En modifisert Heterotop Svine Hind Limb Transplant Modell for Translasjonell vaskualisert Composite Allotransplantation (VCA) Forskning

Summary

Vaskualisert Composite Allotransplantations (VCA) har blitt en klinisk virkelighet. Imidlertid er bred klinisk anvendelse av VCA begrenset av kronisk multi-drug immunsuppresjon. Forfatterne presenterer en pålitelig og reproduserbar store dyremodell for å oversette romanen immunmodulerende strategier som kan redusere eller potensielt eliminere behovet for immunsuppresjon i VCA.

Abstract

Vaskualisert Composite Allotransplantation (VCA) som hånd-og ansiktstransplantasjoner representerer et levedyktig alternativ behandling for komplekse muskel-skjelett traumer og ødeleggende vev tap. Til tross for gunstige og svært oppmuntrende tidlig og middels funksjonelle utfall, avvisning av den svært immunogenic hud komponent i en VCA og potensielle negative effektene av kronisk multi-drug immunsuppresjon fortsette å hemme utbredt klinisk anvendelse av VCA. Derfor må forskning på dette nye felt for å fokusere på translasjons studier relatert til unike immunologiske egenskaper av VCA og for å utvikle nye immunmodulerende strategier for immunomodulering og toleranseinduksjon følgende VCA uten behov for langvarig immunsuppresjon.

Denne artikkelen beskriver en pålitelig og reproduserbar translatorisk store dyremodell av VCA som består av en osteomyocutaneous klaff i et MHC-definert svin heterotop hind lem allotransplantation. Briefly, er et godt vascularized hud padle identifisert i anteromedial lår regionen ved hjelp av nær infrarød laser angiografi. De underliggende muskler, kneleddet, distal femur, og proksimale tibia er høstet på en femoral vaskulær pedicle. Dette allograft kan betraktes som både en VCA og en vaskularisert benmargstransplantasjon med sine unike immun privilegerte funksjoner. Transplantatet blir transplantert til en subkutan lomme i abdominal mottakeren dyr med en hud komponent exteriorized til dorsolateral region for immunovervåkning.

Tre kirurgiske team jobber samtidig i en godt koordinert måte å redusere anestesi og iskemi ganger, og dermed forbedre effektiviteten av denne modellen og redusere potensielle confounders i eksperimentelle protokoller. Denne modellen fungerer som grunnlaget for fremtidige terapeutiske strategier som tar sikte på å redusere og potensielt eliminere behovet for kroniske multi-drug immunsuppresjon i VCA.

Introduction

Vaskualisert Composite Allotransplantation (VCA) som hånd-og ansiktstransplantasjoner er nå en klinisk virkelighet med mange hender og ansikt transplantasjoner utføres på verdensbasis ^12. Til tross for det faktum at tidlig og mellomliggende resultater er gunstig og meget oppmuntrende ^2, fortsetter behovet for kronisk multidrug immunsuppresjon for å begrense dens utbredt klinisk anvendelse. Fremskritt i murine modeller av VCA inkludert super-mikro anastomoser og nonsuture cuff teknikker ^{13, 3} har banet vei for en bedre forståelse av alloimmun responser i VCA. Myriader av immunmodulerende protokoller har blitt foreslått for kliniske applikasjoner basert på vår bedre forståelse av immunmekanismer i VCA men de må vurderes fortløpende i et stort dyr modell som ville være rimelig forutsigbare for deres prestasjoner hos mennesker ^7. Basert på fysiologiske og immunologiske likheter mellom mennesker og svin organsystemer 9 og ikke-menneskelige primater modeller ^en.

Denne artikkelen gir en detaljert oversikt over metodene som er brukt i vår MHC-definert svine heterotop hind lem transplantasjon modell, som fungerer som grunnlag for våre nåværende og fremtidige immunmodulerende strategier som tar sikte på å indusere immuntoleranse til VCA og dermed utvide sitt klinisk anvendelse. Vi bruker godt karakterisert innavlede griser avlet for å homozygosity på svine leukocyttantigen locus spesielt for deres bruk i transplantasjon relatert forskning ^11. Vi heve en vaskularisert osteomyocutaneous klaff basert på femoral fartøy. Klaffen inneholder intakt vaskularisert benmarg i distal femur og proksimale tibia. Den anteromedial lår hud er også inkludert i transplantatet, og er exteriorized til dorsolateral aspekt av mottakeren dyret for immunovervåkning av de mest immunogene komponenten of VCA. Dorsolaterale posisjonering muliggjør klinisk undersøkelse i stående og sittende stilling og holder allograft huden relativt ren også.

Ustener et al. Introduserte en av de første store dyr translasjonsforskning modeller i VCA ved transplantere radial forbena osteomyocutaneous flaps i utav gården griser ^15. Gruppen utnyttes denne modellen for å demonstrere for første gang at akutt avvisning i VCA som omfattet den svært immunogene skin-komponenten kan være forsinket og behandlet med en klinisk relevant strategi uten vesentlige stoff-spesifikke komplikasjoner og sideeffekter. De gunstige resultatene oppnådd i denne studien senere bygget en grunnleggende trinn i utformingen av legemiddelregimer menneskelig rekonstruktiv transplantasjon. Selv om disse tidlig gris VCA modellene var godt egnet for å utvikle protokoller for å forhindre avstøtning av hud, muskler, bein, nerver og fartøy de manglet spesialiserte strukturer som ledd cartilage og synovial membraner i leddene. Påfølgende innsats ble fokusert på å inkludere den mediale siffer av dyret, som nødvendiggjorde full lengde cast plassering for å hindre pode dislodgement ^14. Selv om det er egnet for å undersøke avvisning av alle større deler av lem transplantasjon, er en av de største begrensninger i denne modellen var etter transplantasjon ambulerende vanskeligheter på grunn av fell plassering. Dermed heterotopiske svine lem allotransplantation modeller, som består av tibia, fibula, kneleddet, distal femur, omkringliggende muskler, og en hud padle, ble opprettet for å først og fremst studere immunologiske aspekter av VCA samtidig som dyret til fritt ambulate postoperativt med minimal morbidit ⁸ .

Utviklingen av godt karakterisert SLA-definerte innavlede griser gjennom banebrytende arbeidet til Dr. David H. Sachs førte til en ny æra av translasjonell VCA forskning. Utnytte en heterotop hind lem transplantasjon modell i en mindre antigen mismatch innstilling, Mathes et al. ¹⁰ demonstrerte ubestemt overlevelse av muskel-komponenter med en kort kur med ciklosporin behandling. Huden komponent overlevelse, ble imidlertid bare forlenget sammenlignet med ingen behandling kontroller. Tapet av huden komponenten av transplantatet ble tilskrevet en isolert og meget sterk immunrespons, særlig til overhuden. Tilsvarende bruker fullt umake griser med T-celle uttømming, en kort kur med ciklosporin og cytokin mobilisert giver perifere mononukleære blodceller indusert toleranse bare til muskel-komponenter og huden komponenten ble fortsatt avvist ^fem. Dette fenomenet, som kalles "delt toleranse", brakt et paradigmeskifte i VCA forskning med et større fokus på den høyst immunogenic hud komponent, som er en integrert del av de fleste rekonstruktiv transplantasjoner utført til dags dato.

I denne modifiserte modellen, vi utnytte ende-til-ende-anastomose etter ligating mottakeren lårarterie og rotere det cephalic (Figur 1). Dette reduserer ikke bare iskemi tid ved å tillate bruken av en konvensjonell koblingsinnretning, men også reduserer sjansene for anastomotisk svikt. Vi har ikke observert noen iskemiske hendelser følgende ligation av lårarterie i våre mottakere som indikerer at sikkerhetsstillelse sirkulasjon var tilstrekkelig til å gi vaskularitet til den opprinnelige beinet. I tillegg, i denne modifiserte fremgangsmåte, er externalized huden komponent mobilisert basert på de underliggende perforator fartøyer og er plassert i sideretningen (fig. 1) i motsetning til en ventral lyske posisjon i den tradisjonelle modellen ^10.. Dette gir enkel visualisering av transplantatet for immunovervåking i stående eller sittende stilling av dyret.

Derfor, er en pålitelig og reproduserbar store dyremodell nødvendig for å undersøke toleranseinduksjon strategier mot huden komponenten av VCA og for å utvikle nye noninvasive immunovervåkings strategier for bedre prediksjon av graft overlevelse.

Protocol

I denne videoen publikasjonen, ble alle prosedyrer dyr utført i samsvar med et dyr protokoll godkjent av Johns Hopkins University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).

En. Preoperativ planlegging

1. Vi benytter MHC-definert MGH innavlet miniatyr svin (15-20 kg) i våre translasjonsforskning studier for lem allotransplantation hvor en mannlig donor gir lemmer for to kvinnelige mottakere (figur 1). Før kirurgi, giver-og mottaker dyr gjennomgå grundig klinisk evaluering av en veterinær.
2. For å minimere anestesi og iskemi tiden, er giver-og mottaker prosedyrene utføres samtidig på tre operasjonsbord i en dedikert stort dyr operasjonssalen. Samspill og koordinering mellom kirurgiske team samt veterinær ansatte er avgjørende for å lykkes med denne prosedyren. Den kirurgiske planen er diskutert med veterinærteamet i et formelt møte en-2 Uker før operasjonsdagen.
3. En tunnel sentralt venekateter (7 Fr dobbel lumen Hickman kateter) er plassert i en ekstern eller intern vena jugularis av hver mottaker dyr før transplantasjon for immundempende medikament nivå overvåking og intravenøs administrasjon av immunsuppressive og / eller immunmodulerende legemidler. Disse kateter er plassert under direkte visjon gjennom en venøs cut-down teknikk og tunnel posterior å gå ut høyt på rygg nakke og festes med monofilament absorberbare suturer og plaster festes rundt halsen.
4. Holde dyr NPO (ingen fast føde, men får lov vann ad lib) minst 12 timer før operasjonen.
5. På dagen for operasjonen, sedate dyr med ketamin 20 mg / kg og xylazin 2 mg / kg IM.
6. Plasser en passende størrelse Trachealtube og koble den til anestesiapparatet og ventilator (vedlikeholdes på isoflurane 0,5-3%)
7. Plasser et venekateter i en marginal ørevenen og administrerevekt basert 0,9% saltløsning gjennom hele prosedyren.
8. Administrere pre-emptive analgesi (buprenorfin 0,02 mg / kg IV).
9. Administrer profylaktisk antibiotika (cefazolin 20-25 mg / kg IV) forut for den første innsnitt til både donor-og mottaker-dyr.
10. Bruk steril teknikk i alle prosedyrer for både mottakere og givere. Dette inkluderer bruk av autoklaveres eller gass steriliserte instrumenter, masker, hode caps, sterile operasjonsfrakker og sterile hansker. Barber området av snittet med en klippemaskinen og desinfiser med alternerende Betadine løsning og alkohol.

Intraoperativ Overvåking:

1. Etter induksjon og intubasjon, vedlikeholde anestesi med en innånding blanding 0,5-3% isofluran i oksygen.
2. Overvåke hjertefrekvens, pulsoksymetri, EKG, end-tidal CO ₂ og rektal temperatur kontinuerlig og spille inn hver 15 min.
3. Forhindre nedkjøling med et Bair Hugger varm tvunget-air teppe.

1. Plasser donor dyret i en liggende stilling på operasjonsbordet, og legg i en steril måte.
2. Bruk nær-infrarød laser angiografi å identifisere perforator fartøy til anteromedial huden. Injisere indocyanine grønne på ca 0,06 mg / kg fortynnet i 2-5 ml fysiologisk saltvann gjennom perifer vaskulær tilgang. Omtrent 10 sek senere, utføre 30 sek-2 min av nær infrarøde opptak. Bruk video fra disse innspillingene å identifisere perforators. Basert på perforators, markere et område av huden (ca 100 cm ²⁾ for overvåking.
3. Bruke en skalpell for å lage en lyske skin snitt i kontinuitet med markeringer for huden åre (figur 2).
4. Identifiser femorale fartøy og isolere dem distalt til nivået av de suprageniculate grener og proksimalt til nivået av lyskeligament.
5. Dissekere hud og underhud mens preserving det område av huden åren. Sy kantene på huden til en underliggende muskler for å unngå sammentrekning ved klaff innhøsting.
6. Utfør en osteotomi like over Tarsus bruke en bajonettsag (Electric Pen Drive, Synthes, West Chester PA).
7. Fordel musklene i proksimale lår hjelp elektrokauterisering.
8. Fordel femur på mid-aksling forlate en osteomyocutaneous klaff på en vaskulær pedicle. Klaffen inneholder huden padle, underliggende lårmusklene, kneleddet, distal femur og proksimale tibia som inkluderer intakt vaskularisert benmarg med sine unike immunologiske egenskaper.
9. Bruk bein voks for å oppnå hemostase i marg mellomrom. Glatt beinkanter bruker ronjeurs i forberedelse til mottakeren.
10. Hold pode perfundert på sin vaskulær pedicle til mottakerens femoral fartøy er forberedt (figur 3).
11. Når mottakeren disseksjon er fullført, ligere donor femorale fartøy som proksimalt som mulig ennd sette mot pode med histidin-tryptofan-ketoglutarat (HTK, Custodiol, Newtown PA) før transplantasjonen.
    MERK: donor lem blir transplantert på motsatt side av mottakeren dvs. venstre donor lem for høyre side av mottakeren og riktig donor lem for venstre side av mottaker).
12. Avlive donor pig umiddelbart etter høsting den andre hind lem ved hjelp av 100 mg / kg IV natrium pentobarbital. Døden er bekreftet av veterinær ansatte per etablert protokoll.

4. Mottaker Prosedyre (Hind Limb Allotransplantation)

1. Start mottaker induksjon og intubasjon umiddelbart etter den første donor innsnitt for å tillate fremstilling av mottaker skipene mens donor lem blir høstet. Dette eliminerer unødvendige ventetiden og reduserer den totale tid for anestesi donor og mottaker.
2. Plasser dyret liggende med en 30 ° rotasjon på betjeningssiden i Allow eksponering av dorsolateral side.
3. Lag en lyske snitt og utsett femorale fartøyene, isolere dem distalt til nivået på de suprageniculate grener og proksimalt til nivået av lyskeligament.
4. Lag en subkutan lomme fra lysken til dorsolateral bukveggen for pode innfelt (figur 4).
5. Ligate donor fartøy og skyll pode med HTK.
6. Utfør transplantatet innsatt i en omvendt måte: Har huden paddle vender dorsolateral å tillate enkel immunovervåking i en stående posisjon og de kappede ender av de femorale fartøy motstå kaudalt for å tillate ende-til-ende-vaskulære anastomoser uten spenning på fartøyene ( figur 5).
7. Hvis det er tilgjengelig, kan du bruke en vaskulær koblingsenhet (Synovis, St Paul MN) for venøse anastomoser (størrelse 2.5 til 3.5 er egnet for 10-20 kg dyr). Dette reduserer i betydelig grad iskemi tid sammenlignet med konvensjonelle metoder.
8. Utfør arteriell ANASTomoses ved hjelp av en konvensjonell sutur teknikk med 9-0 sutur (Synovis, St Paul MN)
9. Etter vaskulær patency er bekreftet, sikre pode på plass med 3-0 PDS suturer (figur 5). Musklene i pode er sutureres til bukveggen muskler. De podede musklene skal ikke sutureres til mottaker lårmusklene ettersom den kan være skadelig når dyret beveger seg rundt i buret.
10. Exteriorize huden padle på dorsolateral side for immunovervåkning (figur 6), og sy den til den tilstøtende hud ved hjelp av 3-0 Vicryl subkutane suturer og 4-0 monofilament absorberbare avbrutte suturer hud.
11. Lukk lysken huden i lag ved hjelp av 3-0 Vicryl subkutane sting og 4-0 monofilament absorberbare avbrutte hud sting.
12. Plasser en 50-100 mcg / time fentanyl patch for postoperativ smertelindring.
13. Etter hind lem allograft transplantasjon, returnerer dyret til sin penn en gang våken og puster godt på egen hånd.

Representative Results

Tjuefire SLA-definerte svin heterotop hind lem transplantasjoner ble utført ved hjelp av vår endret teknikken med en gjennomsnittlig iskemi tid på 78 min (Range: 62-94 min). Graft innfelt og dorsolaterale hud padle posisjonering ble oppnådd uten problemer i alle dyr. Nær infrarød laser angiografi viste utmerket pode perfusjon i alle mottakerne. De første tolv venøse anastomoser ble utført ved bruk av konvensjonelle suture teknikker mens de siste tolv venøse anastomoser ble utført ved hjelp av en vaskulær koblingsinnretning. Ett dyr med konvensjonell sutur teknikk kreves en reanastomosis når en venøs trombe ble identifisert umiddelbart etter prosedyren. Ingen komplikasjoner ble observert i alle anastomoser gjennomført med tilkoblingsanordningen. Mottaker dyr fikk et kort kurs (30 dager) av takrolimus monoterapi med eller uten donor benmarg (BM) infusjon og kostimulasjonsblokade. Tacrolimus doseringen ble justert for å oppnå ønsket nivå 10-15 ng / ml. Den korte kurs takrolimus bare og ubehandlede dyr fungerte som kontroller. Den co-stimulering blokaden basert immunmodulerende protokoll resultert i over seks måneders overlevelse etter transplantasjon. Det var ingen bevis for GVHD i noen mottaker. Alle langsiktige overlevende (utover 150 dager etter transplantasjon) hadde levedyktig vaskularisert benmarg på tidspunktet for aktiv dødshjelp som demonstrerer påliteligheten av denne modellen for å undersøke unike immunologiske funksjoner i benmargen komponent av VCA (figur 7).

Figur 1. Skjematisk diagram av en svin heterotop hind lem transplantasjon. An osteomyocutaneous klaff er høstet fra donor hind lem og transplantert i en subkutan lomme langs bukveggen til mottakeren.

itle "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 2: Osteomyocutaneous klaff innhøsting:. Donor hud padle Perforator soner anterolateralt i låret er identifisert ved hjelp av laser angiografi for å avgrense huden padle av osteomyocutaneous klaff.

Figur 3: Osteomyocutaneous klaff innhøsting:. Graft på sin vaskulær pedicle Klaff består av distale femur, kneleddet, proksimale tibia, fibula, lårmuskler og hud padle er høstet på en femoral vaskulær pedicle.

Figur 4: Mottaker prosedyre: Creation av en subkutan abdominal lomme. Subkutan disseksjonen utføres for å opprette en bukveggen lomme som strekker seg fra skrittet til dorsolateral bukveggen.

Figur 5: Mottaker prosedyre: Graft innfelt og reperfusjon etter mikrovaskulær anastomose. Ende-til-ende-femoral fartøy anastomose utføres etter klaff innfelt. Donor lem brukes for den kontralaterale siden av mottakerens (det vil si. Venstre donor lem for høyre side til mottakeren og den rette donor lem for den venstre siden av mottakeren).

Figur 6: Skin komponent exteriorized til dorsolaterale posisjon for immunovervåking. Under innfelling, blir klaffen plassert på en slik måte at huden padle vender dorsolateral bukveggen hvor den sutureres til mottakeren huden. Denne posisjonen gir enkel overvåking av klaffen.

Figur 7: Representant bilder fra transplanterte dyr: (A) Long term overlevende (> 150 dager) uten kliniske tegn på avvisning. (B) Long term overlevende (> 150 dager) uten kliniske tegn på avvisning. Den allograft ble oppnådd fra en donor med mørk farge huden. Både (A) og (B) fikk co-stimulering blokade (CTLA4Ig) basert immunmodulerende behandling. (C) Negativ kontroll (kortsiktig takrolimus bare) med de-epithelialization og avansert avvisning så snart takrolimus ble trukket tilbake (Dag 30).

Discussion

Historisk sett, inkludert den heterotopiske hind lem transplantasjon protokollen exteriorization av en hud padle til ventral bukveggen og fartøyene ble anastomoseres i en ende-til-side måte (Hettiarachty 2004). Imidlertid, i den modifiserte fremgangsmåte, en invertert klaff insetting og ende-mot-ende anastomose bringe huden paddle mer sideveis og dermed letter immunovervåking i en stående posisjon av dyret. Identifiseringen av Sural arterie og sonene maksimalt perfusjon ved hjelp av nær-infrarød laser angiografi ytterligere forbedrer påliteligheten av huden åren.

I vår endret teknikk, utfører vi ende-til-ende-anastomose mellom de femoral fartøy for å minimere tekniske feil relatert til mikrovaskulær anastomose. Ende-til-ende-anastomose også gjort oss i stand til å bruke en vaskulær koblingsenhet (Synovis St. Paul MN) for venøs anastomose, noe som ytterligere redusert varm iskemi tid. I vår erfaring, ble iskemi tid mer forutsistand med bruk av en skjøteanordning, og siden variasjon i iskemi tid er direkte korrelert med immunologisk resultat, forbedret denne modifikasjon påliteligheten av denne modellen. Imidlertid resulterer bruken av en skjøteanordning i ytterligere materialkostnader, men er fortsatt betraktet kostnadseffektiv basert på den totale kostnaden av fremgangsmåten, og å unngå mulige komplikasjoner.

Våre heterotopiske hind lem transplantasjoner umiddelbart produsert sirkulerende donor-avledet benmargceller som gjenspeiles av mannlig donor avledet SRY kvantitativ PCR-analyse. I tillegg ble levedyktigheten til benmargen komponent av allograft i våre langsiktige overlevende bekreftet ved hjelp av immunhistokjemi. Dette forbedrer ytterligere påliteligheten av vår modell som en undersøkende verktøy for unike immun privilegerte funksjoner i vaskularisert beinmarg, som er en nøkkelkomponent i visse rekonstruktiv transplantasjoner. Denne osteomyocutaneous klaff inneholder også kneleddet med ledd cartilage og en synovial membran og tjene som en pålitelig modell for å vurdere avvisning av disse spesialiserte strukturer.

Til tross for at denne modellen ser ut til å være ideell for translasjonsforskning studier som undersøker immunologiske aspekter av VCA og dens komponenter, inkludert hud, muskler, nerver, fartøyer og ledd det fremdeles ikke tillater for vurdering av et funksjonelt utfall. Når immunologisk barriere er overvunnet, kan ytterligere endringer og / eller tilleggs translasjonsforskning modeller utføres for å undersøke terapeutiske strategier for å bedre motorisk og sensorisk funksjon av VCA.

Ved hjelp av denne modellen, viste våre gruppe som høydose benmargscelle infusjon kombinert med kostimulasjonsblokade optimalisert induksjonsbehandling, reduserte vedlikeholds immunsuppresjon, og ubestemt tid langvarig transplantatoverlevelse ^16.. Slike målrettede immunmodulerende protokoller som kombinerer beinmargscellebaserte strategier og biologiske kanskje facilitate immuntoleranse, og eliminere behovet for multimedikament immunsuppresjon for å opprettholde transplantatoverlevelse etter VCA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
HTK	Custodial	N/A
EQUIPMENT
Electric Pen Drive	Synthes, Westchester PA	05.001.011	Reciprocating saw
Vascular Coupling device	Synovis, Newtown PA	21003B