Summary
Vi mätte spänningen release i en axon som var delvis lesion med en laser dissektorn genom samtidig kraft spektroskopi mätningen utförd på en optiskt-fångade proben fäst till membranet av axonet. Den utvecklade experimentella protokollet utvärderar axonet vidhäftning till odlingssubstratet.
Abstract
Bildandet av funktionella anslutningar i en utvecklande neuronala nätverket påverkas av yttre signaler. Den neurite tillväxten i utvecklingsländerna neuroner är föremål för kemiska och mekaniska signaler, samt de mekanismer genom vilka den känner och reagerar på mekaniska signaler förstås dåligt. Belysa betydelsen av styrkorna i cellmognad möjliggör konstruktion av byggnadsställningar som kan främja celladhesion och cytoskelettala koppling till underlaget, och därmed förbättra kapaciteten hos olika neuronala typer att regenerera efter skada.
Här beskriver vi en metod för att tillämpa samtidiga mätningar kraft spektroskopi under laserinducerad cell lesion. Vi mäter spänningen frisättning i den delvis skadade axon genom samtidig interferometrisk spårning av ett optiskt fångade sond fäst vid membranet av axonet. Vår experimentella protokollet detekterar spänningsutlösning med piconewton känslighet och dynamik av spänningen frigivning vidmillisekund tidsupplösning. Därför erbjuder den en hög upplösning metod för att studera hur den mekaniska kopplingen mellan celler och substrat kan moduleras genom farmakologisk behandling och / eller av distinkta mekaniska egenskaperna hos substratet.
Introduction
Optisk mikroskopi är en av de mindre invasiva avbildningssystemet tillgänglig för att observera levande celler. Med utnyttjande av effekter såsom strålning tryck (som vid optisk pincett 1), eller hög energi fotonflöde (som i laser dissekeraren 2), var denna teknik utvidgades till nano-manipulation. Den optiska bildsystem möblerar en noggrann kontroll för att visualisera och manipulera sub cellulära mål 3. Samtidigt, tack vare noggrann kalibrering av levererad laser makt, optiska verktyg åstadkomma antingen mjuka eller invasiva prov manipulation med oöverträffad reproducerbarhet.
Flera laboratorier integrerade, i samma experimentuppställning, optisk pincett och laser dissekeraren i syfte att avlägsna organeller 4, att smälta samman olika celler 5, eller för att stimulera celler genom optiskt driven last 6,7. Medan optisk pincett, efter kalibrering av den optiska styvhet, möjliggörakontroll av applicerad kraft till cellen på ett piconewton skala, kan laser dissektion system modulerar optisk manipulation, som sträcker sig från membranet foto-poration till ablation av enskilda organeller eller dissektion av sub-cellulära strukturer. Men förlitar laser dissektion kalibrering på kvalitativ bedömning av den enhet av optisk manipulation i förhållande till den energi som levereras till provet, främst baserad på bildanalys visar morfologiska förändringar orsakade den förlaga 8. I den presenterade metoden, visar vi hur du utför kraft spektroskopi mätningar under lasern axonal dissektion av en utveckling neuron, att kvantifiera, på piconewton skala, den kraft som produceras av en förändrad balans i cytoskeletonen strukturen av en sub-mobilfack 9. Odlade neuroner vidhäfta till substratet, och polarisera under utvecklingen. Polariseringen fasen inträffar under de första fem dagarna i vitro. I steg två av polarisering, en av extruding neurites blir längre, och det kommer att differentiera bli axonet 10. Axonal töjning som svar på dragkraften på tillväxten konen tidigare har modellerats av Dennerl modell 11. Nyligen har denna modell utvidgats 12 till att omfatta den roll neurite vidhäftning till de extracellulära matrissubstrat. Denna biofysiska modell föreslog efter experimentella observationer 13, visade att dragkrafter på tillväxt kon, som utbreder sig längs den neurite, moduleras av fokala kontakter på substratet. Likaså producerar axonal skada en lokal frisättning av spänning utbreder mot cellen kroppen. Därför föreslog vi att mäta sådan släpps spänningen i ett läge längs axonet mellan lesionen och cellen soma erbjuder möjligheten att bedöma den dämpande resultatet av opåverkade fokala kontakter.
Vi kalibrerar den nödvändiga energin photon-flux av laser dissektorn styra omfattningen av den tillfogade axonal damage, från komplett transection till partiell skada. Efter kalibrering, upprepade vi partiell lesion till axoner av flera differentierande neuroner och utvecklat protokoll för att kvantifiera spänningsutlösning, och sålunda erhållna en kvantitativ parameter för att uppskatta vidhäftningen av axonet till substratet 14.
I föreliggande arbete, beskriver vi i detalj utvecklade protokollet, vilket utgör en exakt experimentella förfarande för att utvärdera och jämföra med piconewton känslighet axonal vidhäftning i olika experimentella betingelser såsom kemisk behandling 14, eller olika typer av cellodling stöd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Optisk Setup
Hela optiska systemet beskrevs tidigare 15. Kortfattat är det optiska pincett system baserat på en ytterbium kontinuerlig våg (CW)-fiber laser som arbetar vid 1064 nm (IPG Laser GmbH). En spatial Ijusmodulator (SLM) (LCOS-SLM, modell X10468-07 - Hamamatsu) varierar fasen för den inkommande IR-laserstrålen att styra läget av det fångande fokus plats på odlingsskålen genom datorgenererade hologram. De fritt tillgängliga Blue-pincetter programvara (webblänk på utrustning tabell) genererade hologram projiceras på den spatiala Ijusmodulatorn. Interferometern för force spektroskopi mätningar grundade sig på en fyra-kvadranten fotodiod (QPD, S5980 med C5460SPL 6041 board - Hamamatsu) och en fotodiod (PD, PDA100A-EC - Thorlabs).
Lasern dissektion källan var en pulsad sub-nanosekund UV Nd: YAG-laser vid 355 nm (PNV-001.525 till 040, PowerChip nano-Pulse UV laser - Teem Photonics). En akustisk-optisk modulator (MQ110-A3-UV, 355 nm kvartsglas-AA-Opto-elektronisk) kontrollerade kraften i UV-laser levereras till provet.
Den holografiska optiska pincetter och laser mikro-dissektorn integrerades på en modifierad upprätt mikroskop (BX51 - Olympus) utrustad med en 60X, 0,9 NA vatten doppa objective.The skede av mikroskop består av en 3-axlig linjär likströmsmotor mikro-positionering systemet (M-126.CG1, Fysik-Instruments) som bär en separat 3-axlig piezoelektriska nano-positionering skede (P-733.3DD, Fysik-instrument) för att kombinera grova rörelse av provet med sub-nanometer upplösning av piezo- skede. Mikroskopet scensystemet var utrustad med två regleringskretsar synergistiskt agerar för att upprätthålla fångst fokus plats vid rätt position, beroende på valt arbetsläge (position eller force klämma, statiskt eller dynamiskt) 16. I synnerhet ska sådana en inre återkopplingsslinga på ett piezoelektriskt scen, för att hålla vulsten på en utvalded avstånd från fällan centrum. Den andra externa slingan styr läget för den motoriserade scenen för att exploatera området korsas av piezo-ställdonet på ett större område än det tillgängliga slaglängd 17. När den piezo-stadiet når gränsen för den tillgängliga slaglängd i en riktning, rör sig den yttre slingan mikro skede i motsatt riktning, sålunda den piezo återhämtar mot dess centrala läge eftersom det spårar det fångade vulsten vidhäftade till provet. När piezo-scenen når den centrala positionen av sitt lopp område, stoppade mikro scenen. Ytterligare detaljer hos systemet redovisas i Guiggiani et al 16,17.
En Peltier-anordning (QE1 resistiv uppvärmning med TC-344B tvåkanalig uppvarmningsstyrenheten - Warner Instruments) styr temperaturen hos cellkulturen under mikroskop (37 ° C). I kulturen, pH och fuktighet bibehålls vid fysiologiska förhållanden genom luftning ett skräddarsytt polydimetylsiloxan (PDMS) hylsa (integrera mikroskopobjektivet) med fuktad karbogen (95% O2, 5% CO2).
2. Cell Culture Framställning
Alla de experimentella protokoll godkändes av det italienska hälsoministeriet. Primära kulturer erhölls från hippocampi av möss (C57BL6J, Charles River) på embryonala dag 18 (E18).
- Neuroner ströks ut med en koncentration på 25.000 celler / ml på glasbottnade petriskålar (P35G-0-14-C - Matek Corporation). Den låga koncentrationen av odlade celler behövs för att undvika bildandet av ett tätt nätverk redan under de första dagarna in vitro. Vid den nämnda cell koncentrationen, är sannolikheten för att hitta isolerade celler med en längre neurite inte ansluten till andra celler mycket högre.
Tre. Bead Beläggning
- Polymermikrosfärer (Ø 4 pm, COOH-upp-Bangs laboratorier, produktkod PC05N/6700) belades med poly-D-lysin enligt det förfarande som beskrivs i polyLink proteinkoppling Kit (Polysciences, produktkod 19539). Pärlorna är belagda med samma molekyl som används för att täcka den kultur stöd och celler favör vidhäftning.
4. Välj Isolerad Neuron. Lossa en pärla från odlingssubstratet, Trap och flytta det Bredvid Neuron
- Sätt kultur petriskål på mikroskop scenen. Efter inställning av fokus på provet genom scenen rörelse, korrigera positionen på den lysande målet kondensorn att ställa Kohler-belysning. Rikta belysningsoptiken att ställa Kolher-belysning villkoret är nödvändigt för att förbättra den ljusa kvalitetsområdet avbildning. Använda sådan anpassning förhållanden, är det också nödvändigt att maximera IR effektivitet laser samling (genom objektiv kondensor), från den instängda spridning sonden, för att utföra sin interferometrisk spårning av QPD och PD.
- Pipettera några il av den belagda mikrosfär förrådslösning itill odlingsskålen. Mikrosfärer kommer in och hålla sig till kulturen substratet. Antalet il injiceras i odlingsskålen beror på mikrosfären koncentration av stamlösningen. Det ideala tillståndet är att ha mellan en och två mikrosfärer per avbildning synfält. När alltför många mikrosfärer sätts till odlingsskålen, kan de fäster redan slumpmässigt till de odlade nervceller.
- Flytta runt i kulturen skålen, söker efter en isolerad neuron med en längre neurite (axonet), och sparar positionen för mikroskop scenen.
- Flytta runt och söka efter en sträng fäst vid kulturen stöd.
- Slå på IR fällor laser. I detta skede, inga hologram projiceras på SLM, och läget för IR laserpunkten sammanfaller med UV-laser spot position. Ställ in det axiella läget för IR-spot 2-3 um ovanför kultur stödyta, genom mikroskop scenen rörelse.
- Ställ in UV-laser effekt som levereras till provet till mindre än 1 pW. DenUV laser dissekeraren tidigare har kalibrerats 14:
5-6 pW glaset stöd ablateras
4 pW en neuronal förbindelse är helt dissekeras
2,5 pW en neurite delvis lesion
<1 ^ W en chockvåg alstras i odlingsskålen. Den optiska stötvågen är tillräckligt stark för att lösgöra vulsten från glaset stöd. - Sätt på UV-laser, men låter IR-laser på, och flytta UV-fläck ovanför den vidhäftade vulsten genom mikroskop scenen rörelse. De pärla lossnar från ytan, och den är fångad av IR-laser. Stäng sedan av UV-laser.
- Flytta de fångade pärla flera mikrometer ovanför glaset stöd (20-30 um). Lyftning av pärla för att denna position kommer att hindra den från att kontakta andra celler medan den förflyttas mot den tidigare valda neuron. Ta pärlan till den tidigare sparade scenen position. Ställ scenen hastighet till ett lågt värde (10 um / sek) så dra fluidkraft inte överskrider den optiska fällanping kraft.
Fem. Flytta Trap ståndpunkten rörande Laser dissektorkomponenten Spot och Axon ståndpunkt av Computer Generated Hologram och Kalibrera den optiska pincetten Stiffness
- Flytta pärlan mot glaset stöd för att visualisera axonet. Vulsten hålls ovanför cellen för att undvika kontakt med det (ca 5 ^ m över glaset stöd).
- Flytta mikroskop scenen för att flytta UV fokus plats på mitten av bredden av axonet. Spara den aktuella scenen positionen.
- Flytta IR positionen fokus plats av datorgenererade hologram. I detta steg är det stadium stoppas i det läge som valts i föregående steg. När datorn genererade hologrammet projiceras på SLM, är infångade pärlan förflyttas i förhållande till axonet. Vi flyttar IR laser plats att ha de fångade pärlan linje på mitten av neurite, med UV laserpunkten centrerad på samma neurite också. IR-spot och därmed den instängda pärlan är placerade längs neurite5-10 um bort från UV-fläck. Vi flyttar positionen för IR med avseende på UV-fläck beroende på neurite geometrin. Om den optiska pincetten inte är utrustade med en SLM-system kan positionen varieras genom att luta speglar, eller akustiska optiska deflektorer, på IR optiska banan. IR laserpunkt kan placeras 5-10 um bort från UV plats för att undvika optiska interaktionen mellan dissekera strålen med fångade sonden, vilket skulle kunna påverka dess Brownsk rörelse och ändra spår kraft spektroskopi.
- Efter att definiera nya IR-spot position med avseende på UV-fläck och axon läge, flytta scenen för att positionera det fångade pärlan bort från axon och undvika kollision med det. Flytta den axiella positionen för den instängda vulsten till ca 2 | im ovanför täckglaset.
- Rikta QPD att centrera interferensfransar på det: x och y QPD differentialsignaler är nollor när QPD är centrerad. Förvärva 5 sek av Brownsk rörelse fångade pärlan av interferomätare, vid 50 kHz samplingsfrekvens. Erhåll styvheten (pN / nm) och känslighet (V / nm) av den optiska fällan genom effektspektrumet metod 18.
6. Fäst Bead till Axon. Utför Axotomy och samtidig Force Measurement
- Höj fångade pärla positionen ca 4 um ovanför täckglaset, och flytta den till den tidigare sparade scenen läge (se steg 3.2).
- Flytta fångade pärlan ner mot axonet tills den kommer i kontakt med neurit. Kollisionen mellan den instängda pärla och axonet övervakas av z QPD signaldetekterande förskjutning av fångade vulsten i den axiella riktningen.
- Vänta 10 sekunder med den instängda pärlan sköt mot axonet att gynna sin vidhäftning till neurite membranet.
- Flytta mikro scenen för att förskjuta den instängda vulsten från axonet, och sålunda kontrollera dess vidhäftning till cellmembranet. Om vulsten vidhäftade, undgår den från den optiska fällan.
- Flytta tillbaka lasern fälla den vidhäftade pärlanoch slå på kraft-klämman slinga med kraft villkoret lika med noll. På ett sådant sätt, de piezo-arrangerar omplacerar den pärla, som anbringats på cellen, på den optiska fällan centrum. Om systemet inte har en kontroll återkopplingsslinga, kan lasern fälla positionen flyttas av mikroskop scenen för att centrera den på den vidhäftade sonden. I mitten av fällan uppnås när QPD signalerna är desamma som när vulsten är instängd och inte vidhäftade till cellen (x-och y QPD signaler lika med noll, och z QPD signalen ger samma spänning summan av de fyra kvadranterna som när vulsten är fångade långt från någon yta).
- Ställ en kraft-klämma tillstånd på z-axeln, placera fånga lasern något över mitten av pärlan (ca 100 nm), för att generera en förspänning på instängd vidhäftade sonden. Om systemet inte är utrustad med en kraft-clamp kontroll, kan den optiska fällan positionen höjas upp vid steg om 25 nm med mikroskop scenen. Z QPD signal tillåter övervakning. Använd därför this signal för att ställa in positionen för lasern fälla med avseende på den vidhäftade sonden. Sådan förspänning behövs för att avkänna belastningen på membranet efter axonal lesion, och den därav följande minskningen av Brownsk rörelse av den vidhäftade sonden. Ett liknande tillvägagångssätt har föreslagits för att mäta utsläpp av spänning i ett membran tjuder av video avbildning 19.
- Switch-off kraft-klämman återkoppling för att mäta kraft den vidhäftade sonden i läge-klämman tillstånd (piezo-steget är blockerat).
- Starta samtidig inspelning av de fångade sonden positioner genom interferometer (20 KHz samplingsfrekvens), och cellen under laser axotomy tidsförlopp ljusa fält avbildning (20 Hz bildfrekvens).
- Slå på UV-laser för att leverera laserpulser tills en skada blir synlig på bilden av axonet (Vanligtvis 200-400 optiska pulser behövs energi per puls:. 25 NJ), sedan stänga av UV-laser.
- Fortsätt inspelningen av interferometer för ca 3 kmn, tills x-, y-och z QPD spår nå en platå.
7. Kvantifiera det totala frigöringsstiften
- Konvertera de inspelade QPD spår (i Volt) genom den kalibrerade känsligheten hos den optiska fällan, för att erhålla de respektive spår i nanometer.
- Filtrera x-, y-och z-spår förskjutning genom ett högpassfilter med avskurna vid 10 Hz.
- Beräkna den totala variansen av de filtrerade spår representerar Brownsk rörelse fångade pärlan. Beräkna variansen vid 25 ms steg för överlappande tidsfönster på 500 msek (10000 datapunkter) 20. Den högpassfiltrering av spår utesluter förändringar av Brownsk rörelse på grund av membranet fluktuation eller kortikala aktin rörelse. Den Brownsk rörelse hos vulsten reduceras av de optiska krafterna och de krafter vidhäftning på cellmembranet. När membranet är ansträngd på grund av utsläpp av spänning dess viskositet ökas, och sålunda den brownska rörelsen hos vulsten, detekteras omedelbart efter axotomi, börjar sjunka.
- Definiera t0: början av minskningen av Brownsk rörelse varians, efter leverans av UV-laser energi. Tiden omedelbar t0 indikerar början av membranet stammen.
- Definiera t1: slutet av minskningen av Brownsk rörelse variansen (när den når en platå). Den tidsögonblicket t1 indikerar slutet på membranets stam.
- Utför video spårning av skräp eller en repa på skyddsglas stöd, för att mäta varje förändring av provet under kraftmätningen. Att spåra partikeln på glaset stöd tillämpar vi först trösklar till de ljusa fält bilder, för att få en bunt av binära bilder med partikeln i vitt på en svart bakgrund. Sedan spårar vi partikeln masscentrum med sub-pixel precision (med hjälp av gratisprogram ImageJ programvara).
- Subtrahera uppmätt avdrift från deplacement QPD spår. Multiplicera drift-korrigerade QPD spår av kalibrerade respektive optiska styvhet (k x, k
- Beräkna den totala kraften spår som F tot = √ (Fx 2 + Fy 2 + Fz 2).
- Beräkna det totala utsläppet av våld mellan t0 och t1 som F släpps = F tot (t1) - F tot (t0). Den uppmätta kraften vid t0 måste subtraheras för att det är på grund av förskjutningen av sonden från fällan centrum, när vulsten vidhäftar till neurite.
- Beräkna neurite kontaktytan mellan fångade pärlan och UV laserfläcken läge: på ljusa fältet bilden åtgärd de långa (L) och korta (D) axlar neurite mellan fångade pärlan och UV laserpunkten position. Axonet kontaktytan är en axon = L x D.
- Normalisera den totala släppt kraften F släpptes av axonet kontaktytan A axon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellen genererar dragkrafter på substratet genom dess fokala kontakter. Kraft som genereras av cytoskelettala elementen är i jämvikt med den motverkande kraften av kulturen substratet. Efter laser inducerad skada i neurite, är några av de spända cytoskeleton kablar störs och deras jämvikt spänningen frigörs eftersom motkraft av substratadhesion elimineras. Den frigjorda spänningen delvis distribuerat på opåverkade fokala kontakter, och vulsten fäst till cellmembranet, som hölls i en optisk fälla, mäter den del av sådan frisättning inte motverkas av cytoskelettala element ankring cellen till substratet (se schematiskt figur 1) .
Vi rapporterar, i figur 2, ett representativt resultat av den ovan beskrivna försöksprotokoll. Neuron, i figur 2a vänstra panelen, presenterar en längre neurit, som identifierar axonet av differentiering nEURON. I figur 2a högra panelen, är samma neuron visas efter den inducerade axonal lesionen (indikeras av den vita pilen). Figur 2b visar de inspelade bead deplacerande spår i x-, y-och z-riktningarna. Rapporterar video spårning av en repa Figur 2c på glaset stöd, för att ta hänsyn till och eliminera scenen avdrift under mätningen.
I figur 3a, på den vänstra panelen, visar vi den skadade neurite, och den vita linjen uppströms lesionsstället, där vi beräknar kymograph av neurite diameter under spänningsutlösning mätningen. På den högra panelen är kymograph, visar hur neurite diameter något ökar omedelbart efter skadan, och sedan blir tunnare på grund av utsläpp av spänning mot cellens soma. I figur 3b, kvantifiera vi kymograph resultatet. Den neurite visas ljusare i förhållande till bakgrunden eftersom vi positionerat Attarikas pärla i fokus mitt i målet, och därför axonet är något ur fokus. Sannerligen, genom att rapportera summan av pixelintensiteter längs kymograph linjen vid varje ram av time-lapse videoinspelning, får vi en uppskattning av neurite diameter under utsättningen av spänning. På panelen 3c, vi rapporterar den totala variansen i den bifogade pärlan under spänning release, beräknat utifrån de spår som spelats in med interferometem (i figur 2b) efter högpassfiltrering vid 10 Hz gränsfrekvens. Vi kan konstatera att variansen ökar med neurite diameter vid ansamling av material uppströms lesionsstället. Sedan börjar variansen minska (vid t0 i figur 3c) när membranet är ansträngd, och neurite diametern minskar också. Variansen minskningen når en platå (vid t1 i figur 3c), när spänningen frisättningen upphör. Efter t1, börjar Brownsk rörelse att öka eftersomav membran avkoppling möjligen på grund av exocytos 21 (se figur 3c).
I fig 4a, indikerar den vita rutan uppskattningen av den neurite kontaktytan En axon med kulturen stöd. En axon beräknas mellan UV laserfläcken position och centrum av den fångade sonden. 4b rapporter amplituden spår av den frigjorda totala kraften F släpptes erhölls efter multiplicera drift-korrigerade QPD deplacement spår (i figur 2b) genom den kalibrerade respektive figur optisk fälla styvhet (k x, k y, k z). Vi beräknar skillnaden mellan kraft mäts vid tidpunkten t1 och t0 (ΔpN i figur 4b), och sedan vi dividerar med en axon, för att få spänningen frigörs i form av Pn / im 2.
Genom att upprepa samma protokoll på olika neuroner i provet, kan vi börjasessioner experiment på flera kulturer behandlas med kemiska faktorer eller klädd på olika underlag, och slutligen jämföra medelvärdet i de olika experimentella betingelser. I figur 5, visar vi lanseringen av spänningen efter axonal skada dämpas av fokala sammanväxningar på substratet, alltså en högre spänning släppvärde innebär en axon mindre anslutit sig till underlaget. Eftersom vi framkalla en partiell, och inte fullständig, skada av axonet, undersökte vi beroendet av den uppmätta spänningen släpps den den totalt levererade energin, och på neurite kontaktytan mellan lesionsstället och fångade pärlan. Vi försökte förstöra mer cytoskeletala element genom att leverera ett större antal ljuspulser, och därmed framkalla en högre frisättning av spänning. Annars, med en ökad neurite kontaktyta, förväntade vi att mäta en lägre mängd spänningar släpper. I figur 5, visar vi att beroendet av de två ovan nämnda parametrar ärinte klart. Därför härledas vi att den inducerade partiella lesionen (med den tidigare kalibrerade låg energi per puls, se protokoll steg 4,5), är relaterad till dimensionen av ablation plats 8, som inte varierar vid användning av samma mikroskopobjektivet och samma energi per puls vid provet. Dessutom är det faktum att frisättningen av spänningen inte är korrelerad till kontaktytan inte förvånande eftersom det är välkänt att dessa parametrar inte utgör en god uppskattning av celladhesion till substratet, som fokala kontakter upptar endast 1% av den basyta 22.
Figur 1. Grafisk representation av den sönderdelade cytoskelettet jämvikt under laser axotomy. En cell vidhäftar till ett substrat genom fokala kontakter. Blå pilar specify dragkrafter genereras av cytoskeletal element (anges med fjädrar). Light-blå pilar indikerar de motverkande krafter som genereras av det styva odlingssubstratet. I ett förenklat scenario, innan skadan, är cytoskelettala och substrat krafter parade och jämvikt. Efter laserinducerad lesion av neurite är anslutningarna mellan vissa fjädrar och substratet störs. Således är substratet inte längre motverkar dragkraft på den cytoskletal elementet. Den fångade pärla, fäst till membranet, spårar riktningen av de frigjorda cytoskeleton krafter.
Figur 2. Interferometrisk spårning av en instängd pärla, fäst på membranet av axonet av ett hippocampus neuron under laser-inducerad lesion. (A) Ljusfält bilder som förvärvats under ablation av ett axon. Innan skadan på den vänstra panelen. Efter skadan på den högra panelen. En poly-D-lysin belagt korn är fäst vid membranet (polystirene pärla, Ø 4 ^ m) och hålls i en optisk fälla. Medeleffekt för IR-laser på provet är 14 mW. Vita pilen indikerar lesionsstället. Bar är 5 um. (B) Inspelade spår från bakre fokalplan interferometri av pärlan position i den optiska fällan. Blått, grönt och rött spår representerar pärlan position längs x-, y-och z-axlarna, respektive. Samplingsfrekvens är 20 kHz. (C) Förskjutning av en repa på kultur stödet mätt med video spårning för att övervaka scenen drift. Blå och gröna spår är de x-och y-positionerna erhållna genom video tracking. Bildfrekvensen är 5,5 Hz.
77fig3.jpg "/>
Figur 3. Analys av axonet diameter under spänning release, och membranet stam av den skadade axonet. (A) Ljusfält bild av den skadade axon, på den vänstra panelen. Den vita linje vinkelrät mot axonet indikerar positionen där en kymograph beräknas. På den högra panelen, kymograph av axonet diameter, uppströms om skadestället. Varje rad i kymograph motsvarar 0,18 sek. (B) Summan av pixelintensiteter i varje rad av kymograph representerar en uppskattning av axonet diameter under spänningsutlösning. (C) Totalt variansen för Brownsk rörelse hos vulsten fäst vid axon (t0 och t1 ange början respektive slutet av spänning release i axonet efter dissektion).
0477/50477fig4.jpg "/>
Figur 4. Kvantifiering av spänningen släppte efter axotomy. (A) Ljusfält bild av den skadade axon. Den vita rutan visar uppskattning av neurite kontaktytan mellan lesionsstället och centrum av den fångade pärlan. (B) Spår av den totala amplituden av den kraft som uppmäts efter axotomi (F tot = √ (Fx 2 + Fy 2 + Fz 2)). Fx, Fy och Fz beräknades genom Hookes lag (F = kx), där förskjutningselementet spår är de som visas i figur 2b. De styvheter, i de tre ortogonala riktningarna, av den optiska fällan beräknades genom effektspektrumet metoden (k x, y = 7,9 Pn / im, k z = 2,3 pn / xm). ΔpN anger den uppmätta släppt kraften mellan tidpunkterna t0 och t1.
Figur 5. Beroendet av uppmätt spänning utsläpp på mängden energi som levereras till provet, och på neurite kontaktyta. Data från 26 experiment utförda på axoner av mus hippocamapal nervceller vid 3 DIV. (A) Scatter plot av spänning utsläpp kontra neurite kontaktytan mellan lesion och fångade pärla platser. (b) Scatter plot av spänning utsläpp kontra totala mängden energi som levereras till provet neurite kontaktyta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi redovisar i detta arbete en kvantitativ metod för att jämföra neurite vidhäftning till kulturen substrat, genom att utföra samtidig mätning kraft spektroskopi under laser-inducerad cell lesion. Den uppmätta utsläpp av spänningen är relaterad till graden av vidhäftning av cellen till substratet: celler med ett högre antal fokala sammanväxningar bör släppa mindre spänning. Mäta frisättningen av spänning i form av piconewtons ger en fysisk kvantitet med vilken att utvärdera axonal vidhäftning till kulturen stöd i olika experimentella förhållanden 14.
Flera laboratorier integrerat en laser dissektorn med en optisk pincett system anta olika optiska mönster 23. Vårt val var en installation med fasta optiska banan och mikroskop scenen rörelse. För att åstadkomma detta, introducerar vi en spatial Ijusmodulator i IR laserstrålens bana för att flytta det fångande plats med avseende på UV-laser position. Även galvanometric speglar kan styra positionen laser fokus utan att flytta provet, kan de införa mekaniska ljud i systemet påverkar mätningar kraft spektroskopi. Dessutom beslutade vi att åter placera IR laser fokus i urvalet, eftersom Brownsk rörelse analys möjliggör en snabb re-kalibrering av optisk styvhet. Flytta UV positionen laserfläcken på provet kan producera sfärisk aberration som påverkar kvaliteten på den UV-fokus plats själv, som är försumbara endast för små förskjutningar av strålen från dess centrala läge. Därför kan modifiering av de optiska egenskaperna hos lasern dissektorn kräva en de novo kalibrering av den avgivna lasereffekten kontra skada på enheten.
Med våld spektroskopi mätning, kan vi konstatera att spänningen frisättning består av en snabb fas av ett par sekunder, och en långsam fas som kan pågå några tiotals sekunder. Som rapporterats i tidigare arbete 14, ibland långsammafas kan pågå i några minuter. Därför var vi tvungna att korrigera kraftmätningen med video tracking en repa på kultur stöd. I framtiden skulle en bättre metod är att avbryta scenen drift med en slinga, som automatiskt korrigerar positionen mikroskop scenen med video eller interferometrisk spårning av en kula fäst vid skyddsglas. Denna typ av konfiguration, som redan rapporterats i litteraturen, kräver en andra laserstråle centrerad på den bifogade pärlan, och säkerställer scen stabilisering med sub-nanometer precision 24,25.
I framtiden vill vi att tillämpa den utvecklade protokoll för att jämföra den axonal vidhäftning till kultur stöd i olika skeden av differentiering och olika patologiska tillstånd att tillhandahålla en kvantitativ analys för farmakologisk behandling. Dessutom kan samma protokoll gäller utformningen av implanterbara byggnadsställningar, att jämföra neuronal vidhäftning till olika typer av material med distinkt mekanical eller kemiska egenskaper 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Alberto Guiggiani för att utveckla det verkliga systemet tidsstyrning, Evelina Chieregatti och Hanako Tsushima för insiktsfulla diskussioner, Giacomo Pruzzo och Alessandro Parodi för utveckling av anpassade elektronik och mjukvara, och Claudia Chiabrera och Marina Nanni för sina expertråd och hjälp i cellkultur beredning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | Hamamatsu | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop | ||
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O'Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M.
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
