Summary
Vi målte spænding frigivelse i en Axon der blev delvist læderet med en laser dissektor ved samtidig kraft spektroskopi måling udføres på en optisk fanget sonde klæbet til membranen af Axon. Den udviklede eksperimentelle protokol evaluerer Axon vedhæftning til dyrkningssubstrat.
Abstract
Dannelsen af funktionelle forbindelser i et udviklingsland neuronal netværk er påvirket af udefrakommende signaler. Den neurite væksten i udviklingslandenes neuroner er underlagt kemiske og mekaniske signaler, og de mekanismer, som det sanser og reagerer på mekaniske signaler dårligt forstået. Belyse rollen af kræfter i cellemodning vil gøre udformningen af stilladser, der kan fremme celleadhæsion og cytoskelet kobling til underlaget, og dermed forbedre kapaciteten af forskellige neuronale typer at regenerere efter skade.
Her beskriver vi en metode til at anvende samtidige kraft spektroskopi målinger under laserinduceret cellelæsion. Vi måler spændingen frigivelse i delvis læderede Axon ved samtidig interferometrisk sporing af en optisk fanget sonde klæbet til membranen af Axon. Vores forsøgsprotokol registrerer spændingen udgivelse med piconewton følsomhed og dynamikken i spændingen frigivelsemillisekund tidsopløsning. Derfor, det giver en høj opløsning metode til at undersøge, hvordan den mekaniske kobling mellem celler og substrater kan moduleres ved farmakologisk behandling og / eller ved forskellige mekaniske egenskaber af substratet.
Introduction
Optisk mikroskopi er en af de mindre invasiv billeddannende system til rådighed til at observere levende celler. Med udnyttelse af effekter såsom stråling tryk (som i optisk pincet 1), eller høj-energi fotonflux (som i laser dissektor 2), blev denne teknologi udvidet til nano-manipulation. Det optiske billedsystem fremlægger en præcis kontrol at visualisere og manipulere sub cellulære mål 3.. Samtidig, at præcis kalibrering af den leverede laser magt tak, optiske værktøjer udrette enten blødt eller invasive prøve manipulation med en hidtil uset reproducerbarhed.
Adskillige laboratorier integreret i den samme forsøgsopstilling, optisk pincet og laser dissektoren for at polere organeller 4, at smelte sammen forskellige celler 5, eller at stimulere celler ved optisk drevet laster 6,7. Mens optisk pincet, efter kalibrering af den optiske stivhed, tilladerkontrol af påførte kraft til cellen på en piconewton skala, kan laser dissektion systemer modulere optisk manipulation, som spænder fra membran foto-porering til ablation af enkelte organeller eller dissektion af sub-cellulære strukturer. Men laser dissektion kalibrering afhængig kvalitativ vurdering af den enhed af optisk manipulation med hensyn til energi, der leveres til prøven, hovedsagelig baseret på billedanalyse illustrerer morfologiske ændringer forårsaget til modellen 8.. I det præsenterede metode, viser vi, hvordan du udfører force spektroskopi målinger under laseren axonal dissektion af et udviklingsland neuron, at kvantificere på piconewton skala den kraft der produceres af en ændret balance i cytoskelettet struktur af en sub-cellulært rum 9.. Dyrkede neuroner klæbe til substratet, og polarisere under udvikling. Polariseringen fase opstår i løbet af de første fem dage in vitro. Ved fase to af polarisering, en af extrudING neuritter bliver længere, og det vil differentiere at blive Axon 10. Axonal forlængelse i respons på trækkraft på væksten kegle er tidligere modelleret af Dennerl model 11.. For nylig er denne model blevet udvidet 12 til også at omfatte den rolle neurit vedhæftning til den ekstracellulære matrix substrater. Denne biofysisk model foreslået efter eksperimentelle observationer 13, viste, at trækkræfter på vækst kegle, udbreder sig langs neurit, moduleres ved fokale adhæsioner til underlaget. Ligeledes axonal læsion producerer en lokal frigivelse af spænding formerings mod cellen kroppen. Således har vi foreslået, at måling af sådan frigivet spænding i en placering langs Axon mellem læsionen og den celle soma giver mulighed for at vurdere den afdæmpende resultat af upåvirket fokale adhæsioner.
Vi kalibrerer den nødvendige energi foton-flux af laser dissektoren at styre omfanget af den påførte axonal damage, fra fuldstændig transection til delvis læsion. Efter kalibrering, gentog vi delvis læsion til axoner i flere differentierende neuroner og udviklet protokollen at kvantificere spændingen frigivelse, og således opnåede et kvantitativt parameter at estimere vedhæftning Axon til substratet 14..
I det foreliggende arbejde, beskriver vi i detaljer udviklede protokol, som repræsenterer en præcis eksperimentel procedure for at vurdere og sammenligne med piconewton følsomhed den axonal vedhæftning til underlaget i forskellige eksperimentelle tilstande såsom kemisk behandling 14, eller forskellige typer af cellekultur støtte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Optisk opsætning
Hele det optiske system blev beskrevet tidligere 15.. Kort fortalt er det optiske pincet-system baseret på en ytterbium kontinuert bølge (CW) fiberlaser kører ved 1064 nm (IPG Laser GmbH). En rumlig lysmodulator (SLM) (LCOS-SLM, model X10468-07 - Hamamatsu) varierer fasen af den indkommende IR laserstråle til at styre positionen af fældefangst fokus plet på dyrkningsskålen ved computer genererede hologrammer. De frit tilgængelige Blue-pincet software (web-link på udstyr tabel) genererede hologrammer projiceret på den rumlige lys modulator. Interferometeret for force spektroskopi målinger var baseret på en fire-kvadrant fotodiode (QPD, S5980 med C5460SPL 6041 board - Hamamatsu) og en fotodiode (PD, PDA100A-EF - Thorlabs).
Laseren dissektion kilde var en pulserende sub-nanosekund UV Nd: YAG laser på 355 nm (PNV-001.525-040, PowerChip nano-Pulse UV laser - Teem Photonics). En akustisk-optiske modulator (MQ110-A3-UV, 355 nm kvartsglas-AA-Opto-elektronisk) kontrollerede effekt af UV laser leveret til prøven.
Det holografiske optiske pincet og laser mikro-dissektor blev integreret på en modificeret opretstående mikroskop (BX51 - Olympus) udstyret med en 60X, 0,9 NA vand dyppe objective.The stadium af mikroskopet er sammensat af et 3-akset lineær DC motor mikro-positionering systemet (M-126.CG1, fysik-instrumenter) bærer en separat 3-akset piezoelektrisk nano-positionering etape (P-733.3DD, fysik-instrumenter) til at kombinere grove bevægelse af prøven med sub-nanometer opløsning af piezo- stadium. Mikroskopbordet systemet blev udstyret med to reguleringssløjfer synergistisk indsats for at bevare trapping fokus stedet på den rigtige position, afhængigt af den valgte arbejds-tilstand (position eller force clamp, statisk eller dynamisk) 16. Især optræder en intern feedback loop på en piezoelektrisk stadium at holde perlen på en udvalgted afstand fra fælden centrum. Den anden ydre sløjfe styrer positionen af den motoriserede trin at udnytte regionens udspændt af piezo-aktuatoren på et større areal end dets faktiske slaglængde 17. Når piezo-trins når grænsen af det disponible slag i én retning, den ydre sløjfe bevæger mikro trin i den modsatte retning, således piezo genvinder mod sin centrale position, fordi det sporer fanget vulst klæbet til prøven. Når piezo-scenen når den centrale position af sit løb rækkevidde, mikro scenen standset. Yderligere oplysninger om systemet er rapporteret i Guiggiani et al 16,17.
En Peltier anordning (QE1 modstandsopvarmning med TC-344B dual channel varmer controller - Warner Instruments) styrer temperaturen af cellekulturen under mikroskop (37 ° C). I kulturen, pH og fugtighed holdes på fysiologiske betingelser ved beluftning et specialfremstillet polydimethylsiloxan (PDMS) muffe (integrere mikroskop mål) med befugtet carbogen (95% O2, 5% CO 2).
2.. Cell Culture Forberedelse
Alle de eksperimentelle protokoller blev godkendt af det italienske sundhedsministerium. Primære kulturer blev opnået fra hippocampi af mus (C57BL6J, Charles River) ved embryonisk dag 18 (E18).
- Neuroner blev udpladet ved en koncentration på 25.000 celler / ml på glasbund petriskåle (P35G-0-14-C - Matek Corporation). Den lave koncentration af dyrkede celler er nødvendig for at undgå dannelse af et tæt net allerede i de første dage in vitro. På den nævnte cellekoncentration, er sandsynligheden for at finde isolerede celler med en længere neurit ikke forbundet med andre celler meget højere.
3.. Bead Coating
- Polymermikrosfærer (Ø 4 um, COOH-termineret-Bangs Laboratories, produktkode PC05N/6700), blev belagt med poly-D-lysin følge fremgangsmåden beskrevet i polyLink Protein Coupling Kit (Polysciences, produktkode 19539). Perlerne overtrækkes med det samme molekyle, der anvendes til at dække kultur støtte og favor celler vedhæftning.
4.. Vælg Isoleret Neuron. Frigør en perle fra kultur Underlag, Trap og Flyt den ved siden af Neuron
- Sæt kulturen petriskål på mikroskopet scenen. Efter indstilling af fokus på prøven ved scenen bevægelse, korrigere positionen af lygtens målsætning kondensatoren til at indstille Kohler-belysning. Justering af belysningsoptikken at indstille Kolher-belysning betingelse er nødvendig for at forbedre den lyse felt imaging kvalitet. Brug af disse tilpasningskravene, er det også nødvendigt at maksimere IR laser opsamlingseffektivitet (gennem objektiv kondensator) fra scattering fanget probe, til at udføre sin interferometrisk sporing af QPD og PD.
- Pipette et par ul af overtrukne mikrokugler stamopløsning itil dyrkningsskålen. Mikrosfærer vil indbetale og holde sig til kulturen underlaget. Antallet af pi injiceret i dyrkningsskålen afhænger mikrokugle koncentrationen af stamopløsningen. Den ideelle betingelse er at have mellem én og to mikrokugler pr billeddannelse synsfelt. Når alt for mange mikrokugler tilsættes til kulturen skålen, kan de allerede vedhæfte tilfældigt til de dyrkede neuroner.
- Flyt rundt i dyrkningsskålen, der søger efter en isoleret neuron med en længere neurite (Axon) og gemme positionen af mikroskopbordet.
- Flyt rundt og søge efter en perle levet op til den kultur support.
- Tænd IR trapping laser. På dette stadium er der ikke hologrammer projiceret på SLM, og placeringen af IR laser spot sammenfaldende med UV laser stedet position. Indstille den aksiale position af IR spot 2-3 um over kultur bæreflade ved mikroskopbordet bevægelse.
- Indstil UV laser effekt leveret til prøven mindre end 1 pW. DenUV laser dissektoren tidligere er blevet kalibreret 14:
5-6 pW glasset støtte ablateres
4 pW en neuronal forbindelse er fuldstændig dissekeret
2,5 pW en neurit er delvist læderet
<1 pW en chokbølge frembringes i dyrkningsskålen. Den optiske chokbølge er stærk nok til at frigøre perlen fra glasset støtte. - Tænd UV laser, mens IR laseren på, og flytte UV plet over den vedhæftede perlen ved mikroskopbordet bevægelse. Perlen frigøres fra overfladen, og det er fanget af IR laser. Sluk derefter for UV laser.
- Flyt indfangede perle adskillige mikrometer over glasset support (20-30 um). Løft af perlen til denne position vil forhindre den fra at kontakte andre celler, mens det bevæges mod tidligere valgt neuron. Bring perlen til den tidligere gemte scene position. Sætte scenen hastighed til en lav værdi (10 um / sek), så træk fluidkraft ikke overstiger den optiske fældeping kraft.
5.. Flyt Trap position i forhold til Laser dissektoren Spot og Axon Position ved Computer Dannet Hologram og Kalibrer optisk pincet Stivhed
- Flyt perlen mod glasbærer at visualisere Axon. Perlen holdes over cellen for at undgå kontakt med det (ca. 5 um over glasset support).
- Flyt mikroskopbordet at flytte UV fokus plet på midten af bredden af Axon. Gem den aktuelle fase position.
- Flyt IR fokus spot position ved computer-genererede hologram. I dette trin er scenen standset i den valgte stilling i det foregående trin. Når computeren genereret hologram projiceres på SLM er fanget kugle bevæges i forhold til Axon. Vi bevæger IR laserpunkt at have fanget vulst rettet ind på midten af neurit, med UV laserpunkt centreret på samme neurit også. IR plet og dermed indespærrede vulst er placeret langs neurit5-10 um væk fra UV-plet. Vi flytte placeringen af IR med hensyn til UV-plet efter neurit geometri. I tilfælde af optisk pincet er ikke udstyret med et SLM system, kan den holdning varieres ved at vippe spejle, eller akustiske optiske deflektorer på den IR optiske vej. IR laser spot kan placeres 5-10 um væk fra UV-spot for at undgå optiske samspil mellem dissekere stråle med de fangne sonde, som kan påvirke dens Brownske bevægelse og ændre kraft spektroskopi spor.
- Efter at have defineret den nye IR spot stilling med hensyn til UV spot og Axon position, flytte scenen for at placere fanget perlen væk fra Axon og undgå sammenstød med det. Flyt aksiale position fanget vulst omkring 2 um over dækglasset.
- Juster QPD at centrere interferensbåndene på det: x og y QPD differentiale signaler er nuller, når det QPD er centreret. Erhverve 5 sekunder af den Brownske bevægelse fanget vulst af interferometer ved 50 kHz sampling rate. Anskaf stivhed (PN / nm) og følsomhed (V / nm) af den optiske fælde ved kraftspektret metoden 18..
6.. Fastgør Bead til Axon. Udfør axotomi og samtidige kraftmaalingen
- Hæv de fangne perle position omkring 4 um over dækglasset, og flytte det til den tidligere gemte scene position (se trin 3.2).
- Flyt fanget perle ned mod Axon, indtil det kontakter neuritlængder. Sammenstødet mellem de fangne perle og Axon overvåges af z QPD signal detektering forskydning af fanget vulst i den aksiale retning.
- Vent 10 sek med de indespærrede perle skubbes mod Axon at favorisere sin vedhæftning til neurite membran.
- Flyt mikro stadium at forskyde fanget perlen fra Axon, og dermed kontrollere dets vedhæftning til cellemembranen. Hvis perlen klæbet det undslipper fra den optiske fælde.
- Flytte tilbage laser fælde på den vedhæftede vulstog tænd den kraft-clamp loop med force betingelse lig med nul. På en sådan måde,. De piezo-trins repositionerer perle, der er knyttet til cellen, på den optiske fælde center Hvis systemet ikke har en feedback-sløjfe styring, kan laseren fælden position bevæges ved mikroskopbordet at centrere det på den vedhæftede sonde. Midten af fælden er nået, når de QPD signaler er de samme, som når perlen er fanget og ikke levet op til cellen (x-og y QPD signaler lig med nul, og z QPD signal giver den samme spænding summen af de fire kvadranter som når perlen er fanget langt fra enhver overflade).
- Indstil en kraft-klemme tilstand på z-aksen, positionering trapping laseren lidt over midten af vulsten (ca. 100 nm), at generere en forspænding på den vedhæftede fanget sonde. I tilfælde af at systemet ikke er udstyret med en kraft-clamp kontrol, kan den optiske fælde position hæves op på trin 25 nm ved mikroskopbordet. Z QPD signal tillader overvågning. Brug derfor This signalet til at indstille positionen af laser fælde med hensyn til den vedhæftede probe. Sådan forspænding er nødvendig for at fornemme presset på membranen efter axonale læsion, og den deraf følgende fald i Brownsk bevægelse af klæbet probe. En lignende fremgangsmåde er blevet foreslået at måle frigivelsen af spænding i en membran tøjr af video imaging 19..
- Slukning kraft-klemme tilbagemelding til at måle kraften på klæbet sonde i stillingen-clamp tilstand (piezo-trin er blokeret).
- Start samtidig optagelse af de fangne probe positioner gennem interferometeret (20 KHz sampling frekvens), og cellen i løbet af laser axotomi time-lapse lyse-field imaging (20 Hz frame rate).
- Tænd UV laser at levere laserpulser indtil en læsion bliver synlig på billedet af Axon (Normalt 200-400 optiske pulser er nødvendige energi impuls:. 25. NJ), derefter slukke for UV laser.
- Fortsæt optagelsen ved interferometeret for omkring 3 min, indtil x, y og z QPD spor nå et plateau.
7.. Tal på de samlede Tension Udgivelsesdato
- Konvertere de indspillede QPD spor (i volt) efter den kalibrerede følsomhed optiske fælde, at opnå de respektive spor i nanometer.
- Filtreres x, y og z forskydning spor af et højpasfilter med afskåret ved 10 Hz.
- Beregne den samlede varians af de filtrerede spor repræsenterer den Brownske bevægelse fanget perlen. Beregn varians ved 25 msek skridt for overlappende tidsvinduer på 500 msek (10.000 datapunkter) 20. Den højpasfiltrering af spor udelukker ændringerne i Brownsk bevægelse på grund af membranen udsving eller kortikale actin bevægelse. Brownske bevægelse af perlen nedsættes med de optiske styrker og adhæsionskræfter på cellemembranen. Når membranen er anstrengt på grund af frigivelsen af spændinger dets viskositet øges, og dermed den Brownske bevægelse af perlen, detekteres straksbart efter axotomi, begynder at falde.
- Definer t0: begyndelsen af faldet i den Brownske bevægelse varians, efter levering af UV-laser energi. Den tid øjeblikkelig t0 angiver begyndelsen af membranen stamme.
- Definer t1: udgangen af nedsættelse af Brownske bevægelse varians (når den når et plateau). Den tid t1 angiver afslutningen af membranen stamme.
- Udfør Videosporingssystemet af vragdele eller en ridse på dækglas support, for at måle enhver tendens af prøven under force målingen. Sådan sporer partiklen på glasset support, vi først anvende tærskelværdier for de lyse-field billeder, for at opnå en stak af binære billeder med partiklen i hvidt på en sort baggrund. Så vi spore partikel tyngdepunkt med sub-pixel-præcision (ved hjælp af freeware ImageJ software).
- Fratræk den målte afdrift fra fortrængning QPD spor. Multipliceres drivgarn korrigerede QPD spor af den respektive kalibrerede optiske stivhed (k x, k
- Beregn den samlede kraft spor som F tot = √ (Fx 2 + Fy 2 + Fz 2).
- Beregn den samlede frigivelse af kraft mellem t0 og t1 som F frigivet = F tot (T1) - F tot (t0). Den målte kraft ved t0 skal trækkes, fordi det er på grund af forskydning af sonden fra fælden centrum, når vulsten klæber til neurit.
- Beregn neurite kontaktflade mellem de fangne perle og UV laser stedet position: på den lyse felt billedet foranstaltning de lange (L) og korte (D) akser neurite mellem fanget perle og UV laser stedet position. Axon kontaktflade er A Axon = L x D.
- Normalisere samlede frigivet kraften F udgivet af Axon kontaktområdet A Axon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellen genererer trækkræfter på substratet ved dens fokale adhæsioner. Kraft, der genereres af cytoskeletelementer er i ligevægt med den modvirkende kraft dyrkningssubstrat. Efter laser induceret læsion af neurit, er nogle af de spændte cytoskelet kabler forstyrret og deres ækvilibreret spændingen udløses, fordi den modsatrettede kraft af substratet vedhæftning elimineres. Den frigjorte spænding er delvist fordelt på de upåvirkede fokale adhæsioner, og vulsten knyttet til cellemembranen, holdt i en optisk fælde, måler den del af en sådan frigivelse ikke modvirkes af cytoskeletelementer forankrer celle til substratet (se skematisk figur 1) .
Vi rapporterer, i figur 2, et repræsentativt resultat af den ovenfor beskrevne forsøgsprotokol. Neuron, i figur 2a venstre panel, præsenterer en længere neurit, som identificerer Axon af den differentierende nEURON. I figur 2a højre panel er det samme neuron vises efter den inducerede axonal læsion (angivet ved den hvide pil). 2b viser de optagede perle forskydning spor i x, y og z-retningerne. Figur 2c rapporterer Videosporingssystemet af en ridse på glasset støtte, eliminere at tage hensyn til og scenen afdrift under målingen.
I figur 3a, på venstre panel viser vi læderede neurite og den hvide linie opstrøms læsion site, hvor vi beregner kymograph af neurite diameter under spænding release måling. På højre panel er kymograph, der viser, hvordan neurit diameter lidt stiger umiddelbart efter læsion, og derefter bliver tyndere på grund af frigivelsen af spænding mod celle soma. I figur 3b, kvantificere vi kymograph resultatet. Det neurit vises lysere med hensyn til baggrunden da vi positioneret AttaChed perle i fokus midt i målet, og derfor Axon er lidt ude af fokus. Faktisk ved at rapportere summen af pixel intensiteter langs kymograph linje på hver ramme af time-lapse video-optagelse, får vi et skøn over den neurite diameter under frigivelse af spændinger. På panel 3c, rapporterer vi den samlede varians i den vedlagte perle under spænding frigivelse, beregnet på grundlag af de spor er optaget af interferometeret (i figur 2b) efter high pass filtrering ved 10 Hz cut-off frekvens. Vi kan observere at variansen stiger med neurit diameter under ophobning af materiale opstrøms for læsionsstedet. Derefter variansen begynder at falde (ved t0 i figur 3c), når membranen er anstrengt, og neurit diameter aftager også. Variansen Faldet når et plateau (ved T1 i figur 3c), når spændingen frigivelse ophører. Efter t1, starter Brownske bevægelse til at stige, fordimembran afslapning muligvis på grund exocytose 21 (se figur 3c).
I figur 4a, viser den hvide boks estimeringen af neurite kontakt område A Axon med kulturen support. En Axon beregnes mellem UV laserpunkt position og midten af fanget sonde. Figur 4b rapporter amplituden spor af den samlede frigivet kraften F udgivet opnået efter multiplicere afdrift-korrigerede QPD forskydning spor (i figur 2b) af den kalibrerede respektive optisk fælde stivhed (k x, k y, k z). Vi beregner forskellen mellem målte kraft på tidspunkt t1 og t0 (ΔpN i figur 4b), og så må vi dividerer med A Axon, for at opnå spændingen udgivet i form af pN / um 2.
Ved at gentage den samme protokol på forskellige neuroner i stikprøven, kan vi begyndesessioner af eksperimenter på flere kulturer behandlet med kemiske faktorer eller belagt på forskellige understøtninger, og endelig sammenligne den gennemsnitlige værdi opnået i de forskellige eksperimentelle betingelser. I figur 5 viser vi frigivelsen af spænding efter axonal læsion bliver dæmpet med fokale adhæsioner på substratet, og dermed en højere spænding frigivelse værdi betyder en Axon mindre klæbet til underlaget. Fordi vi fremkalde en delvis, og ikke fuldstændig, læsion af Axon, vi undersøgte afhængighed af den målte spænding frigivelse på den samlede leverede energi, og på den neurit kontaktflade mellem læsionsstedet og fanget perlen. Vi søgte at ødelægge mere cytoskeletelementer ved at levere et større antal lysimpulser, og dermed fremkalde en højere frigivelse af spænding. Ellers med en øget neurite kontaktflade, forventede vi at måle en lavere mængde spænding udgivelse. I figur 5, viser vi, at afhængigheden af de to ovennævnte parametre erikke klart. Vi derfor udledes, at den inducerede partiel læsion (med den tidligere kalibrerede lavenergi impuls, se protokol trin 4.5), er relateret til den dimension af ablation spot 8, der ikke varierer ved brug af samme mikroskop mål og den samme energi impuls på prøven. Den omstændighed, at frigivelsen af spændinger ikke er korreleret til kontaktarealet er ikke overraskende, fordi det er velkendt, at sådanne parametre ikke udgør et godt estimat af celleadhæsion til substratet, som fokale adhæsioner optager kun 1% af den basale overflade 22..
Figur 1. Grafisk gengivelse af forstyrret cytoskelettet ligevægt under laser axotomi. En celle klæber til et substrat ved fokale adhæsioner. Blå pile specify trækkræfter genereres af cytoskeletelementer (angivet med fjedre). Light-blå pile angiver modvirkende kræfter, der genereres af den stive kultur substrat. I et forenklet scenarium, før læsion er cytoskeletale og substrat kræfter parret og afbalanceret. Efter laser-induceret læsion af neurite er forbindelserne mellem nogle fjedre og underlaget forstyrret. Således substratet er ikke længere modvirke trækkraften af cytoskletal element. Fanget kugle, fastgjort til membranen, sporer retningen af de frigivne cytoskelet kræfter.
Figur 2. Interferometrisk sporing af en fanget kugle, fastgjort til membranen af Axon af en hippocampus neuron under laser-induceret læsion. (A) Bright felt billeder erhvervet under ablation af en Axon. Før læsion på venstre panel. Efter læsion på højre panel. En poly-D-lysin overtrukne kugler er fastgjort til membranen (polystirene perle, Ø 4 um) og holdes i en optisk fælde. Gennemsnitlige effekt af IR laser på prøven er 14 mW. Hvide pil angiver læsionsstedet. Bar er 5 um. (B) Optagne spor ved back brændplan interferometry af perlen position i den optiske fælde. Blå, grøn og rød spor repræsenterer perlen position langs x, y og z-akserne, hhv. Sampling rate er 20 kHz. (C) Forskydning af en ridse på kulturen support målt ved Videosporingssystemet at overvåge scenen afdrift. Blå og grønne spor er de x-og y positioner opnået ved video tracking. Frame rate er 5,5 Hz.
77fig3.jpg "/>
Figur 3. Analyse af Axon diameter under spænding release, og membranen stammen af læderede Axon. (A) Bright felt billede af læderede Axon, på venstre panel. Den hvide linie vinkelret på Axon angiver positionen hvor en kymograph beregnes. På højre panel, kymograph af Axon diameter opstrøms af læsionen site. Hver række af kymograph svarer til 0,18 sek. (B) Summen af pixel intensiteter af hver række af kymograph repræsenterer et estimat af Axon diameter under spænding frigivelse. (C) Samlet varians af Brownske bevægelse af perlen knyttet til axon (t0 og t1 angiver henholdsvis begyndelsen og slutningen af spænding frigivelse i Axon efter dissektionen).
0477/50477fig4.jpg "/>
Figur 4.. Kvantificering af spændingen frigivet efter axotomi. (A) Bright felt billede af læderede Axon. Den hvide boks viser estimatet af neurit kontaktflade mellem læsionsstedet og midten af fanget perlen. (B) spor af den totale amplitude af den kraft målt efter axotomi (F tot = √ (Fx 2 + Fy 2 + Fz 2)). Fx, Fy, og Fz blev beregnet ved Hookes lov (F = kx), hvor forskydning spor er dem vist i figur 2b. De stivheder, i de tre ortogonale retninger, af den optiske fælde blev beregnet ved kraftspektret metoden (k x, y = 7,9 PN / um, K z = 2.3 LV / gm). ΔpN angiver den målte frigivet kraft mellem den tid øjeblikke t0 og t1.
Figur 5. Afhængighed af målte spænding udgivelse på den mængde energi, der leveres til prøven, og på den neurite kontaktflade. Data fra 26 forsøg udført på axoner af muse hippocamapal neuroner ved 3 DIV. (A) Scatter plot af spænding frigivelse versus neurite kontaktflade mellem læsion og fanget perle placeringer. (b) Scatter plot af spænding frigivelse versus samlede mængde energi, der leveres til prøven neurite kontaktflade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterer i dette arbejde en kvantitativ metode til at sammenligne den neurit vedhæftning til dyrkningssubstrat, ved at udføre samtidig kraft spektroskopi målt i løbet laserinduceret cellelæsion. Den målte frigivelse af spænding er relateret til graden af adhæsion af cellen til substratet: celler med et højere antal fokale adhæsioner bør frigive mindre spænding. Måling frigivelsen af spænding i form af piconewtons giver en fysisk mængde, som at vurdere axon vedhæftning til kulturen støtte i forskellige eksperimentelle betingelser 14.
Flere laboratorier integreret en laser dissektor med et optisk pincet-system, vedtage forskellige optiske designs 23.. Vores valg var en opsætning med fast kuvetter og mikroskopbordet bevægelse. For at opnå dette, har vi indføre en rumlig lysmodulator i IR laserstrålevejen at flytte trapping stedet med hensyn til UV-laser position. Selvom galvanometric spejle tillader styre laseren fokus position uden at flytte prøven, kan de indføre mekanisk støj i systemet påvirker kraft spektroskopi målinger. Derudover besluttede vi at re-positionere IR laser fokus i prøven, da Brownsk bevægelse analyse tillader en hurtig re-kalibrering af det optiske stivhed. Flytning af UV laserpunkt position ned på prøven kan producere sfæriske aberrationer, der påvirker kvaliteten af UV fokus stedet selv, som er ubetydelig kun til små forskydninger af strålen fra sin centrale position. Derfor kan ændring af de optiske egenskaber af laseren dissektoren kræve en de novo kalibrering af den leverede laser magt versus skader på virksomheden.
Som force spektroskopi måling kunne vi observere, at spændingen frigivelse er sammensat af en hurtig fase af nogle få sekunder, og en langsom fase, der kan vare nogle snese sekunder. Som rapporteret i tidligere arbejde 14, undertiden langsommefase kan vare et par minutter. Af denne grund, vi havde at korrigere kraftmålingen ved Videosporingssystemet en ridse på kultur støtte. I fremtiden vil en bedre fremgangsmåde være at annullere scenen skred med en sløjfe, som automatisk korrigerer mikroskopbordet position ved video eller interferometrisk sporing af en kugle fastgjort til dækglasset. Denne type konfiguration, der allerede er rapporteret i litteraturen, kræver en anden laserstråle centreret på vedlagte perle, og sikrer scenen stabilisering med sub-nanometer præcision 24,25.
I fremtiden ønsker vi at anvende den udviklede protokol at sammenligne aksonal vedhæftning til kulturen støtte på forskellige stadier af differentiering og i forskellige patologiske tilstande for at tilvejebringe en kvantitativ analyse for farmakologisk behandling. Desuden kunne den samme protokol gælder udformningen af implanterbare stilladser, at sammenligne den neuronale vedhæftning til forskellige typer af materialer med tydelig meknisk eller kemiske egenskaber 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Alberto Guiggiani for at udvikle tidstro kontrolsystem, Evelina Chieregatti og Hanako Tsushima for indsigtsfulde diskussioner, Giacomo Pruzzo og Alessandro Parodi til udvikling af brugerdefinerede elektronik og software, og Claudia Chiabrera og Marina Nanni for deres ekspert rådgivning og bistand i cellekultur forberedelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | Hamamatsu | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop | ||
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O'Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M.
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
