एक सरल तरीका सेल प्रकार की एक किस्म में mesenchymal संक्रमण (EMT) को उपकला के शामिल होने के लिए वर्णित है. Immunocytochemistry द्वारा EMT राज्यों में कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए तरीके शामिल हैं.
Mesenchymal संक्रमण (EMT) को उपकला विकास के दौरान उचित morphogenesis के लिए आवश्यक है. इस प्रक्रिया के misregulation फाइब्रोसिस में एक महत्वपूर्ण घटना है और एक metastatic राज्य को कार्सिनोमा की प्रगति के रूप में शामिल किया गया है. EMT आबाद कि प्रक्रियाओं को समझना शीघ्र निदान और इन राज्यों रोग के नैदानिक नियंत्रण के लिए आवश्यक है. इन विट्रो में EMT के विश्वसनीय प्रेरण नैदानिक प्रयोजनों के लिए आम जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर की पहचान करने के लिए एक उपयोगी दवाओं की खोज के लिए उपकरण के रूप में भी है. यहाँ हम सेल प्रकार की एक किस्म में EMT के शामिल होने के लिए एक सरल तरीका प्रदर्शित करता है. कोशिकाओं immunocytochemistry से पूर्व और बाद EMT प्रेरण के विश्लेषण के लिए तरीके भी शामिल किए गए हैं. इसके अतिरिक्त, हम एंटीबॉडी आधारित सरणी विश्लेषण और माइग्रेशन / आक्रमण assays के माध्यम से इस विधि की प्रभावशीलता को प्रदर्शित.
Mesenchymal संक्रमण (EMT) को उपकला एक polarized उपकला कोशिका एक अत्यधिक गतिशील, fibroblast तरह mesenchymal सेल में जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तन की एक किस्म से होकर गुजरती है जिसके द्वारा प्रक्रिया है. इस प्रक्रिया को विस्थापित करने और आक्रमण करने के लिए एक वृद्धि की क्षमता में जिसके परिणामस्वरूप, जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन और adherens जंक्शनों की गिरावट के माध्यम से, भाग में होता है. Physiologically, EMT भ्रूण विकास और घाव भरने के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. EMT पर सही नियंत्रण की हानि फाइब्रोसिस और कार्सिनोमा 1,2 मेटास्टेसिस को जन्म दे सकता है.
उपकला कोशिकाओं की सतह पर ई cadherin की कमी EMT 3,4 के माध्यम से एक सेल की प्रगति में एक महत्वपूर्ण कदम है. ई cadherin सीधे सन्निकट कक्षों पर cadherin प्रोटीन के साथ सूचना का आदान प्रदान कि एक एकल पास transmembrane प्रोटीन है. सेल आसंजन में अपनी भूमिका के अलावा, ई cadherin प्रभावों सेल ई cadherin एक के cytoplasmic पूंछ के बीच बातचीत के माध्यम से संकेतनियामक प्रोटीन की दा विविधता, विशेष रूप से β-catenin. β-catenin adherens जंक्शनों के स्थिरीकरण में एक भूमिका निभाता है. विहित WNT सिगनल के दौरान, β-catenin ई cadherin से जारी है और यह Wnt मार्ग 3,4,5 में एक बहाव प्रतिलेखन कारक के रूप में कार्य करता है जहां नाभिक में स्थानांतरित हो. नाभिक में, β-catenin ट्विस्ट, स्लग, fibronectin, और मैट्रिक्स metalloproteases 3,6 की एक किस्म सहित कई EMT से संबंधित कारकों की प्रतिलेखन बढ़ाने के लिए दिखाया गया है.
Wnts के अलावा, TGF-β संकेतन सामान्य विकास के दौरान और रोगग्रस्त राज्यों 7,8,9 में दोनों EMT प्रेरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा दिखाया गया है. TGF-β तालू गठन के दौरान और विकासशील दिल 10 में होता है कि EMT में शामिल है. यह भी फाइब्रोसिस में और मेटास्टेसिस 7 को कैंसर की प्रगति में फंसा दिया गया.
जनसंपर्क यहाँ वर्णित प्रक्रियाovides आनुवंशिक हेरफेर के लिए आवश्यकता के बिना सेल प्रकार की एक किस्म में EMT के अनुरूप प्रेरण. यह प्रक्रिया ई cadherin के एक कॉकटेल का उपयोग करता है, sFRP-1, और DKK -1 अवरुद्ध एंटीबॉडी और Wnt -5 ए और TGF-β1 पुनः संयोजक प्रोटीन. इस कॉकटेल Wnt और TGF-β संकेतन बढ़ाने, जबकि ई cadherin आधारित आसंजन ब्लॉक करने के लिए बनाया गया है. मजबूत EMT शामिल होने के लिए क्षमता इस प्रक्रिया के जीव विज्ञान और कैसे चिकित्सकीय प्रयोजनों के लिए यह हेरफेर करने के लिए समझने के लिए महत्वपूर्ण है. EMT की वर्तमान सामान्य मार्कर, ई cadherin (EMT में downregulated) और (EMT में upregulated) vimentin, कैंसर में सह व्यक्त पाया जा सकता है और इस प्रकार संभावित metastatic कोशिकाओं 12 का सबसे अच्छा नैदानिक मार्कर प्रदान नहीं करते हैं. महत्वपूर्ण बात है, EMT आया है कि सेल प्रकार की एक किस्म का विश्लेषण कैंसर और फाइब्रोसिस 11 में नैदानिक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि आम जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर विकसित करने के लिए उपयोगी है. इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से दिखा दिया है कि ईमीट्रिक टन EMT आया है कि कोशिकाओं इन कोशिकाओं को 13 लक्षित कर सकते हैं कि यौगिकों की पहचान करने के लिए दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हो सकता है, सुझाव है कि कैंसर स्टेम कोशिकाओं के निर्माण में एक भूमिका निभा सकते हैं.
EMT शामिल होने के लिए पिछला तरीकों आम तौर पर TGF-β उत्तेजना या आनुवंशिक संशोधन का इस्तेमाल किया है. अकेले TGF-β कुछ प्रकार की कोशिकाओं में EMT प्रेरित दिखाया गया है, यह अब TGF-β EMT के लिए आवश्यक है कि प्रदर्शन किया गया है, लेकिन यह सभी प्रकार की कोशिकाओं 6,14 में पर्याप्त नहीं है. EMT शामिल होने के लिए आनुवंशिक संशोधन का उपयोग समय लगता है और श्रम गहन है. यहाँ वर्णित विधि, विरोधी मानव ई cadherin, विरोधी मानव sFRP-1, विरोधी मानव DKK -1, पुनः संयोजक मानव Wnt-5 ए, और मज़बूती से EMT प्रेरित करने के लिए पुनः संयोजक मानव TGF-β1 सहित कारकों के संयोजन का उपयोग करता है. कारकों के इस संयोजन ई cadherin आधारित आसंजन, EMT प्रेरण 4 के लिए एक महत्वपूर्ण कदम ब्लॉक करने के लिए तैयार है, और Wnt -5 ए प्रोटीन जोड़ने के साथ ही Wnt inhibitors के लिए अवरुद्ध एंटीबॉडी का उपयोग करके WNT सिगनल बढ़ाने की है, sFRP-1 और DKK -1. Wnt और TGF-β संकेतन mesenchymal सेल स्टेट प्रेरित करने और बनाए रखने के लिए एक autocrine पाश में कार्य करने के लिए दिखाया गया हैई 6. इस प्रेरण विधि आनुवंशिक हेरफेर से बचा जाता है और अकेले TGF-β का उपयोग कर से अधिक प्रभावी है. महत्वपूर्ण बात है, हम पहले से (चित्रा 5) 14 TGF-β उत्तेजना को पूरी तरह से प्रतिक्रिया करने में नहीं दिखाया गया है कि MCF7 और PANC-1 कोशिकाओं, सहित प्रकार की कोशिकाओं में EMT के शामिल होने का पालन करने में सक्षम हैं.
EMT उत्प्रेरण मीडिया अनुपूरक शो कम कॉम्पैक्ट और वृद्धि की धुरी के आकार आकारिकी (चित्रा 1) के साथ इलाज किया कोशिकाओं. इसके अतिरिक्त, EMT (आंकड़े 2 और 3) की पहचान कर रहे हैं जो Fibronectin अभिव्यक्ति में वृद्धि के साथ सतह ई cadherin अभिव्यक्ति समवर्ती में कमी, वहाँ है. ऐसे vimentin और घोंघा के रूप में अतिरिक्त mesenchymal मार्करों भी uninduced नियंत्रण की तुलना में EMT प्रेरित कोशिकाओं (चित्रा 4) में upregulated हैं. बढ़ी हुई प्रवास और आक्रमण क्षमताओं mesenchymal कोशिकाओं के मुख्य कार्यात्मक लक्षण हैं. इन विट्रो में </em> प्रवास और आक्रमण assays, EMT उत्प्रेरण मीडिया के पूरक के साथ इलाज किया कोशिकाओं (चित्रा 6) की ओर पलायन और आक्रमण करने के लिए एक काफी वृद्धि की क्षमता का प्रदर्शन किया.
7 चित्र में दिखाया एंटीबॉडी सरणी अभिव्यक्ति डेटा का उपयोग कर के रूप में प्रदर्शन EMT शामिल होने के लिए यह सरल विधि EMT संकेतन के अध्ययन के लिए उपयोगी है. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं ऐसे phosphorylated CREB में वृद्धि और MCF7 और A549 EMT प्रेरित कोशिकाओं दोनों में देखा ERK1 / 2 के रूप में EMT के साथ जुड़े आम अभिव्यक्ति हस्ताक्षर प्राप्त करने के लिए पूर्व और बाद EMT प्रेरण तुलना की जा सकती. CREB के S133 phosphorylation बाध्यकारी डीएनए को उत्तेजित करता है और TGF-β1 प्रेरित EMT 15 के बहाव में कार्य करने के लिए दिखाया गया है. ERK1 / 2 phosphorylation भी TGF-β1 प्रेरित EMT 16 के बहाव में कार्य करने के लिए दिखाया गया है. P70S6 बनाम A549 कोशिकाओं में जीएसके 3β phosphorylation में वृद्धि के साथ देखा के रूप में कोशिकाओं प्रकार के बीच संकेत दे रास्ते में अंतर भी स्पष्ट किया जा सकता हैMCF7 में कश्मीर phosphorylation. सेरीन 9 में जीएसके 3β phosphorylation यह समारोह कम हो जाती है, और जीएसके 3β समर्थक EMT प्रतिलेखन कारक, घोंघा 17 को बाधित करने के लिए दिखाया गया है. इसके विपरीत, p70S6K घोंघा गतिविधि लाती है और इसकी phosphorylation इस प्रोटीन 18 के सक्रियण के साथ जुड़ा हुआ है.
कुल मिलाकर, विशेष रूप से पहले पूरी तरह TGF-β का जवाब नहीं दिखाया कोशिकाओं में EMT, का सीधा और विश्वसनीय प्रेरण, EMT के जीव विज्ञान को समझने शकुन मार्कर के रूप में उपयोग के लिए आम अभिव्यक्ति हस्ताक्षर की पहचान, और कैंसर के लिए उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के विकास और मूल्यांकन के लिए उपयोगी है और fibrotic रोग.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों उपयोगी चर्चा और पांडुलिपि की समीक्षा के लिए जूलिया Hatler और मार्टिन Ramsden (आर एंड डी सिस्टम) को स्वीकार करना होगा.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Epithelial cells of interest | We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1 | ||
EMT Inducing Media Supplement | R & D Systems | CCM017 | |
Recombinant Human TGF-β1 | R & D Systems | 240-B | Used at 10ng/ml |
Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody | R & D Systems | NL648R | Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry |
Anti-E-Cadherin | R & D Systems | MAB1838 | Used at 0.1 μg/ml for western blotting |
Anti-Fibronectin | R & D Systems | MAB1918 | Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting |
Anti-GAPDH | R & D Systems | AF5718 | Used at 0.2 μg/ml for western blotting |
Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody | R & D Systems | NL009 | Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry |
Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF109 | Used at 1:2000 for western blotting |
Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF007 | Used at 1:2000 for western blotting |
EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit | R & D Systems | SC026 | Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail. |
96 Well BME Cell Invasion Assay | R & D Systems | 3455-096-K | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations. |
Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit | R & D Systems | ARY002B | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations19. |
Mounting Media | R & D Systems | CTS011 | |
0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15350-061 | |
1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
95% Ethanol | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
Triton-X-100 | Roche Molecular Biochemicals | 789-704 | Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration. |
DAPI Solution | Sigma | D9542 | Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS. |
Fine pointed curved forceps | Thermo-Fisher Scientific | 08-875 | |
12 mm coverslips | Carolina Biological | 633009 | |
Nonfat dry milk | Used at 5% in TBST for blocking in western blotting | ||
TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] | For western blotting blocking and washing | ||
PVDF Membrane | For western blotting | ||
4-20% SDS-page gel | For western blotting | ||
ECL substrate | For western blotting | ||
15 ml conical tubes | |||
Plates/flasks, tissue culture treated | |||
24-well plates, tissue culture treated | |||
Pipettes / pipette tips | |||
Pipet Aid / pipets | |||
Hemocytometer | |||
37 °C Water Bath | |||
37 °C/5%CO2 Incubator | |||
Centrifuge | |||
Inverted light microscope | |||
Fluorescence microscope |