Summary
我々は部分的に軸索の膜に付着した光学的に捕捉されたプローブで行わ同時力分光測定によってレーザーディセクタで損傷された軸索の緊張放出を測定した。開発された実験プロトコルは、培養基板に軸索の接着性を評価します。
Abstract
現像神経回路網内の機能的な結合の形成は、外因性の合図によって影響される。開発ニューロンの神経突起成長は化学的および機械的信号、および機械的な信号に、それは感覚や反応があまり理解されているのメカニズムに従うものとします。細胞成熟の力の役割を解明することは、基板に細胞接着および細胞骨格の結合を促進し、従って損傷後の神経再生するために、異なるタイプの能力を向上させることができる足場の設計を可能にする。
ここでは、レーザ誘起細胞の病変中に同時力分光測定を適用する方法について述べる。私たちは、軸索の膜に付着した光学的に捕捉されたプローブの同時干渉追跡によって部分的に病変軸索に張力放出を測定。我々の実験的なプロトコルは、ピコニュートン感度の張力解放を検出し、テンションリリースの動的にミリ秒の時間分解能。従って、細胞と基質との間の機械的結合が薬物治療及び/又は基板の別個の機械的特性により変調することができる方法を研究するための高解像度の方法を提供する。
Introduction
光学顕微鏡は、生きた細胞を観察するために使用できる、低侵襲イメージング·システムの一つである。そのような放射圧（光ピンセット1のように）、または高エネルギー光子束（レーザディセクタ2のように）として作用の利用では、この技術は、ナノ操作まで延長された。光学撮像システムは、3つのサブ細胞標的を視覚化して操作するための正確な制御を供給する。同時に、送達レーザパワーの正確な較正のおかげで、光ツールは前例のない再現性のいずれかまたはソフト侵襲試料操作を実現する。
いくつかの研究室は、異なるセル5が互いに融合したり、光学的に貨物6,7を駆動することにより細胞を刺激し、細胞小器官4を焼灼するために、同じ実験設定、光ピンセット、レーザディセクタに、統合された。光ピンセットは、光学剛性のキャリブレーションした後、可能にする一方でピコニュートンスケールのセルに印加される力の制御は、レーザ切開システムは、膜の光ポレーションからサブ細胞構造の単一細胞小器官又は解剖の切除の範囲光学的操作を調節することができる。しかし、レーザー解剖校正は、主に試料8に生じた形態学的変化を示す画像分析に基づいてサンプルに送達されるエネルギー、光に対する操作のエンティティの定性的評価に依存している。提示手法では、ピコニュートンスケール、サブ細胞区画9の細胞骨格構造の変化した平衡によって生成力に、定量化するために、開発ニューロンのレーザー軸索の解剖時に力の分光測定を実行する方法を示します。培養されたニューロンは、基板に付着し、開発中に分極する。偏光位相は、in vitroで最初の5日の間に発生します。偏光の第二段階では、EXTRUDの一つるの突起が長くなり、それが軸索10になるように分化する。成長円錐での牽引力に応じて、軸索の伸びが以前Dennerlのモデル11でモデル化されています。最近では、このモデルは、細胞外マトリックスの基材への密着性神経突起の役割を含むように12を拡張されている。実験観察13後提案この生物物理学的モデルは、神経突起に沿って伝搬する、成長円錐に力を引っ張ったことを示した、基材への接着斑によって変調される。同様に、軸索の病変は、細胞体に向かって伝播する緊張の局所放出を生成します。従って、我々は病変と細胞相馬間軸索に沿った位置でこのような解放の張力を測定することは影響を受けない接着斑の減衰成果を評価するための可能性を提供することを提案。
私たちは、招いた軸索damagの程度を制御するために必要なエネルギーレーザーディセクタのフォトンフラックスを校正電子、完全離断からの部分的な病変へ。キャリブレーションに続いて、我々はいくつかの差別化ニューロンの軸索への部分的な病変を繰り返すとテンション放出を定量化するためのプロトコルを開発し、これにより基板14に軸索の密着性を推定するための定量的なパラメータを取得しました。
本研究では、詳細にはそのような化学的処理14、または細胞培養担体異なるタイプのような異なる実験条件では、基板への軸索の密着性を評価し、ピコニュートンの感度と比較する正確な実験手順を表す開発されたプロトコルを記述する。
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Protocol
1。光学装置
光学系全体は、前述15について説明した。簡単に言えば、光ピンセットシステムは波長1064nm（IPGレーザー社）におけるイッテルビウム連続波（CW）ファイバレーザの動作に基づいている。空間光変調器（SLM）（LCOS-SLM、モデルX10468-07 - 浜松）はコンピュータ生成ホログラムによって培養皿上でトラッピング焦点スポットの位置を制御するために、着信IRレーザービームの位相を変化させる。自由に利用できるブルーピンセットソフト（機器·テーブル上のWebリンク）空間光変調器に投影された生成されたホログラム。フォトダイオード（PD、PDA100A-EC - ソーラボ） - 力分光測定用干渉計は、4象限フォトダイオード（浜松C5460SPL 6041ボードとQPD、S5980）に基づいていた。
355nmの（ - ティームフォトニクスPNV-001525から040、パワーチップのナノパルスUVレーザー）でのYAGレーザー：レーザー解剖ソースはパルスサブナノ秒のUV Ndのだった。音響光学変調器は、（MQ110-A3-UV、355nmの溶融シリカ-AA-光電子）のサンプルに配信UVレーザーのパワーを制御した。
顕微鏡のobjective.The段は3軸リニアDCモータマイクロポジショニングで構成されている浸60X、0.9 NA水装備 - ホログラフィック光ピンセットやレーザーマイクロ切開は修正正立顕微鏡（オリンパスBX51）に統合されましたのサブナノメートルの分解能で試料の粗動を結合する別個の3軸圧電ナノ位置決めステージ（P-733.3DD、物理学機器）を搬送するシステム（M-126.CG1、物理学機器）ピエゾ舞台。顕微鏡ステージ·システムは、2つのコントロールが相乗的に、右側の位置に捕捉焦点スポットを維持するために作用する選択された作業モード（位置またはクランプ力、静的または動的）16に応じたループを備えていた。具体的には、内部フィードバックループは、選択時にビードを維持するために、圧電ステージに作用するトラップ中心からED距離。他の外部ループは、その利用可能なストローク17よりも大きな面積にピエゾアクチュエータで張ら地域を悪用する電動ステージの位置を制御する。それが試料に付着した捕捉されたビードを追跡しているので、ピエゾステージが一方向に利用可能なストロークの限界に達したときに、外部ループは反対方向に微小ステージを移動させ、これによりピエゾは、その中心位置に向かって回復する。ピエゾステージはそのコース範囲の中心位置に到達すると、マイクロステージが停止する。 システムのさらなる詳細はGuiggiani ら 16,17に報告されている。
ペルチェ素子（TC-344BデュアルチャネルヒータコントローラとQE1抵抗加熱 - ワーナーインスツルメンツ）顕微鏡（37°C）の下での細胞培養の温度を制御する。文化では、pHと湿度は、カスタム設計されたポリジメチルシロキサンを通気することにより生理的条件に維持した加湿カーボゲン（95％O 2、5％CO 2）とシロキサン（PDMS）スリーブ（顕微鏡対物レンズを統合）。
2。細胞培養の準備
全ての実験プロトコルは、イタリア保健省によって承認された。初代培養物は、胎生18（E18）において、マウスの海馬（C57BL6J、チャールズリバー）から入手した。
- ニューロンは、ガラス底ペトリ皿（ - MaTek社P35G-0-14-C）上に25,000細胞/ mlの濃度で播種した。培養細胞の低濃度は、in vitroでの最初の数日間に既に密なネットワークの形成を回避するために必要とされる。上述の細胞濃度で、他のセルに接続していない長い突起を有する単離された細胞を発見する可能性がはるかに高い。
3。ビーズコーティング
- ポリマー微小球は（Ø4ミクロン、COOH終端-前髪研究所、製品コードPC05N/6700）ポリで被覆したpolyLinkタンパク質結合キット（Polysciences社、製品コード19539）に記載の手順に従って-D-リジン。ビーズを培養支持体と好意細胞接着をカバーするために使用される同じ分子で被覆されている。
4。隔離されたニューロンを選択してください。培養基質、トラップからビーズをデタッチし、ニューロンの隣にそれを移動します
- 顕微鏡ステージ上で文化ペトリ皿を置く。ステージ運動により試料上にフォーカスを設定した後、ケーラー照明を設定する照明客観コンデンサーの位置を修正します。 Kolher、照明条件を設定する照明光学系を位置合わせすると、明視野像品質を向上させる必要がある。このような整列条件を用いて、それがQPDとPDによって、その干渉追尾を実行するように、散乱閉じ込められたプローブから、また、IRレーザ集効率（対物レンズを介して凝縮器）を最大化することが必要である。
- でコーティングされたマイクロスフェア原液を数μlのピペット培養皿へ。ミクロスは、預金と培養基質に付着する。培養皿に注入液の数は、原液のミクロスフェア濃度に依存する。理想的な条件は、1と2のビューの画像につきミクロスフェアフィールド間を持つことです。あまりに多くの微小球培養皿に追加されると、彼らはすでに培養ニューロンにランダムに添付することができます。
- 長い神経突起（軸索）孤立ニューロンを探し、培養皿の中を移動し、顕微鏡ステージの位置を保存します。
- 周りに移動し、培養支持体に付着したビーズを検索。
- IRトラッピングレーザーをオンにします。この段階では、まだホログラムがSLM上に投影されず、IRレーザスポットの位置は、UVレーザスポットの位置と一致する。顕微鏡ステージの運動によって2-3μmの培養支持体表面上のIRスポットの軸方向の位置を設定します。
- 1未満μW、サンプルに送達UVレーザパワーを設定する。ザUVレーザー解剖器具は、以前14をキャリブレーションされています：
5-6μWガラス支持体がアブレーションさ
4μWニューロンの接続が完全に解剖される
神経突起の一部が損傷されている2.5μW
<1μW衝撃波は、培養皿で製造される。光衝撃波は、ガラス支持体からビードを取り外すのに十分な強度である。 - にIRレーザーを残しながら、UVレーザーをオンにし、顕微鏡ステージの運動によって付着ビーズ上記UVスポットを移動します。ビーズ表面から切り離され、そしてそれがIRレーザーによって捕捉される。その後、UVレーザーをオフにします。
- ガラス支持体（20〜30ミクロン）上にトラップされたビーズの数μmを移動します。この位置にビーズを持ち上げると、それは以前に選択したニューロンに向かって移動している間、他の細胞に接触するからそれを防ぐことができます。以前に保存したステージ位置にビーズを持参。ドラグ流体力光学トラップを超えないように、低い値（10ミクロン/秒）にステージ速度を設定するpingの力。
5。計算機ホログラムによるレーザーディセクタスポットとアクソン位置に対するトラップの位置を移動し、光ピンセットの剛性を校正
- 軸索を可視化するためにガラス支持体に向かってビーズを移動します。ビードは、それ（約5μmのガラス支持体上）との接触を避けるために、セルの上方に保持されている。
- 軸索の幅の中心にUV焦点スポットを移動するために顕微鏡のステージを移動します。現在のステージ位置を保存します。
- 計算機ホログラムによりIR焦点スポット位置を移動します。このステップでは、ステージが前のステップで選択した位置で停止される。計算機ホログラムがSLM上に投影されるとき、捕捉ビーズは、軸索に対して移動される。我々はあまりにも同じ神経突起を中心としたUVレーザスポットで、追い込まれたビーズは、神経突起の中央に揃えているようにIRレーザスポットを移動します。 IRスポットしたがって、トラップビードが神経突起に沿って配置されている5-10程度離れてUVスポットから。私たちは、神経突起の形状に応じて、UVスポットに対するIRの位置を移動。光ピンセットは、SLMシステムが装備されていない場合には、位置がIR光路上の可傾ミラー、又は音響光学偏向素子によって変化させることができる。 IRレーザスポットは、そのブラウン運動に影響を及ぼす力分光法トレースを変えることができる閉じ込められたプローブを有する切開ビームの光の相互作用を避けるために、UVスポットから離れる5-10ミクロンを配置することができる。
- UVスポットと軸索の位置に対して新しいIRスポット位置を定義した後、軸索から閉じ込められたビーズを配置し、それとの衝突を避けるために、ステージを移動します。カバーガラス上の2程度にトラップされたビーズの軸方向の位置を移動します。
- その上に干渉縞がセンターにQPDを合わせ：xとy QPD差動信号はQPDが中央に配置さゼロです。 interferoによってトラップビーズのブラウン運動の5秒を取得メートル、50 kHzのサンプリングレートで。パワースペクトル法18による光学トラップの剛性（PN / nm）で、感度（V / nm）を取得します。
6。アクソンにビーズを取り付けます。軸索切断と同時力測定を実行
- カバーガラス上が4μm程度トラップビーズの位置を上げ、以前に保存したステージ位置（ステップ3.2を参照）に移動します。
- 軸索に向かって閉じ込められたビーズダウンを移動し、それが接触する神経突起をするまで。捕捉されたビードと軸索との間の衝突を軸方向に捕捉されたビードの変位を検出zのQPD信号により監視される。
- トラップされたビーズと10秒待つと、神経突起の膜への密着性を支持する軸索に押し付け。
- 軸索から閉じ込められたビーズを変位させるマイクロステージを移動し、これにより細胞膜への付着を確認します。ビーズが付着した場合、それは光学トラップから逃げる。
- 付着したビーズ上のレーザートラップを戻すとゼロに等しい力条件を持つ力クランプ·ループをオンにします。光学トラップ中心のセルに添付されたように、ピエゾステージ再配置ビーズ、、で。システムは、フィードバックループ制御を持たない場合、レーザトラップ位置を中心it onに付着したプローブ顕微鏡ステージによって移動させることができる。 QPD信号が捕捉ビーズおよび細胞（xおよびy QPD信号がゼロに等しく、およびz QPD信号は、4つの象限の同じ電圧の和を与えるに接着されていない場合と同じである場合、トラップの中心に到達する）ビーズは、任意の表面から遠くにトラップされたときなど。
- 付着閉じ込めプローブ上のプリテンションを生成するために、ビーズ（約100nm）の中央やや上のトラップレーザーを配置、z軸上の力クランプ条件を設定します。システムは力クランプ制御が装備されていない場合には、光学トラップ位置を顕微鏡ステージによって25nmのステップで最大上昇させることができる。 Z QPD信号が監視できます。したがって、THIを使用sが付着したプローブに対するレーザトラップの位置を設定するシグナル。このようなプリテンションは、軸索病変後の膜の緊張、および付着したプローブのブラウン運動の結果として生じる減少を感知するために必要とされる。同様のアプローチは、ビデオ撮像19による膜テザーに張力の放出を測定することが提案されている。
- スイッチオフ位置クランプ条件（ピエゾステージがブロックされている）に付着したプローブ上の力を測定するための力クランプフィードバック。
- レーザー軸索切断タイムラプス明視野イメージング（20 Hzのフレームレート）の間の干渉計（20 kHzのサンプリング周波数）と、セルを閉じ込めプローブ位置の同時録画を開始します。
- 病変は軸索の画像上に見えるようになるまでのレーザパルスを提供するためにUVレーザーをオンにします（通常は200-400光パルスが必要とされるパルスあたりのエネルギー：25 NJ）、その後、UVレーザーをオフにします。
- 約3マイルのために干渉計によって記録を継続にn、x、y及びz QPDトレースがプラトーに達するまで。
7。合計テンションリリースを定量
- ナノメートルのそれぞれのトレースを取得するために、光学トラップの校正された感度で録音しQPDトレース（ボルト）に変換します。
- 10Hzでカットオフを有するハイパスフィルタによってx、y、およびz変位トレースをフィルタリングする。
- トラップされたビーズのブラウン運動を表すフィルタトレースの全分散を計算します。 500ミリ秒（10,000データポイント）20の時間ウィンドウの重複は25ミリ秒ステップで分散を計算します。トレースのフィルタリングハイパス、膜変動または皮質アクチン運動によるブラウン運動の変化を除外します。ビードのブラウン運動は、細胞膜上の光学力及び密着力によって低減される。膜は、その粘度が増加する張力の解放ので、ビードのブラウン運動の緊張したとき、直ちに、検出されたately軸索切断後、減少し始める。
- UVレーザーエネルギーの送達後に、ブラウン運動の分散の減少の始まり：T0を定義します。時刻t0においては、膜の株の始まりを示す。
- ブラウン運動の差異（それはプラトーに達したとき）の減少の終了：T1を定義します。時刻t1は、膜株の終了を示す。
- 力測定時の試料のいずれかのドリフトを測定するために、カバーガラス支持体上に破片や傷のビデオトラッキングを行う。ガラス支持体上に粒子を追跡するには、まず、黒の背景に白の粒子とバイナリイメージのスタックを取得するために、明視野画像にしきい値を適用する。そこで、サブピクセル精度（フリーのImageJソフトウェアを使用して）質量の粒子の中心を追跡する。
- 変位QPDトレースから測定されたドリフトを減算。それぞれの校正された光学剛性（K X、kでドリフト補正QPD痕跡を掛ける
- F TOT =√（Fxの2 + Fyを2 + Fzの2）と全体の力トレースを計算します。
- F TOT（T0） - F 解放 = F TOT（T1）としてt0とt1の間の力の合計のリリースを計算します。それはトラップの中心からのプローブの変位によるものですので、t0で測定された力は、減算されなければならないときに神経突起にビーズ付着。
- 捕捉されたビーズとUVレーザスポット位置との間の神経突起の接触面積を計算する：明視野像に捕捉されたビーズとUVレーザスポット位置との間の神経突起（L）の長短（D）の軸を測定する。軸索の接触面積が軸索である=長さ×D.
- によって放出合計解放力Fを正規 軸索接触面積軸索 。
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Representative Results
セルは、その焦点癒着により基板上に牽引力を発生。細胞骨格要素によって生成された力は、培養基質の反作用力と平衡状態にある。神経突起のレーザ誘起病変した後、細胞骨格緊張ケーブルの一部が破壊され、基板密着性の対向する力が除去されているので、それらの平衡化張力が解除される。解放張力は、部分的に影響を受けない接着斑に分布し、細胞膜に付着ビード、光学トラップに保持され、（模式図1を参照）、基板に細胞を固定細胞骨格要素によって打ち消されていないような放出の一部分を測定する。
我々は、 図2に、上述した実験プロトコルの代表的な結果を報告する。ニューロンは、 図2aの左パネルで、差別のnの軸索を識別する長い神経突起を提示euron。 図2a右側のパネルで、同一のニューロン誘導性軸索病変（白抜き矢印で示される）の後に示されている。 図2bは、x、y、z方向で記録されたビードの変位トレースを示している。 図2cは、スクラッチのビデオトラッキングをレポートガラス支持体上に、考慮し、測定中にステージドリフトを除去する。
図3aには、左側のパネルで、私たちは緊張のリリース測定中に神経突起の直径のカイモグラフを計算上流の病変部位を、病変神経突起を示し、白線。右側のパネルでカイモグラフは神経突起の直径はわずか直ちに病変の後に増加し、その後、セル相馬に向かって緊張の解放のために薄くなる方法を示す、である。 図3bに、我々はカイモグラフ結果を定量化する。我々は、アッタに配置以来、神経突起は、背景に関して明るく表示されます目的の焦点センターでビーズCHEDため、軸索は、ピントが少し不足しています。実際に、タイムラプス録画の各フレームにおけるカイモグラフ線に沿って画素強度の和を報告することによって、我々は、張力の解放中の神経突起の直径の推定値を得る。パネル3cとで、我々はテンションリリース時に、接続されているビーズの全分散を報告し、ハイパスは10Hzのカットオフ周波数でフィルタリング後の干渉計（図2b）にすることによって記録されたトレースに基づいて計算。我々は分散が病変部位の上流の材料の蓄積の間に神経突起の直径が増加することが観察できる。膜が緊張し、神経突起の直径があまりにも低下した場合、その後、分散は（ 図3cでt0に）低下し始める。分散減少はテンションリリースが停止したときに、（ 図3cにおけるt1で）プラトーに達する。 t1以後、ブラウン運動が増加し始めるので、エキソサイトーシス21（ 図3cを参照）が原因の可能性メンブレン緩和。
図4aに、ホワイトボックスは神経突起の接触面積培養支持体と軸索の推定を示している。 軸索は、UVレーザスポットの位置とトラップされ、プローブの中心部の間に計算されます。 図を校正それぞれによってドリフト補正さQPD変位トレース（ 図2b）を乗じた後に得られた総放出力Fの振幅トレースが解放 4bとレポート光学トラップの剛性（K X、kのY、K Z）。我々は時間t1とT0（図4bでΔpN）で測定された力との差を計算した後、我々はPN /μm2での面でリリースされテンションを得るために、 軸索で割る。
試料中の別のニューロンに同じプロトコルを繰り返すことにより、我々は、開始することができ別の支持体上の化学要因やメッキで処理されたいくつかの文化の実験のセッション、および最終的に異なる実験条件で得られた平均値を比較します。 図5では、我々は、基板上に接着斑によって減衰さ軸索病変の後に緊張の解放を示し、より高いテンションのリリース値が小さい基板に付着した軸索を意味している。我々は部分的、かつ完全ではない、軸索の病変を誘発するので、配信総エネルギーで測定されたテンションリリースの依存性を調査し、損傷部位と閉じ込められたビーズの間に神経突起の接触面積に。私たちは、光パルスの高い数を提供することで、より多くの細胞骨格要素を破壊し、その結果、緊張の高い放出を誘導しようとした。そうでなければ、増加した神経突起の接触面積で、我々は張力解除の下部量を測定すると期待した。 図5においては、上記の2つのパラメータの依存性があることを示す明確ではありません。同一の顕微鏡対物レンズと同じエネルギーを使用するときに変化しない焼灼スポット08の寸法に関連して、あるため、我々は（プロトコールステップ4.5を参照してパルス当り予め較正された低いエネルギーを有する）によって誘発される部分的な病変と推論サンプルでパルス当たり。接着斑のうち1％を占めるように、それがよく、そのようなパラメータは、基材への細胞接着の良好な推定値を表すものではないことが知られているので、さらに、張力の解放は、接触面積と相関されていないという事実は驚くべきことではない基底面22。
図1。レーザー軸索切断時の破砕細胞骨格の平衡をグラフィカルに表現。焦点癒着により基板への細胞付着。青の矢印の細胞骨格要素（スプリングによって示される）によって生成された牽引力をpecify。水色の矢印はリジッド培養基質によって生成された対抗力を示す。簡略化されたシナリオでは、病変の前に、細胞骨格と基板力がペアになって平衡化されています。神経突起のレーザ誘起病変の後、いくつかの温泉と基板との間の接続が中断されています。したがって、基板はcytoskletal要素の牽引力に対抗されていない、もはや。トラップされたビーズは、膜に付着、放出細胞骨格力の方向を追跡します。
図2。レーザ誘起病変時の海馬ニューロンの軸索の膜に付着閉 じ込められたビーズの干渉追跡。（）ブライトフィールド軸索のアブレーションの間に取得された画像。左側のパネルにある病変の前に。右側のパネルで病変の後。ポリ-D-リジンコートビーズを膜（polystireneビーズ、4μmのをØ）に取り付けられており、光学トラップに保持されている。サンプルにIRレーザーの平均パワーは14 mWである。白い矢印は、病変部位を示す。バーは5μmである。光学トラップにおけるビード位置の後ろ焦点面干渉によって（b）の記録トレース。青、緑と赤のトレースは、それぞれ、x、y、z軸に沿ってビード位置を表す。サンプリングレートは20 kHzです。ステージドリフトを監視するために追跡映像によって測定培養支持体の傷の（c）の変位量です。青と緑のトレースは、ビデオトラッキングによって得られたxとyの位置である。フレームレートは5.5 Hzです。
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図3。テンションリリース時の軸索径、病変軸索の膜ひずみの解析病変軸索の（a）は明視野像、左側のパネルにある。軸索に白線垂直なキモグラフが計算される位置を示します。右側のパネルで、軸索の直径のカイモグラフ、上流の病変部位の。カイモグラフの各行は、0.18秒に相当する。張力解除時の軸索径の推定値を表すカイモグラフの各行の画素強度の（b）の合計。に取り付けられたビードのブラウン運動の（c）の合計差異軸索（t0とt1はそれぞれ解剖後の軸索で最初とテンションリリースの終わりを示す）。
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図4。軸索切断後にリリーステンションの定量。（）病変軸索の明視野像。ホワイトボックスは、病変部位と閉じ込められたビーズの中心間の神経突起の接触面積の推定値を示しています（b）は軸索切断（F TOT =√（Fxの2 + Fyを2 + Fzは後に測定力の全振幅のトレース2））。 Fxの、 Fyと、Fzと、変位トレースは図2bに示されるものであり、フックの法則（F = kxを）により算出した。光学トラップの3つの直交方向における剛性は、パワースペクトル法（k個のx、y = 7.9 PN /ミクロンで、k zは = 2.3 PN /μm）を算出した。 ΔpNは時間瞬間t0とt1の間で測定された解放力を示している。
図5。サンプルに供給されるエネルギーの量で測定テンションリリースの依存性、および神経突起の接触面積で。3 DIVでマウスhippocamapalニューロンの軸索上で実行26の実験からのデータは、（）テンションリリースに対する神経突起の接触面積の散布図病変と閉じ込められたビーズの場所の間。テンションリリース対サンプル神経突起の接触領域に供給されるエネルギーの総量（b）の散布図。
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Discussion
我々は、この研究でレーザー誘起細胞の病変中に同時力分光測定を行うことにより、培養基板への密着性神経突起を比較する定量的な方法を報告する。緊張の測定されたリリースは、基板への細胞の付着の度合いに関係している：接着斑数の多い細胞が少なく緊張を解放する必要があります。ピコニュートンの面で緊張の放出を測定することは、異なる実験条件14で培養支持体に軸索の接着性を評価するためにそれによって物理量を提供しています。
いくつかの研究室は、異なる光学設計23を採用し 、光ピンセットシステムとレーザー解剖を統合しました。私たちの選択は、固定光路及び顕微鏡ステージモーションを使用してセットアップしました。これを達成するために、我々は、UVレーザー位置に対して捕捉スポットを移動させるIRレーザービーム経路内に空間光変調器を導入する。もののgalvanometrICミラーは、試料を動かすことなくレーザフォーカス位置を操縦することができ、それらは、力分光法の測定に影響を及ぼすシステムにおける機械的なノイズを導入することができる。ブラウン運動の解析、光学剛性の速い再キャリブレーションを可能にしいるのでさらに、私達は、試料中に再配置IRレーザーフォーカスすることを決めた。試料に紫外レーザスポット位置を移動するだけで、その中心位置からのビームの小さな変位のために無視できるUV焦点スポット自体の品質に影響を与える球面収差を生成することができます。したがって、レーザディセクタの光学特性の変更は、エンティティへの損傷に対する送達レーザパワーのデノボ較正を必要とすることができます。
力分光測定によって、我々はテンションリリースは数秒の速い段階、および秒の数十に続く可能性が遅い段階で構成されていることを観察することができます。のように、時にはゆっくりと、前作14で報告フェーズでは、数分続くことができます。そのため、我々は、培養支持体上にスクラッチを追跡するビデオによる力測定を修正しなければならなかった。今後は、より良いアプローチは、カバーガラスに取り付けられたビードの映像又は干渉追尾による顕微鏡のステージの位置を自動補正するフィードバックループとステージドリフトをキャンセルすることである。このタイプの構成は、既に文献に報告され、添付のビードを中心とした第2のレーザビームを必要とし、サブナノメートルの精度でステージ24,25の安定化を確実にする。
今後は、分化の異なる段階で培養支持体に軸索の付着を比較し、異なる病理状態を治療するための薬理学的定量を提供するために開発されたプロトコルを適用する。また、同じプロトコルは、異なるメカ有する材料の種類にニューロンの密着性を比較するために、植え込み可能な足場の設計に適用することができるanicalまたは化学的性質26。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
細胞培養の準備での専門家の助言と支援のためのカスタム電子機器やソフトウェアの開発のための洞察に満ちた議論を、ジャコモPruzzoとアレッサンドロパロディのためのリアルタイム制御システム、エヴェリーナChieregattiと花子対馬を開発するためのアルベルトGuiggiani、とクラウディアキアブレーラとマリーナナンニ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | Hamamatsu | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop | ||
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O'Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M.
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
