En modificeret Heterotop Svin Hind Limb Transplant Model for Translationel vaskulariserede Composite allotransplantation (VCA) Forskning

Summary

Vaskulariserede Composite Allotransplantations (VCA) er blevet en klinisk realitet. Dog er bred klinisk anvendelse af VCA begrænset af kronisk multi-drug immunosuppression. Forfatterne præsenterer en pålidelig og reproducerbar stor dyremodel til at oversætte nye immunomodulatoriske strategier, som kan minimere eller eventuelt eliminere behovet for immunsuppression VCA.

Abstract

Vaskulariserede Composite allotransplantation (VCA), såsom hånd og ansigt transplantationer repræsenterer en levedygtig behandlingsmulighed for komplekse muskuloskeletal traumer og ødelæggende væv tab. Trods gunstige og meget opmuntrende tidlige og mellemliggende funktionelle udfald, afvisning af den stærkt immunogene hud komponent i en VCA og potentielle skadelige virkninger af kronisk multi-drug immunosuppression hæmmer fortsat udbredt klinisk anvendelse af VCA. Derfor forskning i denne roman område skal fokusere på translationelle undersøgelser i forbindelse med unikke immunologiske funktioner i VCA og at udvikle nye immunmodulerende strategier for immunomodulation og tolerance induktion efter VCA uden behov for langsigtede immunosuppression.

Denne artikel beskriver en pålidelig og reproducerbar translationel stor dyremodel af VCA, der består af en osteomyocutaneous klap i en MHC defineret svin heterotop bagbenet allotransplantation. Briefly er et godt vaskulariserede hud padle identificeret i anteromedial låret region ved hjælp af nær infrarød laser angiografi. De underliggende muskler, knæled, distale femur og proksimale tibia høstes på en femoral vaskulær stilken. Denne allotransplantatet kan betragtes både en VCA og et vaskulariseret knoglemarvstransplantation med sin unikke immune privilegerede features. Transplantatet transplanteres til en subkutan abdominal lomme i recipientdyret med en hud komponent blotlagt til dorsolaterale region for immunovervågning.

Tre kirurgiske team arbejder samtidig i en velkoordineret måde at reducere anæstesi og iskæmi gange, og derved forbedre effektiviteten af ​​denne model og reducere potentielle konfoundere i forsøgsprotokoller. Denne model fungerer som grundlaget for fremtidige terapeutiske strategier til formål at reducere og potentielt eliminere behovet for kronisk multi-drug immunosuppression i VCA.

Introduction

Vaskulariserede Composite allotransplantation (VCA), såsom hånd og ansigt transplantationer er nu en klinisk realitet med mange hånd og ansigt transplantationer udført på verdensplan ^12. Trods det faktum, at tidlig og mellemliggende resultater er gunstige, og meget opmuntrende ^2, kravet om kronisk multistof immunosuppression fortsætter med at begrænse dens udbredte kliniske anvendelse. De fremskridt i murine modeller af VCA herunder super-microsurgical anastomoser og nonsuture manchet teknikker ^{13, 3} har banet vejen for en bedre forståelse af alloimmun svar i VCA. Er blevet foreslået myriader af immunmodulerende protokoller til kliniske applikationer baseret på vores bedre forståelse af immun mekanismer i VCA men de skal valideres i en stor dyremodel, der ville være rimeligt prædiktiv for deres præstationer i mennesker ^7. Baseret på fysiologiske og immunologiske ligheder mellem menneske og svin organsystemer hunde-9 og ikke-menneskelige primater modeller ^1.

Denne artikel giver en detaljeret oversigt over den anvendte metode i vores MHC-definerede svin heterotopisk bagben transplantation model, der tjener som grundlag for vores nuværende og fremtidige immunmodulerende strategier til at fremkalde immuntolerance til VCA og dermed udvide dets kliniske anvendelse. Vi anvender velkarakteriserede indavlede grise opdrættet til homozygositet på svin leukocytantigen locus specielt til deres anvendelse i transplantation-relateret forskning ^11. Vi rejser et vaskulariseret osteomyocutaneous flap baseret på femorale fartøjer. Klappen indeholder intakt vaskulariseret knoglemarv i det distale lårben og proksimale tibia. Anteromedial låret hud er også inkluderet i transplantatet og blotlagt til dorsolaterale aspekt af recipientdyret til immunovervågning af de mest immunogene komponent of VCA. Dorsolaterale positionering letter klinisk undersøgelse i stående og siddende stilling og holder allotransplantatet hud relativt ren også.

Ustener et al. Introducerede en af de første store dyr translationelle modeller i VCA ved at transplantere radiale forben osteomyocutaneous flaps i udavlede gård svin ^15. Gruppen udnyttede denne model til at demonstrere for første gang, at akut afstødning i VCA som omfattede stærkt immunogen hud komponent kan blive forsinket og behandles med en klinisk relevant strategi uden væsentlige narkotika-specifikke komplikationer og bivirkninger. De gunstige resultater opnået i denne undersøgelse byggede efterfølgende et grundlæggende skridt i at designe lægemidler for menneskelig rekonstruktiv transplantation. Selv om disse tidlige svin VCA modeller var velegnet til at udvikle protokoller for at forhindre afstødning af hud, muskler, knogler, nerver og kar, de manglede specialiserede strukturer såsom artikulær cartilage og synoviale membraner af leddene. Efterfølgende indsats var fokuseret på, herunder den mediale ciffer af dyret, som nødvendiggjorde fuld længde støbt placering for at forhindre graft løsrivelse ^14. Skønt egnet til at undersøge afvisning af alle de vigtigste bestanddele lemmer transplantation, en af ​​de store begrænsninger i denne model var efter transplantationen ambulant vanskeligheder på grund af kaste placering. Således heterotopiske svin led allotransplantation modeller, der består af skinneben, lægben, knæled, distale femur, omgivende muskel og en hud pagaj, blev skabt for primært at undersøge immunologiske aspekter af VCA, samtidig med at dyret frit ambulate postoperativt med minimal morbidit ⁸ .

Udviklingen af ​​velkarakteriserede SLA-definerede indavlede grise gennem pionerarbejde Dr. David H. Sachs førte til en ny æra af translationel VCA forskning. Ved hjælp af en heterotopisk bagben transplantation model i en mindre antigen mismatch indstilling, Mathes et al. ¹⁰ viste ubestemt overlevelse af muskuloskeletale komponenter med et kort kursus af cyclosporin behandling. Huden komponent overlevelse blev imidlertid kun forlænget i forhold til ingen behandling kontrol. Tabet af huden komponent af graft blev tilskrevet en reaktion isoleret og meget kraftig immunrespons, især til epidermis. Ligeledes ved hjælp af fuldt fejlparrede svin med T-celle depletion et kort forløb af cyclosporin og cytokin-mobiliseret donor perifert blod mononukleære celler induceret tolerance kun muskuloskeletale komponenter og huden element er stadig afvist ^5. Dette fænomen, der kaldes 'split tolerance ", bragt et paradigmeskift i VCA forskning med et større fokus på den stærkt immunogene hud komponent, som er en integreret del af de fleste af rekonstruktiv transplantationer foretaget til dato.

I denne modificerede model udnytter vi ende-til-ende anastomose ved ligating modtageren femorale arterie og dreje den opadrettede (figur 1). Dette reducerer ikke blot iskæmi tid ved at tillade brugen af ​​en konventionel kobling enheden, men også mindsker chancerne for anastomotiske fiasko. Vi har ikke observeret nogen iskæmiske hændelser efter ligering af arteria femoralis i vores modtagere indikerer, at sikkerhed omsætning var tilstrækkelig til at tilvejebringe vaskularisering til den native ben. Derudover er der i denne modificerede fremgangsmåde er externalized huden komponent tilvejebringes baseret på de underliggende perforator fartøjer og er placeret lateralt (figur 1) i modsætning til en ventral lyske position i den traditionelle model ^10. Dette tillader nem visualisering af transplantatet for immunovervågning i stående eller siddende stilling af dyret.

Derfor er det vigtigt med en pålidelig og reproducerbar stor dyremodel til at undersøge toleranceinduktion strategier mod huden komponent i VCA og at udvikle nye noninvasive immune overvågning strategier for bedre forudsigelse af graft overlevelse.

Protocol

I denne video publikation blev alle dyreforsøg gennemføres i overensstemmelse med et dyr protokol godkendt af Johns Hopkins University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).

1.. Præoperativ planlægning

1. Vi udnytter MHC-definerede MGH indavlet miniature svin (15-20 kg) i vores translationelle studier for lemmer allotransplantation hvori en mandlig donor giver lemmer for to kvindelige modtagere (Figur 1). Før operation, donor-og modtagerlande dyr gennemgå en grundig klinisk vurdering af en dyrlæge.
2. For at minimere anæstesi og iskæmi tiden er donor og modtager procedurer udføres samtidig på tre operationsborde i en dedikeret store dyr operationsstuen. Teamwork og koordinering blandt kirurgiske teams samt veterinære personale er afgørende for den samlede succes af denne procedure. Den kirurgiske plan drøftes med det veterinære team i et formelt møde 1-2 Uger før dagen for operationen.
3. En tunnelført centralt venekateter (7 Fr dobbelt lumen Hickman kateter) er placeret i et eksternt eller internt jugularvene på hver modtager dyr forud for transplantation for immunosuppressive narkotikaovervågning niveau og intravenøs administration af immunosuppressive og / eller immunmodulerende lægemidler. Disse katetre er placeret under direkte udsyn gennem en venøs cut-down teknik og tunnelforbindelsen bageste at afslutte højt på ryggens hals og sikret med monofil absorberbare suturer og selvklæbende bandage wrap rundt om halsen.
4. Holde dyr NPO (ingen fast føde, men er tilladt vand ad libitum) mindst 12 timer før operation.
5. På dagen for kirurgi, rolige dyr med ketamin 20 mg / kg og xylazin 2 mg / kg IM.
6. Placer en passende størrelse endotrakealtube og forbinde den til anæstesiapparatet og ventilator (vedligeholdes på isofluran 0,5-3%)
7. Placer en intravenøst ​​kateter i en marginal øre vene og administrerevægt baseret 0,9% saltvand under hele proceduren.
8. Administrere forebyggende analgesi (buprenorphin 0,02 mg / kg IV).
9. Administrere profylaktisk antibiotikum (cefazolin 20-25 mg / kg IV) forud for den første indsnit for både donor og modtager dyr.
10. Brug steril teknik i alle procedurer for både modtagere og donorer. Dette omfatter brug af autoklaveres eller gas steriliserede instrumenter, masker, hoved hætter, sterile kirurgiske kjoler og sterile handsker. Barber området af indsnit med en klipper og desinficere med skiftevis betadinopløsning og alkohol.

Intraoperativ Overvågning:

1. Efter induktion og intubation, vedligeholde anæstesi med en indånding blanding 0,5-3% isofluran i oxygen.
2. Overvåg puls, pulsoximetri, EKG, slut-tidal CO ₂ og rektal temperatur løbende og registrerer hver 15 min.
3. Forebyg hypotermi med Bair Hugger varm tvungen luft tæppe.

1. Placer donor dyr i liggende stilling på operationsbordet og drapere på en steril måde.
2. Brug nær-infrarød laser angiografi at identificere perforator fartøjer anteromedial hud. Injicer indocyaningrøn på ca 0,06 mg / kg fortyndet i 2-5 ml normalt saltvand gennem perifer vaskulær adgang. Ca. 10 sek senere, udføre 30 sek-2 min af nærinfrarøde optagelser. Brug video fra disse optagelser til at identificere Perforatorer. Baseret på perforering, markere et område af huden (ca. 100 ^cm2) til overvågning.
3. Brug en skalpel til at lave en lyske hudincision i kontinuitet med markeringer for huden padle (Figur 2).
4. Identificer femorale fartøjer og isolere dem distalt til niveauet af suprageniculate grene og proksimalt til niveauet af lyskeligamentet.
5. Dissekere hud og subkutane væv mens preserving det område af huden pagaj. Sy kanterne af huden til underliggende muskler at undgå sammentrækning under flap høst.
6. Udfør en osteotomi lige over haseled ved hjælp af en bajonetsav (Electric Pen Drive, Synthes, West Chester PA).
7. Opdel musklerne i den proksimale låret bruge elektrokauterisation.
8. Opdel lårbenet i midten af ​​akslen efterlader en osteomyocutaneous klap på en vaskulær stilken. Klappen indeholder huden padle, underliggende lårmusklerne, knæled, distale femur og proksimale tibia, som omfatter intakt vaskulariseret knoglemarv med sin unikke immunologiske funktioner.
9. Brug knoglevoks at opnå hæmostase i marv rum. Glat knogle kanter hjælp ronjeurs som forberedelse til modtageren.
10. Hold graft perfunderet på dens vaskulære pedicle indtil modtagerens femorale skibe er forberedt (Figur 3).
11. Når modtageren dissektion er færdig, ligere donor femorale fartøjer som proksimalt som muligtnd indgyde transplantatet med histidin-tryptophan-ketoglutarat (HTK, Custodiol, Newtown PA) forud for transplantation.
    BEMÆRK: donor lemmer er transplanteret på den kontralaterale side af modtageren dvs venstre donor lem til den højre side af modtageren og den rette donor lem til den venstre side af modtageren).
12. Aflive donor svin umiddelbart efter høst det andet bagben ved anvendelse af 100 mg / kg IV natriumpentobarbital. Døden bekræftes af det veterinære personale pr etableret protokol.

4.. Modtager Procedure (Hind Limb allotransplantation)

1. Start modtageren induktion og intubation umiddelbart efter den oprindelige donor snit til at tillade udarbejdelse af modtagerlandene fartøjer, mens donor lemmer bliver høstet. Dette eliminerer unødvendig ventetid og reducerer den totale anæstesi tid til donor og modtagere.
2. Placer dyret liggende med en 30 ° rotation på operationsbordet side til Allow eksponering af dorsolaterale side.
3. Foretag en lyske snit og eksponere femorale fartøjer isolere dem distalt til niveauet af suprageniculate grene og proksimalt til niveauet af lyskeligamentet.
4. Opret en subkutan lomme fra lysken til dorsolaterale bugvæggen for graft indsatte (figur 4).
5. Ligere donorfartøjer og skyl graft med HTK.
6. Udfør graft indsat i en omvendt måde: Har huden padle vender dorsolaterale at gøre det let immun overvågning i stående stilling, og de afskårne ender af femorale fartøjer står caudally at tillade ende-til-ende vaskulære anastomoser uden spænding på skibe ( figur 5).
7. Hvis den er tilgængelig, skal du bruge en vaskulær koblingsanordning (Synovis, St. Paul MN) for venøse anastomoser (størrelse 2.5-3.5 er velegnet til dyr 10-20 kg). Dette reducerer iskæmi tiden sammenlignet med konventionelle metoder.
8. Udfør arteriel Anastomoses anvendelse af en konventionel sutur teknik med 9-0 sutur (Synovis, St. Paul MN)
9. Efter vaskulær åbenhed bekræftes fastgøre protesen på plads med 3-0 PDS suturer (figur 5). Musklerne i implantatet sys til bugvægsmuskulatur. Graft muskler bør ikke sutureres til de modtagende lårmuskel, da det kan være skadelige, når dyret bevæger sig rundt i buret.
10. Eksteriorisere huden paddle dorsolaterale side til immunovervågning (figur 6), og suturere den til den tilstødende hud ved hjælp af 3-0 Vicryl subkutane suturer og 4-0 monofilament resorberbare afbrudte hud suturer.
11. Luk lysken huden i lag under anvendelse af 3-0 Vicryl subkutane suturer og 4-0 monofilament resorberbare afbrudte hud suturer.
12. Placer en 50-100 mcg / hr fentanyl plaster til postoperativ analgesi.
13. Efter bagben allotransplantation, sende dyret tilbage til sin pen engang vågen og vejrtrækning mageligt på egen hånd.

Representative Results

Fireogtyve SLA-definerede svin heterotopisk bagben transplantationer blev udført ved hjælp af vores modificeret teknik med en gennemsnitlig iskæmi tid på 78 min (Rækkevidde: 62-94 min.) Graft indsat og dorsolaterale hud padle positionering blev opnået uden besvær i alle dyr. Nær infrarød laser angiografi viste fremragende graft perfusion i alle modtagere. De første tolv venøse anastomoser blev udført under anvendelse af konventionelle sutur teknikker, mens de sidste tolv venøse anastomoser blev udført ved anvendelse af en vaskulær koblingsanordning. Et dyr med det konventionelle sutur teknik krævede en reanastomosis når en venøs blodprop blev identificeret umiddelbart efter procedure. Ingen komplikationer blev observeret i nogen anastomoser udført med tilkoblingsanordning. Recipient dyr modtog en kortvarig behandling (30 dage) af tacrolimus monoterapi med eller uden donorknoglemarv (BM) infusion og co-stimulerende blokade. Tacrolimus dosering blev justeret for at opnå mål-niveauer 10-15 ng / ml. Den korte kursus tacrolimus kun og ubehandlede dyr fungerede som kontroller. Den co-stimulation blokade baseret immunmodulerende protokol resulterede i over 6 måneders overlevelse efter transplantation. Der var ingen tegn på GVHD i enhver modtager. Alle langsigtede efterladte (over 150 dage efter transplantationen) havde levedygtig vaskulariseret knoglemarv på tidspunktet for eutanasi som viser pålideligheden af denne model til undersøgelse unikke immunologiske funktioner i knoglemarven komponent i VCA (figur 7).

Fig. 1. Skematisk diagram af et svin heterotop bagben transplantation. En osteomyocutaneous klap høstes fra donor bagben og transplanteres til en subkutan lomme langs den abdominale væg af modtageren.

FSNIT "fo: keep-together.within-side =" altid ">
Figur 2: Osteomyocutaneous klap høst:. Donor hud padle Perforator zoner lateralt på lårets forside identificeres ved hjælp af laser angiografi at afgrænse huden padle af osteomyocutaneous flap.

Figur 3: Osteomyocutaneous klap høst:. Graft sin vaskulære pedicle Flap bestående af det distale lårben, knæled, proksimale tibia, fibula, lårmuskler og hud pagaj høstes på en femoral vaskulær stilken.

Figur 4: Modtager procedure: CReation af en subkutan abdominal lomme. Subkutan dissektion udføres for at skabe en bugvæggen lomme strækker sig fra lysken til dorsolaterale bugvæggen.

Figur 5: Modtager procedure: Graft indsat og reperfusion efter mikrovaskulær anastomose. End-to-end femoralis fartøj anastomose udføres efter klap nedfældning. Donor lem bruges til den kontralaterale side af modtageren (dvs.. Venstre donor lem til den højre side af modtageren og den rette donor lem til den venstre side af modtageren).

Figur 6: Hud komponent eksterioriseret til dorsolaterale position for immunovervågning. Under indsatte, er klappen anbragt på en sådan måde, at huden pagaj vender dorsolaterale bugvæggen, hvor den sutureres til modtageren huden. Denne position giver nem overvågning af klappen.

Figur 7: Repræsentant billeder fra transplanterede dyr: (A) Langsigtet survivor (> 150 dage) uden kliniske tegn på afstødning. (B) Langsigtet overlevende (> 150 dage) uden kliniske tegn på afstødning. Allotransplantatet blev opnået fra en donor med mørk hudfarve. Både (A) og (B) modtog costimulering blokade (CTLA4Ig) baseret immunmodulerende behandling. (C) Negativ kontrol (kortvarig tacrolimus), hvis de-epitelialisering og avanceret afvisning, så snart tacrolimus blev trukket tilbage (dag 30).

Discussion

Historisk set heterotop bagbenet transplantation protokol omfattede eksteriorisering af en hud padle til den ventrale bugvæggen og skibene blev anastomoseret i en ende-til-side måde (Hettiarachty 2004). Men i vores modificerede metode, en inverteret klap insetting og end-to-end anastomoser bringe huden padle mere sideværts og dermed letter immun overvågning i stående stilling af dyret. Identificeringen af ​​sural arterie og de zoner maksimal perfusion ved hjælp af nær infrarød laser angiografi yderligere forbedrer pålideligheden af ​​huden pagaj.

I vores modificeret teknik udfører vi ende-til-ende anastomose mellem de femorale fartøjer for at minimere tekniske fejl relateret til microvascular anastomose. End-to-end anastomose også muligt for os at bruge en vaskulær koblingsanordning (Synovis St. Paul MN) for venøs anastomose, hvilket yderligere reduceret varm iskæmi tid. Det er vores erfaring, blev iskæmi tid mere forudsigestand med anvendelse af en koblingsindretning, og da variationer i iskæmi tid er direkte korreleret med immunologisk resultat, denne modifikation forbedret pålideligheden af ​​denne model. Men anvendelsen af ​​en koblingsindretning resulterer i yderligere materiale omkostninger, men anses stadig omkostningseffektiv baseret på den samlede omkostninger ved proceduren og undgåelse af potentielle komplikationer.

Vores heterotopisk bagben transplantationer øjeblikkeligt produceret cirkulerende donor-afledte knoglemarvsceller som det fremgår af mandlig donor afledt SRY kvantitativ PCR-analyse. Desuden blev levedygtigheden af ​​knoglemarven komponent allotransplantatet i vores langsigtede overlevende bekræftet ved brug af immunhistokemi. Dette forbedrer yderligere pålideligheden af ​​vores model som en undersøgende redskab for unikke immune privilegerede funktioner vaskulariseret knoglemarv, hvilket er en vigtig del af visse rekonstruktive transplantationer. Denne osteomyocutaneous flap indeholder også knæleddet med artikulær cartilage og en synovial membran og fungere som en pålidelig model til at vurdere afstødning af disse specialiserede strukturer.

Trods det faktum, at denne model synes at være ideel til translationelle undersøgelser af immunologiske aspekter af VCA og dets komponenter, herunder hud, muskler, nerver, fartøjer og led det stadig ikke giver mulighed for vurdering af et funktionelt resultat. Når den immunologiske barriere er overvundet, kan yderligere ændringer og / eller yderligere translationelle modeller udføres for at undersøge terapeutiske strategier sigter mod at forbedre motorisk og sensorisk funktion VCA.

Ved hjælp af denne model, vores gruppe vist, at højdosis knoglemarv celle infusion kombineret med co-stimulerende blokade optimeret induktionsbehandling, reduceret vedligeholdelse immunosuppression, og på ubestemt tid forlænget graft overlevelse ^16. Sådanne målrettede immunmodulerende protokoller, der kombinerer knoglemarv cellebaserede strategier og biologiske måske Facilitate immuntolerance og fjerne behovet for multilægemiddelresistens immunosuppression at opretholde transplantat overlevelse efter VCA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
HTK	Custodial	N/A
EQUIPMENT
Electric Pen Drive	Synthes, Westchester PA	05.001.011	Reciprocating saw
Vascular Coupling device	Synovis, Newtown PA	21003B