Простой способ описан для индукции эпителиальных к мезенхимальных перехода (EMT) в различных типах клеток. Методы анализа клеток в штатах ЕМТ по иммуноцитохимии включены.
Эпителиальный в мезенхимальных перехода (EMT) является жизненно необходимым для формообразования во время развития. Misregulation этого процесса была вовлечена как ключевое событие в фиброза и прогрессировании рака на метастатической стадии. Понимание процессов, лежащих в основе EMT важно для ранней диагностики и клинической контроля этих болезненных состояний. Расписание индукция ЕМТ в пробирке является полезным инструментом для открытия новых лекарств, а также для выявления общих подписей экспрессии генов для диагностических целей. Здесь показано, простой способ индукции ЕМТ в различных типах клеток. Методы анализа клеток до и индукционных после ЕМТ по иммуноцитохимии также включены. Кроме того, мы демонстрируем эффективность этого метода через основе антител анализа массива и миграция / вторжения анализов.
Эпителиальный в мезенхимальных перехода (EMT) является процесс, при котором поляризованная эпителиальных клеток претерпевает различные изменения, связанные в очень подвижных, фибробласту мезенхимальных клетки. Этот процесс происходит, в частности, путем внесения изменений экспрессии генов и деградации слипчивых соединений, что приводит к увеличению способности к миграции и вторгнуться. Физиологически, ЕМТ играет важную роль во время эмбрионального развития и заживления ран. Потеря должного контроля за EMT может привести к фиброза и метастазирование карциномы 1,2.
Снижение Е-кадгерина на поверхности эпителиальных клеток является важным шагом в прогрессии клетки через ЕМТ 3,4. Е-кадгерин является однопроходный трансмембранный белок, который непосредственно взаимодействует с кадгеринов белков на соседние ячейки. В дополнение к своей роли в клеточной адгезии, Е-кадгерин влияния клеток сигнализации через взаимодействий между цитоплазматическим хвостом E-кадгерина апда разнообразие регуляторных белков, в частности β-катенин. β-катенин играет роль в стабилизации слипчивых соединений. Во время канонической передачи сигналов Wnt, β-катенин освобождается от Е-кадгерина и перемещаться в ядро, где он выступает в качестве нижнего транскрипционного фактора в пути 3,4,5 Wnt. В ядре β-катенин как было показано, увеличивают транскрипцию нескольких ЕМТ, связанных с факторами, включая кручение, Slug, фибронектин, и разнообразие матричных металлопротеаз 3,6.
В дополнение к Wnts, TGF-β сигнализации было показано, играют важную роль в индукции ЕМТ как во время нормального развития и в пораженных государств 7,8,9. TGF-β участвует в EMT, которая происходит во время формирования неба и в развивающемся сердце 10. Он также участвует в фиброза и в прогрессии рака в метастазирования 7.
Процедура, описанная здесь прovides соответствует индукция ЕМТ в различных типах клеток без необходимости генетических манипуляций. Эта процедура использует коктейль из Е-кадгерина, SFRP-1, и Dkk-1 блокирующие антитела и Wnt-5a и TGF-β1 рекомбинантные белки. Этот коктейль предназначен для блокировки E-кадгерина на основе адгезии при одновременном повышении Wnt и TGF-β сигнализации. Возможность для надежной индукции EMT имеет решающее значение для понимания биологии этого процесса и как манипулировать его в терапевтических целях. Текущие общие маркеры EMT, Е-кадгерин (подавляется в EMT) и Виментин (активируется в EMT), можно найти совместное выражается в раковых и таким образом не обеспечивают лучшие диагностические маркеры потенциальных метастатических клеток 12. Важно отметить, что анализ различных типов клеток, которые подверглись EMT полезно разработать общие подписей экспрессии генов, которые могут быть использованы для диагностических целей в рака и фиброза 11. Кроме того, недавние исследования показали, что EMT может играть определенную роль в формировании раковых стволовых клеток, предполагая, что клетки, которые подверглись EMT могут быть полезны для скрининга лекарственных средств для идентификации соединений, которые могут ориентироваться эти клетки 13.
Предыдущие методы индукции ЕМТ, как правило, используется TGF-β стимуляции или генетической модификации. Хотя один TGF-β, как было показано, чтобы вызвать EMT в некоторых типах клеток, в настоящее время было показано, что TGF-β является необходимым для ЕМТ, но это не является достаточным во всех типах клеток 6,14. Использование генетической модификации для индукции ЕМТ занимает много времени и трудоемким. Описанный здесь метод использует комбинацию факторов, включая, анти-Е-кадгерина человека, против человеческого SFRP-1, антитела против человеческого Dkk-1, рекомбинантный человеческий Wnt-5a и рекомбинантного человеческого TGF-β1, чтобы надежно индуцировать EMT. Такое сочетание факторов предназначен для блокировки E-кадгерина на основе адгезии имеет решающее значение для индукции EMT 4, и повышения Wnt сигнализации, добавив белок Wnt-5a, а также использовать блокирующие антитела к ингибиторам Wnt, SFRP-1 и Dkk -1. Wnt и TGF-β сигнализации, как было показано действовать аутокринным петли, чтобы вызвать и поддерживать мезенхимальных клеток стате 6. Этот метод индукции позволяет избежать генетических манипуляций и является более эффективным, чем использование в одиночку TGF-β. Важно отметить, что мы в состоянии наблюдать индукцию ЕМТ в типах клеток, в том числе MCF7 и PANC-1 клеток, которые были ранее показанного не отвечать исключительно для TGF-β стимуляции (рис. 5) 14.
Клетки, обработанные с ЕМТ Склонение Медиа Дополнение шоу менее компактный и увеличился веретенообразный морфологии (рис. 1). Кроме того, есть уменьшение поверхностного E-кадгерина экспрессии пересекаются с увеличением экспрессии фибронектина, которые являются отличительными признаками ЕМТ (фиг.2 и 3). Дополнительные маркеры мезенхимальных такие как виментин и Улитка также активируется в ЕМТ индуцированных клеток, как по сравнению с неиндуцированных управления (рис. 4). Увеличение миграции и вторжения способности являются основными функциональные характеристики мезенхимальных клеток. В в пробирке </em> Миграция и вторжения анализы, клетки, обработанные дополнения ЕМТ Склонение СМИ продемонстрировали значительно повышенную способность к миграции и вторгнуться (рис. 6).
Этот простой метод для индукции ЕМТ полезно для изучения сигнализации EMT, как показано, используя данные выражения массива антитела, показанные на рисунке 7. Различные типы клеток можно сравнить до и после индукции ЕМТ, чтобы получить общие подписей экспрессии, связанные с ЕМТ, такие как увеличение фосфорилированного CREB и ERK1 / 2, видимый на обеих MCF7 и А549 ЕМТ-индуцированной клеток. S133 фосфорилирование CREB из стимулирует ДНК-связывающие и было показано, действуют на выходе TGF-β1-индуцированную EMT 15. ERK1 / 2 фосфорилирование Также было показано действовать ниже по потоку от TGF-β1-индуцированную EMT 16. Различия в сигнальные пути между типами клеток также можно пояснить, как видно с увеличением ГСК-3β фосфорилирования в клетках А549 против p70S6К фосфорилирования в MCF7. ГСК-3β фосфорилирования в серин 9 уменьшается его функции, и GSK-3β было показано, ингибируют фактор транскрипции про-EMT, Улитка 17. В противоположность этому, p70S6K индуцирует активность улитки и его фосфорилирование связано с активацией этого белка 18.
В целом, простым и надежным индукция EMT, особенно в клетках ранее показанных не отвечать исключительно для TGF-β, полезно для понимания биологии EMT, выявления общих подписей экспрессии для использования в качестве прогностических маркеров, и разработки и оценки новые терапии для рака и фиброз.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы выразить признательность Юлии Hatler и Мартин Рамсден (R & D Systems) за полезные обсуждения и рецензированию рукописей.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Epithelial cells of interest | We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1 | ||
EMT Inducing Media Supplement | R & D Systems | CCM017 | |
Recombinant Human TGF-β1 | R & D Systems | 240-B | Used at 10ng/ml |
Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody | R & D Systems | NL648R | Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry |
Anti-E-Cadherin | R & D Systems | MAB1838 | Used at 0.1 μg/ml for western blotting |
Anti-Fibronectin | R & D Systems | MAB1918 | Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting |
Anti-GAPDH | R & D Systems | AF5718 | Used at 0.2 μg/ml for western blotting |
Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody | R & D Systems | NL009 | Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry |
Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF109 | Used at 1:2000 for western blotting |
Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF007 | Used at 1:2000 for western blotting |
EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit | R & D Systems | SC026 | Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail. |
96 Well BME Cell Invasion Assay | R & D Systems | 3455-096-K | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations. |
Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit | R & D Systems | ARY002B | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations19. |
Mounting Media | R & D Systems | CTS011 | |
0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15350-061 | |
1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
95% Ethanol | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
Triton-X-100 | Roche Molecular Biochemicals | 789-704 | Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration. |
DAPI Solution | Sigma | D9542 | Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS. |
Fine pointed curved forceps | Thermo-Fisher Scientific | 08-875 | |
12 mm coverslips | Carolina Biological | 633009 | |
Nonfat dry milk | Used at 5% in TBST for blocking in western blotting | ||
TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] | For western blotting blocking and washing | ||
PVDF Membrane | For western blotting | ||
4-20% SDS-page gel | For western blotting | ||
ECL substrate | For western blotting | ||
15 ml conical tubes | |||
Plates/flasks, tissue culture treated | |||
24-well plates, tissue culture treated | |||
Pipettes / pipette tips | |||
Pipet Aid / pipets | |||
Hemocytometer | |||
37 °C Water Bath | |||
37 °C/5%CO2 Incubator | |||
Centrifuge | |||
Inverted light microscope | |||
Fluorescence microscope |