Summary
قمنا بقياس الافراج عن التوتر في محور عصبي التي تم lesioned جزئيا مع مشرح ليزر من قبل في وقت واحد القياس الطيفي قوة أجريت على اجراء تحقيق بصريا-المحاصرين انضمت إلى غشاء من محور عصبي. بروتوكول التجريبية المتقدمة بتقييم التصاق محوار إلى الركيزة الثقافة.
Abstract
ويتأثر تشكيل اتصالات وظيفية في شبكة الخلايا العصبية النامية من خلال اشارات خارجية. هو نمو محوار من الخلايا العصبية النامية عرضة للإشارات الكيميائية والميكانيكية، والآليات التي الحواس ويستجيب لإشارات الميكانيكية غير مفهومة جيدا. سوف توضيح دور القوات في نضوج الخلية تمكين تصميم السقالات التي يمكن أن تعزز التصاق الخلايا واقتران هيكل الخلية إلى الركيزة، وبالتالي تحسين قدرة من أنواع الخلايا العصبية المختلفة لتجديد بعد الاصابة.
هنا، نحن تصف طريقة لتطبيق في وقت واحد قياسات التحليل الطيفي خلال قوة الليزر التي يسببها الآفة الخلية. نقيس الافراج عن التوتر في محور عصبي lesioned جزئيا من خلال تتبع التداخل في وقت واحد من اجراء تحقيق المحاصرين بصريا انضمت إلى غشاء من محور عصبي. لدينا بروتوكول تجريبي بالكشف عن الافراج عن التوتر مع piconewton حساسية، والديناميكية لإطلاق سراح التوتر فيالقرار وقت ميلي ثانية واحدة. ولذلك، فإنه يوفر وسيلة عالية الدقة لدراسة كيفية اقتران الميكانيكية بين الخلايا وركائز يمكن أن يكون عن طريق التضمين العلاج الدوائي و / أو عن طريق الخواص الميكانيكية متميزة من الركيزة.
Introduction
المجهر الضوئي هو واحد من نظام التصوير أقل الغازية المتاحة لمراقبة الخلايا الحية. مع استغلال تأثيرات مثل ضغط الإشعاع (كما في ملاقط بصرية 1)، أو ذات الطاقة العالية تدفق الفوتون (كما هو الحال في الليزر مشرح 2)، تم تمديد هذه التكنولوجيا لنانو التلاعب. نظام التصوير الضوئي وتقدم لمراقبة دقيقة لتصور والتلاعب أهداف الخلوية الفرعية 3. في الوقت نفسه، وذلك بفضل لمعايرة دقيقة من قوة الليزر تسليمها، أدوات بصرية إنجاز إما لينة أو الغازية التلاعب عينة مع استنساخ لم يسبق لها مثيل.
عدة مختبرات متكاملة، في نفس الإعداد التجريبية، ملاقط بصرية ومشرح الليزر ليجتذ العضيات 4، لتلتحم مع بعضها خلايا مختلفة 5، أو لتحفيز الخلايا عن طريق مدفوعة بصريا الشحنات 6،7. بينما ملاقط بصرية، بعد معايرة لصلابة البصرية، تسمح للسيطرة القوة المطبقة على الخلية على نطاق piconewton، ويمكن لنظم تشريح الليزر تعدل التلاعب البصرية، والتي تتراوح من غشاء الصور poration إلى الاجتثاث من العضيات واحد أو تشريح هياكل شبه الخلوية. ومع ذلك، يعتمد الليزر معايرة تشريح على التقييم النوعي للكيان من التلاعب البصرية فيما يتعلق الطاقة تسليمها إلى عينة، تقوم أساسا على تحليل الصور التي توضح التغيرات المورفولوجية التي لحقت عينة 8. في الطريقة المعروضة، ونحن لشرح كيفية تنفيذ القياس الطيفي قوة أثناء تشريح محور عصبي الليزر من الخلايا العصبية النامية، على القياس، وعلى نطاق وpiconewton، القوة التي ينتجها التوازن تغير في بنية الهيكل الخلوي من حجرة شبه الخلوية 9. الخلايا العصبية مثقف التمسك الركيزة، واستقطاب خلال التنمية. وتحدث هذه المرحلة الاستقطاب خلال الأيام الخمسة الأولى في المختبر. في المرحلة الثانية من الاستقطاب، واحدة من extrudneurites التي جي يصبح أطول، وأنها سوف تفرق أن تصبح محور عصبي 10. استطالة محور عصبي ردا على قوة سحب في مخروط النمو قد صيغت من قبل نموذج Dennerl في 11. في الآونة الأخيرة، وقد تم تمديد هذا النموذج ليشمل 12 دور التصاق محوار إلى ركائز المصفوفة خارج الخلية. وأظهر هذا النموذج الفيزيائية الحيوية، اقترح بعد الملاحظات التجريبية 13، أن سحب القوات على مخروط النمو، نشر على طول محوار، هي عن طريق التضمين الالتصاقات البؤرية إلى الركيزة. وبالمثل، آفة محور عصبي ينتج الافراج المحلية من التوتر نشر نحو خلايا الجسم. وبالتالي، اقترحنا أن قياس مثل التوتر الذي صدر في مكان على طول محور عصبي بين الآفة وسوما الخلية توفر إمكانية لتقييم نتائج الملطف من الالتصاقات البؤرية تتأثر.
نحن معايرة اللازمة طاقة الفوتون-الجريان للمشرح ليزر للتحكم في مدى ل damag محور عصبي ألحقته، من عانى من قطع كامل للآفة جزئية. بعد المعايرة، كررنا آفة جزئية إلى محاور عصبية من الخلايا العصبية عدة التفريق وضعت بروتوكول لقياس الافراج عن التوتر، وبالتالي الحصول على معلمة الكمي لتقدير التصاق من محور عصبي إلى الركيزة 14.
في العمل الحالي، ونحن تصف بالتفصيل بروتوكول المتقدمة، وهو ما يمثل الإجراء التجريبي دقيقة لتقييم ومقارنة مع piconewton حساسية الالتصاق محور عصبي إلى الركيزة في ظروف تجريبية مختلفة مثل المعالجة الكيميائية 14، أو أنواع مختلفة من الدعم ثقافة الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الإعداد البصرية
وقد وصفت النظام البصري بأكمله في وقت سابق 15. لفترة وجيزة، ويستند نظام ملاقط بصرية على موجة مستمرة ايتربيوم (CW) ألياف الليزر التشغيل في 1064 نانومتر (IPG الليزر شركة محدودة). A المكانية المغير ضوء (حركة تحرير السودان) (LCOS-حركة تحرير السودان، نموذج X10468-07 - هاماماتسو) يختلف المرحلة من شعاع الليزر تحت الحمراء واردة للسيطرة على الموقف من بقعة محاصرة التركيز على طبق الثقافة عن طريق الصور المجسمة ولدت الكمبيوتر. الأزرق ملاقط البرنامج (رابط على طاولة معدات الويب) الصور المجسمة ولدت متاحة بحرية المتوقعة على المغير ضوء المكاني. واستند تداخل لقياس الطيفي قوة على الثنائي الضوئي أربعة رباعي (QPD، S5980 مع C5460SPL 6041 BOARD - هاماماتسو) والثنائي الضوئي (PD، PDA100A-EC - Thorlabs).
وكان مصدر تشريح ليزر نبضية-النانوسيكند الفرعية للأشعة فوق البنفسجية الثانية: YAG الليزر في 355 نانومتر (PNV-001525-040، PowerChip نانو ليزر الأشعة فوق البنفسجية نبض - تيم الضوئيات). وصوتيةالبصرية المغير (MQ110-A3 للأشعة فوق البنفسجية، 355 نانومتر تنصهر السيليكا-AA-علم البصريات الالكترونية) سيطر على قوة الليزر الأشعة فوق البنفسجية تسليمها إلى عينة.
أدمجت ملاقط بصرية ثلاثية الأبعاد والليزر الجزئي مشرح على المجهر تستقيم تعديل (BX51 - أوليمبوس) مجهزة 60X، 0.9 NA المياه غمس يتكون objective.The مرحلة من مراحل المجهر من 3 محاور خطي DC السيارات الصغيرة لتحديد المواقع نظام (M-126.CG1، الفيزياء، الصكوك) يحمل 3 محاور كهرضغطية المرحلة نانو تحديد المواقع منفصلة (P-733.3DD، الفيزياء، الصكوك) إلى الجمع بين حركة الخشنة من العينة مع قرار نانومتر الفرعية للبيزو المرحلة. وقد تم تجهيز نظام المسرح المجهر مع اثنين من التحكم في حلقات العمل بالتآزر للحفاظ على التركيز بقعة محاصرة في موقف الحق، وهذا يتوقف على طريقة العمل المحدد (موقف أو المشبك قوة، ثابتة أو دينامية) 16. على وجه الخصوص، حلقة ردود الفعل الداخلية يعمل على مرحلة كهرضغطية، للحفاظ على حبة في تحديدإد المسافة من مركز الفخ. حلقة خارجية أخرى تسيطر على الموقف من مرحلة الآلية لاستغلال المنطقة التي تغطيها بيزو المحرك على مساحة أكبر من المتوفرة لديها السكتة الدماغية 17. عندما المرحلة بيزو تصل إلى الحد من السكتة الدماغية المتوفرة في اتجاه واحد، وحلقة خارجية يتحرك المرحلة الدقيقة في الاتجاه المعاكس، وبالتالي فإن بيزو يسترد نحو موقعها المركزي لأنها تتبع المحاصرين حبة انضمت إلى عينة. عندما تصل إلى مرحلة بيزو المركز الأساسي للمجموعة ومسارها، توقف المرحلة الدقيقة. يتم الإبلاغ عن مزيد من التفاصيل عن النظام في Guiggiani آخرون 16،17.
جهاز بلتيير (QE1 التدفئة مقاوم مع TC-344B تحكم سخان قناة مزدوجة - وارنر صكوك) يتحكم في درجة حرارة زراعة الخلايا تحت المجهر (37 ° C). في الثقافة، والحفاظ على درجة الحموضة والرطوبة في الظروف الفسيولوجية التي كتبها تهوية وpolydimethyl مصمم خصيصاsiloxane (PDMS) كم (دمج الهدف المجهر) مع كربوجين ترطيب (95٪ O 2، 5٪ CO 2).
2. إعداد خلية ثقافة
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل وزارة الصحة الإيطالية. تم الحصول على الثقافات الأولية من الحصين من الفئران (C57BL6J، تشارلز ريفر) في يوم الجنينية 18 (E18).
- كانت مطلية الخلايا العصبية عند تركيز من 25،000 خلية / مل على أطباق بتري الزجاجية القاع (P35G-0-14-C - شركة ماتيك). هناك حاجة إلى تركيز منخفض من الخلايا المستزرعة لتجنب تكوين شبكة كثيفة بالفعل في الأيام الأولى في المختبر. في تركيز الخلية المذكورة، واحتمال العثور على خلايا معزولة مع محوار يعد غير متصل إلى خلايا أخرى أعلى من ذلك بكثير.
3. طلاء حبة
- وقد تم طلاء البوليمر المجهرية (O 4 ميكرون، معامل COOH بصفر-الانفجارات، ورمز المنتج PC05N/6700) مع بولي-D-يسين باتباع الإجراء هو موضح في polyLink بروتين كيت اقتران (Polysciences، رمز المنتج 19539). والمغلفة الخرز مع نفس الجزيء تستخدم لتغطية دعم الثقافة وصالح الخلايا التصاق.
4. اختيار الخلية العصبية معزولة. فصل حبة من الثقافة الركيزة، فخ وتحريكه بجانب الخلية العصبية
- وضع طبق بتري الثقافة على المسرح المجهر. بعد تعيين التركيز على عينة من قبل الحركة المرحلة، تصحيح موقف مكثف الهدف إلقاء الضوء على مجموعة كولر في الإضاءة. محاذاة البصريات الإضاءة لضبط حالة Kolher في الإضاءة أمر ضروري لتحسين جودة التصوير مشرق الميدان. باستخدام مثل هذه الظروف المحاذاة، بل هو أيضا ضروري لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة جمع ليزر الأشعة تحت الحمراء (من خلال المكثف الهدف)، من نثر التحقيق المحاصرين، لأداء تتبع لها التداخل من قبل QPD وPD.
- ماصة ميكرولتر من عدد قليل من المغلفة المكروية محلول المخزون فيإلى الطبق الثقافة. وسوف تودع المجهرية والتمسك الركيزة الثقافة. عدد ميكرولتر حقنها في صحن الثقافة يعتمد على تركيز المكروية من محلول المخزون. الشرط المثالي هو أن يكون بين واحد واثنين المجهرية في مجال التصوير للعرض. عندما تتم إضافة عدد كبير جدا من المجهرية إلى الطبق والثقافة، وأنها يمكن أن نعلق بالفعل عشوائيا إلى الخلايا العصبية مثقف.
- التحرك في الطبق الثقافة، والبحث للحصول على الخلايا العصبية معزولة مع أطول محوار (محور عصبي)، وانقاذ الموقف من المسرح المجهر.
- التحرك والبحث عن حبة انضمت إلى دعم الثقافة.
- بدوره على الليزر محاصرة الأشعة تحت الحمراء. في هذه المرحلة، ومن المتوقع أن لا الهولوغرام على حركة تحرير السودان، والموقف من الأشعة تحت الحمراء بقعة الليزر يتزامن مع الأشعة فوق البنفسجية موقف بقعة الليزر. تعيين موضع المحوري للبقعة IR 2-3 ميكرومتر فوق السطح لدعم الثقافة، من خلال المجهر مرحلة الحركة.
- تعيين قوة الليزر الأشعة فوق البنفسجية تسليمها إلى عينة إلى أقل من 1 μW. الوقد الأشعة فوق البنفسجية الليزر مشرح سابقا معايرة 14:
5-6 μW وذاب الدعم الزجاج
4 μW يتم تشريح اتصال الخلايا العصبية تماما
2.5 μW يتم lesioned لمحوار جزئيا
<1 μW يتم إنتاج موجة صدمة في صحن الثقافة. موجة الصدمة البصرية قوي بما فيه الكفاية لفصل حبة من الدعم الزجاج. - بدوره على الليزر الأشعة فوق البنفسجية، في حين ترك ليزر الأشعة تحت الحمراء على، ونقل بقعة الأشعة فوق البنفسجية فوق انضمت حبة بواسطة المجهر مرحلة الحركة. ويفصل حبة من على سطح الأرض، وأنه هو المحاصرين من قبل ليزر الأشعة تحت الحمراء. ثم قم بإيقاف تشغيل الليزر الأشعة فوق البنفسجية.
- نقل مفخخة حبة عدة ميكرومتر فوق مستوى الدعم الزجاج (20-30 ميكرون). ورفع حبة لهذا المنصب منعه من الاتصال خلايا أخرى بينما يتم نقله نحو الخلايا العصبية المختار سابقا. جلب حبة لموقف المرحلة المحفوظة مسبقا. تعيين سرعة المرحلة إلى قيمة منخفضة (10 ميكرون / ثانية) وبالتالي فإن قوة السحب السائل لا يتجاوز فخ البصريةقوة بينغ.
5. تحريك موضع فخ فيما يتعلق بقعة مشرح ليزر واكسون الموقع بواسطة الحاسوب صورة ثلاثية الأبعاد المولدة، ومعايرة الملقط تصلب بصري
- حرك حبة نحو دعم الزجاج لتصور محور عصبي. يقام حبة فوق الخلية لتجنب الاتصال معها (حوالي 5 ميكرون فوق مستوى الدعم الزجاج).
- تحريك خشبة المسرح المجهر لنقل التركيز بقعة الأشعة فوق البنفسجية على مركز عرض محور عصبي. انقاذ الموقف المرحلة الحالية.
- تحريك موضع نقطة التركيز IR بواسطة الهولوغرام الحاسوب ولدت. في هذه الخطوة، يتم وقف المرحلة في موقف المختار في الخطوة السابقة. عندما يتوقع أن الهولوغرام الحاسوب ولدت في حركة تحرير السودان، يتم نقل حبة المحاصرين فيما يتعلق محور عصبي. نحن نتحرك على الفور ليزر الأشعة تحت الحمراء لديها حبة المحاصرين محاذاة على وسط محوار، مع بقعة الليزر الأشعة فوق البنفسجية تركزت على نفس محوار جدا. يتم وضع بقعة الأشعة تحت الحمراء وبالتالي حبة المحاصرين على طول محوار5-10 ميكرون بعيدا عن بقعة الأشعة فوق البنفسجية. نحن نتحرك موقف الأشعة تحت الحمراء فيما يتعلق بقعة الأشعة فوق البنفسجية اعتمادا على هندسة محوار. في حال لم يتم تجهيز ملاقط بصرية مع نظام حركة تحرير السودان، والموقف يمكن أن تختلف حسب المرايا إمالة، أو انحراف البصرية الصوتية، على مسار بصري IR. بقعة الليزر IR قد يكون وضع 5-10 ميكرون بعيدا عن بقعة الأشعة فوق البنفسجية لتجنب التفاعل البصري للشعاع تشريح مع التحقيق المحاصرين، التي يمكن أن تؤثر تلقاء البراونية وتغيير آثار الطيفي قوة.
- بعد تحديد الموضع الجديد بقعة الأشعة تحت الحمراء فيما يتعلق بقعة الأشعة فوق البنفسجية وموقف اكسون، حرك مرحلة لوضع المحاصرين حبة بعيدا عن محور عصبي وتجنب الاصطدام معها. تحريك الموقف المحوري للمحاصرين حبة إلى حوالي 2 ميكرومتر فوق الغطاء الزجاجي.
- محاذاة QPD إلى مركز هامش تدخل عليه: x و y QPD الإشارات التفاضلية هي الأصفار عندما يتم توسيط QPD. الحصول على 5 ثانية من الحركة البراونية من المحاصرين حبة من interferoمتر، عند 50 كيلوهرتز معدل أخذ العينات. الحصول على صلابة (PN / نانومتر) والحساسية (V / نانومتر) من فخ البصرية من خلال طريقة طيف الطاقة 18.
6. نعلق الخرزة لاكسون. أداء قياس قوة Axotomy ومتزامنة
- رفع موقف حبة مفخخة حوالي 4 ميكرون فوق الغطاء الزجاجي، ونقله إلى موقف المرحلة التي تم حفظها سابقا (انظر الخطوة 3.2).
- نقل إلى أسفل حبة المحاصرين نحو محور عصبي حتى إنها تجري اتصالات مع محوار. ويتم رصد الاصطدام بين حبة المحاصرين ومحور عصبي من قبل Z QPD إشارة الكشف عن تشريد المحاصرين حبة في الاتجاه المحوري.
- انتظر 10 ثانية مع حبة المحاصرين دفعت ضد محور عصبي لصالح انضمامها إلى الغشاء محوار.
- نقل المرحلة الدقيقة لتهجير المحاصرين حبة من محور عصبي، وبالتالي تحقق الالتصاق به لغشاء الخلية. إذا كانت حبة الالتزام، فإنه يهرب من فخ البصرية.
- نقل مرة أخرى في فخ الليزر على حبة الالتزاموالتبديل على الحلقة قوة المشبك مع حالة قوة مساوية للصفر. في مثل هذه الطريقة، وتتأهب بيزو مرحلة حبة، تعلق على الخلية، على مركز فخ البصرية. إذا لم يكن لديك نظام لمراقبة رد الفعل، والموقف فخ يزر يمكن أن تكون انتقلت من مرحلة المجهر لمركز تقنية المعلومات على تحقيق الالتزام. يتم الوصول إلى مركز من فخ عند الإشارات QPD هي نفسها كما هو الحال عندما يتم المحاصرين حبة وليس انضمت إلى خلية (x و y QPD إشارات تساوي الصفر، وإشارة Z QPD يعطي مجموع الجهد نفسه من الأرباع الأربعة كما هو الحال عندما يتم المحاصرين حبة بعيدا عن أي سطح).
- تعيين حالة قوة المشبك على محور Z، وتحديد المواقع الليزر محاصرة ما يزيد قليلا عن وسط حبة (حوالي 100 نانومتر)، لتوليد ادعاء على الالتزام التحقيق المحاصرين. في حالة عدم تجهيز نظام مع جهاز تحكم عن القوة، المشبك، موقف فخ البصرية يمكن أن تثار حتى في الخطوات من 25 نانومتر بواسطة المسرح المجهر. وQPD إشارة Z يسمح الرصد. ولذلك، استخدم ثيS الإشارة لضبط الموقف من فخ الليزر فيما يتعلق مسبار الالتزام. ثمة حاجة إلى مثل التوتر قبل لاستشعار الضغط على الغشاء بعد الآفة محور عصبي، وما يترتب عليه من انخفاض الحركة البراونية لجنة التحقيق الالتزام. وقد اقترح اتباع نهج مماثل لقياس الافراج عن التوتر في حبل الغشاء عن طريق الفيديو التصوير 19.
- التحول من ردود الفعل قوة المشبك لقياس القوة على تحقيق الالتزام في حالة وضع المشبك (يتم حظر المرحلة بيزو).
- بدء التسجيل في وقت واحد من المواقف التحقيق المحاصرين من خلال تداخل (20 تردد أخذ العينات كيلو هرتز)، والخلية خلال الليزر axotomy الوقت الفاصل بين التصوير مشرق الميدان (20 هرتز معدل الإطار).
- بدوره على الليزر الأشعة فوق البنفسجية لتسليم نبضات الليزر حتى يصبح آفة مرئية على صورة من محور عصبي (وعادة ما يحتاج 200-400 نبضات ضوئية الطاقة لكل والنبض: 25 NJ)، ثم إيقاف تشغيل الليزر الأشعة فوق البنفسجية.
- يستمر التسجيل عن طريق تداخل لمدة 3 ميلن، حتى X و Y و Z آثار QPD التوصل إلى الهضبة.
7. قياس مجموع الافراج عن التوتر
- تحويل آثار QPD المسجلة (في فولت) من قبل حساسية معايرة من فخ البصرية، للحصول على آثار منها في نانومتر.
- تحديد X، Y، Z وآثار التهجير من قبل مرشح تمرير عال مع قطع في 10 هرتز.
- حساب التباين الكلي من آثار تصفيتها تمثل الحركة البراونية من حبة المحاصرين. حساب التباين في 25 خطوات ميللي ثانية للتداخل النوافذ وقت 500 ميللي ثانية (10،000 نقاط البيانات) 20. لتمريرة عالية تصفية آثار يستثني التغيرات في الحركة البراونية بسبب تذبذب غشاء أو حركة الأكتين القشرية. يتم تقليل الحركة البراونية من حبة من قبل قوات البصرية وقوات التصاق على غشاء الخلية. عند توتر الغشاء بسبب الإفراج عن التوتر هو زيادة اللزوجة، وبالتالي فإن الحركة البراونية للحبة، الكشف عن immediالمبتلة تماما بعد axotomy، ويبدأ في الانخفاض.
- تحديد T0: بداية انخفاض التباين الحركة البراونية، بعد تسليم الطاقة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. وT0 فورية الوقت يدل على بداية سلالة الغشاء.
- تعريف T1: نهاية انخفاضا من التباين الحركة البراونية (عندما تصل إلى الهضبة). وT1 فورية الوقت يشير إلى نهاية سلالة الغشاء.
- أداء تتبع الفيديو من الحطام أو خدش على دعم الغطاء الزجاجي، لقياس أي انحراف في العينة خلال قياس قوة. لتتبع الجسيمات على دعم الزجاج، ونحن أول تطبيق عتبات الي صور زاهية الميدان، للحصول على كومة من صور ثنائية مع الجسيمات باللون الأبيض على خلفية سوداء. ثم، ونحن تتبع مركز الجسيمات الكتلة مع دقة الفرعي بكسل (باستخدام برنامج ImageJ مجانية).
- طرح الانجراف تقاس من آثار QPD النزوح. مضاعفة آثار QPD مصحح الانجراف من قبل صلابة البصرية معايرة منها (ك س، ك
- حساب تتبع القوة الكلية كما F TOT = √ (FX 2 + 2 + السنة المالية FZ 2).
- حساب الإفراج مجموع القوة بين T0 و T1 كما صدر F = F TOT (T1) - F TOT (T0). القوة تقاس في T0 لابد من طرح لأنه يرجع إلى النزوح من لجنة التحقيق من وسط فخ، عندما تلتزم حبة إلى محوار.
- حساب مساحة الاتصال محوار بين حبة المحاصرين والأشعة فوق البنفسجية موقف بقعة الليزر: على مقياس صورة مشرقة الحقل طويل (L) وقصيرة محاور (D) من محوار بين حبة المحاصرين والأشعة فوق البنفسجية موقف بقعة الليزر. منطقة الاتصال محوار هو محور عصبي = L X D.
- تطبيع مجموع F القوة صدر صدر عن منطقة الاتصال محوار محور عصبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخلية يولد قوات الجر على الركيزة التي كتبها الالتصاقات البؤرية لها. القوة المتولدة من قبل عناصر هيكل الخلية هي في حالة توازن مع القوة مواجهة الركيزة الثقافة. بعد الليزر التي يسببها آفة من محوار، تتعطل بعض من الكابلات الهيكل الخلوي المتوترة ويتم تحريرها التوتر على معايرتها لأنه يتم القضاء على قوة معارضة للالتصاق الركيزة. يتم توزيع التوتر صدر جزئيا على الالتصاقات البؤرية لم تتأثر، والخرزة التي تعلق على غشاء الخلية، الذي عقد في فخ البصرية، ويقيس جزء من هذا الافراج لا تصدى من قبل عناصر هيكل الخلية ترسيخ الخلية إلى الركيزة (انظر الشكل التخطيطي 1) .
ونحن التقرير، في الشكل 2، نتيجة ممثل بروتوكول التجريبية المبين أعلاه. الخلايا العصبية، في الشكل 2A اللوحة اليسرى، ويعرض لفترة أطول محوار، والذي يعرف محوار من غير تمييزEURON. في الشكل اللوحة اليمنى 2A، يظهر نفس الخلايا العصبية بعد الآفة محور عصبي يسببها (المشار إليها بواسطة السهم الأبيض). يبين الشكل 2B وسجلت آثار النزوح حبة في X، Y، Z والاتجاهات. الشكل 2C تقارير تتبع الفيديو من الصفر على دعم الزجاج، على أن تأخذ في الاعتبار، والقضاء على الانحراف مرحلة أثناء عملية القياس.
في الشكل 3A، على يسار اللوحة، نقدم لك مجموعة من محوار lesioned، والخط الأبيض المنبع موقع الآفة، حيث نقوم بحساب مخطاط التموج من القطر محوار خلال قياس الافراج عن التوتر. على لوحة الحق هو مخطاط التموج، والتي تبين كيف أن قطر محوار يزيد قليلا على الفور بعد الآفة، ومن ثم يصبح أرق بسبب الافراج عن التوتر تجاه سوما الخلية. في الشكل 3B، ونحن كميا نتيجة مخطاط التموج. يظهر محوار أكثر إشراقا فيما يتعلق الخلفية منذ أن وضعه على عطاحبة جنة التعليم العالي في وسط التركيز على الهدف، وبالتالي فإن محور عصبي قليلا من التركيز. في الواقع، عن طريق الإبلاغ عن مجموع شدة بكسل على طول الخط مخطاط التموج في كل إطار من تسجيل الفيديو في الوقت الفاصل بين، ونحن الحصول على تقدير من القطر محوار خلال الافراج عن التوتر. على لوحة 3C، ونحن التقرير التباين الكلي للحبة المرفقة خلال الافراج عن التوتر، وتحسب على أساس آثار التي سجلتها تداخل (في الشكل 2B) بعد تصفية تمريرة عالية في 10 هرتز تردد قطع. يمكننا أن نلاحظ أن الفرق يزيد مع القطر محوار خلال تراكم المواد المنبع من موقع الآفة. ثم، يبدأ التباين في الانخفاض (في T0 في الشكل 3C) عند توتر الغشاء، وقطر محوار يقلل أيضا. انخفاض التباين تصل إلى الهضبة (في T1 في الشكل 3C)، عندما يتوقف إطلاق سراح التوتر. بعد T1، تبدأ الحركة البراونية لزيادة لأنمن الاسترخاء غشاء ربما بسبب إيماس 21 (انظر الشكل 3C).
في الشكل 4A، مربع أبيض يدل على تقدير من منطقة الاتصال محوار محور عصبي مع دعم الثقافة. يتم احتساب محوار بين الأشعة فوق البنفسجية موقف بقعة الليزر ومركز لجنة التحقيق المحاصرين. الشكل 4B تقارير التتبع السعة من إجمالي قوة F صدر صدر بعد الحصول على ضرب آثار النزوح QPD-تصحيح الانحراف (في الشكل 2B) من قبل كل معايرة صلابة فخ البصرية (ك س، ك ص، ك ض). نحسب الفرق بين القوة تقاس في وقت T1 وT0 (ΔpN في الشكل 4B)، ثم نقسم بواسطة محور عصبي، للحصول على التوتر الذي صدر في شروط PN / 2 ميكرون.
من خلال تكرار نفس البروتوكول على الخلايا العصبية المختلفة في العينة، يمكن أن نبدأدورات من التجارب على عدة ثقافات تعامل مع العوامل الكيميائية أو المطلية على دعامات مختلفة، وأخيرا مقارنة متوسط قيمة تم الحصول عليها في ظروف تجريبية متميزة. في الشكل (5)، وتبين لنا هو أضعف الافراج عن التوتر بعد الآفة محور عصبي من قبل الالتصاقات البؤرية على الركيزة، مما يعني ارتفاع قيمة التوتر الإفراج محور عصبي أقل انضمت إلى الركيزة. لأننا لحث على جزئية، وغير كاملة، آفة من محور عصبي، ونحن التحقيق في الاعتماد على الافراج عن التوتر يقاس على مجموع الطاقة تسليمها، وعلى منطقة الاتصال بين محوار موقع الآفة والمحاصرين حبة. سعينا إلى تدمير أكثر العناصر هيكل الخلية من خلال توفير عدد أكبر من نبضات الضوء، وبالتالي تحفز على الافراج أعلى من التوتر. خلاف ذلك، مع زيادة مساحة الاتصال محوار، كنا نتوقع لقياس كمية أقل من الافراج عن التوتر. في الشكل (5)، وتبين لنا أن الاعتماد على اثنين من المعلمات المذكورة أعلاهليس واضحا. ولذلك، فإننا نستنتج أن الآفة الجزئي الناجم عن (مع انخفاض الطاقة معايرة سابقا في النبضة؛ انظر البروتوكول الخطوة 4.5)، ويرتبط إلى البعد من البقعة الاجتثاث 8، والتي لا تختلف عند استخدام الهدف المجهر ونفس الطاقة في النبضة في العينة. وعلاوة على ذلك، فإن حقيقة أن الافراج عن التوتر لا يرتبط إلى منطقة التماس ليس من المستغرب لأنه من المعروف جيدا أن هذه المعالم لا تمثل تقدير جيد من التصاق الخلية إلى الركيزة، كما الالتصاقات البؤرية تحتل 1٪ فقط من سطح بصل 22.
الشكل 1. تمثيل رسومي للتوازن الهيكل الخلوي تعطلت خلال الليزر axotomy. خلية تلتزم ركيزة بواسطة الالتصاقات البؤرية. الأزرق السهام قpecify قوات الجر التي تم إنشاؤها بواسطة عناصر هيكل الخلية (المشار إليها بواسطة الينابيع). السهام ضوء أزرق يشير إلى القوات التي تولدها مواجهة الركيزة ثقافة جامدة. في سيناريو مبسط، قبل الآفة، يتم إقران قوات هيكل الخلية والركيزة ومعايرتها. بعد الآفة الليزر التي يسببها للمحوار، تتعطل وصلات بين بعض الينابيع والركيزة. وهكذا، فإن الركيزة لم يعد التصدي لقوة الجر للعنصر cytoskletal. المحاصرين حبة، تعلق على غشاء، ويتتبع اتجاه قوات الهيكل الخلوي الافراج عنهم.
الشكل 2. تتبع التداخل من المحاصرين حبة، تعلق على غشاء من محور عصبي من إحدى الخلايا العصبية الحصين خلال الليزر التي يسببها الآفة. A (أ) حقل مشرق الصور المكتسبة خلال الاجتثاث من محور عصبي. قبل الآفة على اللوحة اليسرى. بعد الآفة على اللوحة اليمنى. وترد المغلفة حبة بولي-D-يسين لغشاء (polystirene حبة، O 4 ميكرون) والتي عقدت في فخ البصرية. متوسط القوة ليزر الأشعة تحت الحمراء في العينة هو 14 ميغاواط. أبيض السهم يشير إلى موقع الآفة. شريط هو 5 ميكرون. (ب) آثار المسجلة من قبل الظهر التنسيق التداخل الطائرة من وضع حبة في فخ البصرية. وتمثل آثار الأزرق والأخضر والأحمر موقف حبة على طول X، Y، Z والفؤوس، على التوالي. معدل أخذ العينات هو 20 كيلو هرتز. (ج) الإزاحة من نقطة الصفر على دعم ثقافة تقاس من خلال تتبع الفيديو لمراقبة الانجراف المرحلة. آثار الزرقاء والخضراء هي x و y المواقف التي تم الحصول عليها من خلال تتبع الفيديو. معدل الإطار هو 5.5 هرتز.
77fig3.jpg "/>
الشكل (3). تحليل قطر اكسون خلال الافراج عن التوتر، وإجهاد غشاء المحوار lesioned. (أ) صورة حقل مشرق من محور عصبي lesioned، على اللوحة اليسرى. عمودي خط أبيض إلى محوار يشير إلى موقف حيث يتم حساب مخطاط التموج. في اللوحة اليمنى، مخطاط التموج من قطر اكسون، المنبع من موقع الآفة. كل صف من مخطاط التموج يتوافق مع 0.18 ثانية. (ب) مجموع شدة بكسل من كل صف من مخطاط التموج تمثل تقديرا لقطر اكسون خلال الافراج عن التوتر. (ج) التباين الكلي من الحركة البراونية من حبة تعلق على محوار (T0 و T1 تشير على التوالي بداية ونهاية الافراج عن التوتر في محور عصبي بعد تشريح).
0477/50477fig4.jpg "/>
الشكل 4. الكمي من التوتر أفرج عنه بعد axotomy. (أ) صورة حقل مشرق من محور عصبي lesioned. المربع الأبيض يشير إلى تقدير للمنطقة التماس محوار بين موقع الآفة ووسط حبة المحاصرين. (ب) تتبع من السعة الإجمالية للقوة المقاسة بعد axotomy (F TOT = √ (FX 2 + 2 + السنة المالية FZ 2)). FX، تم حساب السنة المالية، وFZ بواسطة قانون هوك (F = KX)، حيث آثار النزوح هي تلك التي تظهر في الشكل 2B. حسبت التصلب، في الاتجاهات المتعامدة الثلاثة، من فخ البصرية من خلال طريقة طيف الطاقة (ك X، Y = 7.9 PN / ميكرون، ك ض = 2.3 PN / ميكرون). ΔpN يدل على قوة صدر المقاسة بين الوقت اللحظات T0 و T1.
الشكل 5. اعتماد الافراج عن التوتر يقاس على كمية الطاقة تسليمها إلى عينة، وعلى منطقة الاتصال محوار. البيانات من 26 من التجارب التي تجرى على محاور عصبية من الخلايا العصبية hippocamapal الماوس في 3 DIV. (أ) مؤامرة مبعثر من الافراج عن التوتر مقابل منطقة الاتصال محوار بين المواقع حبة الآفة والمحاصرين. (ب) مؤامرة مبعثر من الافراج عن التوتر مقابل المبلغ الإجمالي للطاقة تسليمها إلى عينة منطقة الاتصال محوار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نفيدكم في هذا العمل أسلوب كمي لمقارنة التصاق محوار إلى الركيزة ثقافة، في وقت واحد عن طريق إجراء القياس الطيفي قوة الليزر خلال الناجم عن آفة الخلية. ويرتبط الإفراج قياس التوتر لدرجة التصاق الخلية إلى الركيزة: يجب أن الخلايا تحتوي على عدد أكبر من الالتصاقات البؤرية الافراج أقل توترا. قياس الافراج عن التوتر في شروط piconewtons يوفر الكمية الفعلية التي يمكن من خلالها تقييم التصاق محور عصبي لدعم الثقافة في ظروف تجريبية مختلفة 14.
عدة مختبرات متكاملة لمشرح الليزر مع نظام الملاقط البصرية، واعتماد التصاميم البصرية متميزة 23. كان خيارنا الإعداد مع مسار بصري الثابتة والمجهر مرحلة الحركة. لإنجاز هذا، ونحن نقدم المغير ضوء المكاني في مسار شعاع الليزر الأشعة تحت الحمراء لنقل بقعة محاصرة فيما يتعلق موقف ليزر الأشعة فوق البنفسجية. على الرغم من galvanometrالمرايا IC تسمح توجيه موقف تركيز الليزر دون تحريك العينة، فإنها يمكن أن أعرض الضوضاء الميكانيكية في النظام التي تؤثر على قياسات التحليل الطيفي قوة. وعلاوة على ذلك، قررنا إعادة الموقف التركيز يزر الأشعة تحت الحمراء في العينة، منذ تحليل الحركة البراونية يسمح بسرعة إعادة معايرة لصلابة البصرية. يمكن تحريك الأشعة فوق البنفسجية موقف بقعة الليزر على عينة إنتاج الانحرافات كروية تؤثر على نوعية بقعة التركيز الأشعة فوق البنفسجية نفسها، التي تكاد لا تذكر فقط لنزوح صغير من الحزم من موقعها المركزي. ولذلك، يمكن تعديل الخصائص البصرية للمشرح ليزر تتطلب دي نوفو معايرة قوة الليزر تسليمها مقابل الأضرار التي لحقت الكيان.
بواسطة القياس الطيفي قوة، ونحن يمكن أن نلاحظ أن إطلاق سراح التوتر ويتكون من مرحلة سريعة من بضع ثوان، ومرحلة البطيء الذي قد يستمر بعض عشرات الثواني. كما ورد في العمل السابق 14، وأحيانا بطيئةالمرحلة يمكن أن تستمر لبضع دقائق. لهذا السبب، كان لدينا لتصحيح قياس القوة عن طريق الفيديو تتبع الصفر على دعم الثقافة. في المستقبل، سوف يكون أفضل نهج لإلغاء مرحلة الانجراف مع حلقة التغذية المرتدة، والتي لصناعة السيارات في بتصحيح الموقف مرحلة المجهر عن طريق الفيديو أو تتبع التداخل من حبة تعلق على غطاء زجاجي. هذا النوع من التكوين، وسبق أن ذكرت في الأدب، يتطلب شعاع الليزر الثاني تركزت على حبة المرفقة، ويضمن استقرار مرحلة بدقة نانومتر الفرعية 24،25.
في المستقبل، ونحن نريد أن يطبق البروتوكول وضعت لمقارنة التصاق محور عصبي لدعم الثقافة في مراحل مختلفة من التمايز وفي الحالات المرضية المختلفة لتوفير الفحص الكمي للعلاج الدوائي. وعلاوة على ذلك، يمكن للبروتوكول ذاته ينطبق على تصميم السقالات تزرع في الجسم، لمقارنة التصاق الخلايا العصبية لأنواع مختلفة من المواد مع الميكانيكية متميزةanical أو الخصائص الكيميائية 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
البرتو Guiggiani لتطوير نظام مراقبة الوقت الحقيقي، إيفيلينا Chieregatti وهانكو تسوشيما للمناقشات بصيرة، جياكومو Pruzzo واليساندرو بارودي لتطوير الالكترونيات والبرمجيات المخصصة، وكلوديا Chiabrera ومارينا ناني عن مشورة الخبراء والمساعدة في إعداد ثقافة الخلية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | Hamamatsu | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop | ||
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O'Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M.
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
