600 שגיאה יחסית לא יעלו על 5%. ב הפאג משותק למשטח הזהב הוא התולעת כפי שעולה מאזור תמוגה סביב חתיכת הזהב. 1 - שבר הצלחת אגר עם חיידקים; 2 - חתיכת הזהב עם הפאג משותק;. 3 - עיכוב האזור סביב חתיכת זהב ייצוג סכמטי של ג תמוגה חיידק על ידי הפאג מחוברת למשטח הזהב. 1 -תכשיט הזהב מצופה קוורץ, 2 - הפאג חייב משטח הזהב, 3 - החיידק מעוגן על ידי phages מאוגד, 4 - phages חינם יש שפורסם על ידי חיידק מתפוצץ נגוע. שימוש באישור מ: Guntupalli, ר ', et al 2012.. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2
איור 2. מאפיינים של הפאג שלם ושונה A ו-B - הילוכים וסריקת micrographs אלקטרונים של הפאג ללא פגע, בהתאמה;.. C - פעילות הפאג ממס על צלחת אגר עם MRSA D ו-E - שידור וסריקת micrographs אלקטרונים של spheroids phage ללא פגע, בהתאמה; spheroids phage ממוסס - Fctivity על צלחת אגר עם MRSA. הפעילות הממוצעת של הפאג וspheroids הן (7.4 ± 1.5 (SD)) x 10 10 (N = 4) ו( 7.5 ± 1.0 (SD)) x 10 10 (N = 7) PFU / מ"ל. מבחן t: t = .15682, P = .87851. ברמה 0.05, את פעילותם של הפאג וspheroids אינה שונות באופן משמעותי. בארים: A, B, D ו-E: 200 ננומטר. שימוש בהאישור של:. Guntupalli, ר ', et al 2012.

איור 3


איור 3. חיידקים בשילוב QCM-D וניתוח של אינטראקציות הפאג EM-חיידקים. נמסרו לחיישן בריכוז של 10 9 CFU / השעיות מ"ל מים בקצב זרימה של 50 μl / דקה. 1, 2 מייצגים שינויים בתדר התהודה ובזבוז האנרגיה, בהתאמה. תגובת א הפאג המצופה QCM-D חיישן לMRSA. חץ מראה לאהוא זמן אספקת MRSA למשטח החיישן. ב סריקת אלקטרונים מיקרוסקופ של ההודעה assayed MRSA חייב הפאג ממס משותק על חיישן QCM. M-MRSA, P-phages על פני החיישן. תגובות רצופות של ג spheroids phage חיישן QCM-D צופה MRSA הראשון ולאחר מכן לPBP חרוזים נוגדן. חצים מצביעים MRSA וזמן אספקת נוגדני PBP למשטח החיישן, בהתאמה. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ד ההודעה assayed biosensor עם spheroids phage, MRSA, וחרוזים נוגדני PBP. חיצי אש ובמים מראה תא טיפוסי MRSA ו נוגדן חרוז, בהתאמה. תגובות רצופות של E. spheroids phage חיישן QCM-D צופה ס aureus ראשון ולאחר מכן לPBP חרוזים נוגדנים. חצים מצביעים על ס ' סטפילוקוקוס וזמן אספקת נוגדני PBP למשטח החיישן, בהתאמה. מיקרוסקופ האלקטרונים הסורק של פ הודעה assayed biosensor עם spheroids phage, S. aureus, ו PBP חרוזים נוגדנים. חיצי אש ובמים מראה ס הטיפוסי תא aureus ונוגדן חרוז, בהתאמה. שימוש באישור מ: Guntupalli, ר ', et al 2012.. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איורים משלימים

איור S1
S1 דמות. איור משלים 1. (א) ו (ב) הם עובי פרופיל ellipsometric ומפת 3D עובי של הפאג ממס, בהתאמה (מקדם שבירה אפקטיבית = 1.05). פרופילי עובי להראות חספוס RMS, מינימום ומקסימום עובי ממוצע, של השכבה. קו על פני מפת העובי צויר על מנת ליצור את פרופיל העובי.

50474/50474figs2.jpg "/>
איור S2. משלים איור 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זה ידוע היטב כי phages יכול לשמש כבדיקות biosensor לחיידקים פתוגנים 28. זה בא לידי הביטוי בעבודה זו, שיכול להיות מנוצל הפאג יחד עם נוגדני 2a PBP כדי לפתור את הבעיה הישנה: זנים עמידים ורגישים אנטיביוטיים מהירים אפליה.

נמצא עם זאת phages staphylococcal ללא שינוי הנורמלי אלה אינם מתאימים לאיתור חיידקים עם התקני QCM, למרות שהם לאגד חיידקים. זנב הפאג הוא כל כך הרבה זמן שגלים אקוסטיים לא יכולים "להגיע" לחיידקים המאוגדים לסוף זנבות phage. מצב זה הביא להשפעה "מסה חסרה" 29 וחוסר יכולת לרשום את תדר תהודה ושינוי פיזור למרות המחייב המשמעותי הראה א"מ תמונות (איורים 3 א ו 3 ב). בעיה זו נפתרה בקלות על ידי החלפת הפאג השלמה עם spheroids, הפאג שונה על ידי טיפול כלורופורם במים. טיפול זה הביא עמ 'מתפקד באופן מלאHage עם זנב קצר, עבה ולא גמיש (איורים 2D, 2E, ו2F). כאשר phages הוחלפו בspheroids בbiosensors, MRSA היה מזוהה בקלות על ידי מכשיר QCM-D.

כאשר חלקיקי phage היו קשורים למשטחי זהב בכיוון נכון, הקולטנים שלהם היו נגישים לחיידקים המארחים. אם מגע פיזי ישיר בין משטח מוצק עם phages ושכבת חיידקים מיובש להתרחש, את phages המשותק מסוגל להזריק לתוך הגנום נגיפי חיידקים מארחים (איור 1 ג). תוצאות אלו מסכימים גם עם אלה שהושגו עם phages ממוסס משותק למשטחי זכוכית דיסק על ידי טכניקה 27 קוולנטיים מחייבת. היכולת של phages ממוסס חייב ללכוד חיידקים מארחים גם הודגמה על ידי שימוש בטכניקת קיבוע הפאג biotinylated 30. לעומת זאת, שיטת ספיחה פיזית מאוד פשוט לחיבור phages אוריינטציה כראוי למשטחים מוצקים נוצלה 31. Tהוא יעילות לכידת אליפטית הפאג גבוהה יכול לשמש להכנת משטחים מיקרוביאלית יעילים. זמן לתשובה עבור assay המוצע כולל הוא כ 16 דקות לדגימה. הפעם יכול להתקצר באופן דרמטי על ידי שימוש במכשירי QCM עם מספר גדול של תאים. חיי המדף הצפויים לחיישני phage הוא על של 3-4 חודשים בטמפרטורת חדר. עם הגנת biopolymer אפשר להאריך עד כמה שנים 32. גבול הגילוי של ס ' aureus נמדד עבור הפאג זה על ידי ספקטרוסקופיית התהודה plasmon פני השטח, ונמצא כי 10 4 CFU / מ"ל 18.

אחד התנאים החשובים ביותר לשימוש בשיטות המתוארות במאמר זה הוא לעמוד בתנאים נקיים וסטרילי 33 דרישות לכל הניסויים עם phages וחיידקים.

שיטות נפוצות לגילוי של MRSA, כגון בדיקה אגר oxacillin דיפוזיה דיסק המסך, או המרק microdilution לקחת נורמהlly שעה עד 24 כדי לבצע את הבדיקה. טכניקות מהירות הכוללות טכניקות אוטומטיות כגון כרטיס יטק GPS-SA, מערכת Staph ATB המהירה, מערכת לוח Microscan המהירה, ומערכת Crystal MRSA מזהה גם לייצר תוצאות לאחר 3-11 שעות 9-14. ההכלאה PCR או DNA של גן Meca 15 היא שיטה מהירה ומדויקת יחסית אך דורשת DNA מטוהר וזיהומים הוא מאוד רגישים. לעומת זאת, בשיטה המתוארת בעבודה זו היא מהירה, אינה זקוקה למיצוי DNA, והוא אינו רגיש למוספים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

העבודה דיווחה במסמך זה נתמך על ידי מענקים מAUDFS אוניברסיטת אובורן וחיל האוויר האמריקאי CRADA 07-277-60MDG-01. הדעות המובאות במאמר זה הן של המחברים, ואינם משקפות את המדיניות הרשמית או עמדתו של חיל אוויר ארצות הברית, משרד ההגנה, או ממשלת ארה"ב.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P4417
spectrophotometric-grade chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 154733 (99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 29609-0 (95%)
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT 64-17-5 190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge Beckman Coulter Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden E4
Scanning electron microscope (SEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized Millipore Corporation, Billerica, MA SCGPU05RE 0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish NUNC A/S, Denmark 240835 Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes Gilson, Pipetman, France P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific, CT Classic C24
Gold-coated quartz pieces Auburn University, AL Homemade
Petri dishes Fisher Brand, USA 0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance The Baker Company, ME SG403
Culture Growing Flasks Corning Incorporated, NY 4995 PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. 4001
Plasma Cleaner Harrick Plasma, USA PDC-32G
Millipore water purification system Millipore Direct-Q
Imaging Ellipsometer Accurion, USA nanofilm_ep3se
Software Q-Sense AB, Sweden QSoft, QTools

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes. Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).
  2. Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements. J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).
  3. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films. Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).
  4. Barie, P. S. Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice. World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).
  5. Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens. J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).
  6. Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract. Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).
  7. Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. Methicillin resistant' Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations. J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).
  8. Knopf, H. J. Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus. Urologe A. 36, 248-254 (1997).
  9. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).
  10. Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).
  11. Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).
  12. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of BBL crystal MRSA ID system. J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).
  13. Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System. J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).
  14. Zambardi, G., Fleurette, J., et al. European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).
  15. Chambers, H. F. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).
  16. Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).
  17. Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).
  18. Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study. Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).
  19. Popham, D. L., Young, K. D. Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis. Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).
  20. Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH. J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).
  21. Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation. Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).
  22. Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment. J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).
  23. Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Rapid and sensitive biosensor for Salmonella. Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).
  24. Sauerbrey, G. The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing. Z. Phys. 155, 206-222 (1959).
  25. Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
  26. Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface. Cell. 23, 747-753 (1981).
  27. Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces. Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).
  28. Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (53), e2740 (2011).
  29. Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. Missing mass" effect in biosensor's QCM applications. Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).
  30. Gervals, L., Gel, M., et al. Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces. Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).
  31. Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption. Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).
  32. Sorokulova, I., Watt, J., et al. Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage. J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).
  33. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).

Tags

Bioengineering גיליון 75 מיקרוביולוגיה מחלות זיהומיות זיהום רפואה אימונולוגיה ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית גנטיקה אנטומיה פיזיולוגיה חיידקים פרמקולוגיה סטפילוקוקוס bacteriophages phage כריכה תחרותיות ביופיסיקה מאפייני פני שטח (חומרים מתכתיים) מכשירי משטח גל אקוסטי (תכנון אלקטרוני) חיישנים spheroids phage ממס QCM-D אנגמיור-Blodgett (LB) monolayers MRSA, Assay
Biosensor לאיתור של חיידקי סטפילוקוקוס עמידים לאנטיביוטיקה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guntupalli, R., Sorokulova, I.,… More

Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter