En grei metode er beskrevet for indusering av epiteliale til mesenchymale overgang (EMT) i en rekke celletyper. Metoder for analyse av celler i EMT statene etter immunocytochemistry er inkludert.
Epitelial til mesenchymale overgang (EMT) er avgjørende for riktig morphogenesis under utvikling. Misregulation av denne prosessen har vært implisert som en nøkkel hendelse i fibrose og progresjon av karsinomer til en metastatisk tilstand. Forstå prosessene som ligger til grunn EMT er avgjørende for tidlig diagnostisering og klinisk kontroll av disse sykdomstilstander. Pålitelig induksjon av EMT in vitro er et nyttig verktøy for medisiner, samt å identifisere felles genekspresjonssignaturene for diagnostiske formål. Her vi vise en grei metode for induksjon av EMT i en rekke celletyper. Metoder for å analysere celler pre-og post-EMT induksjon av immunocytokjemi er også inkludert. I tillegg har vi demonstrere effektiviteten av denne fremgangsmåte gjennom antistoffbaserte matriseanalyse og migrering / invasjons assays.
Epithelial til mesenchymale overgang (EMT) er den prosess hvor en polarisert epitel celle gjennomgår en rekke forandringer som resulterer i en meget bevegelige, fibroblast-lignende mesenchymale celle. Denne prosessen skjer, delvis gjennom genekspresjon endringer og nedbrytningen av adherens knutepunkter, noe som resulterer i en økt evne til å migrere og invadere. Fysiologisk, EMT spiller viktige roller under embryonal utvikling og sårtilheling. Tap av riktig kontroll over EMT kan føre til fibrose og metastase av karsinomer 1,2.
Reduksjonen av E-cadherin på overflaten av epitelceller er et kritisk trinn i utviklingen av en celle gjennom EMT 3,4. E-cadherin er en single-pass transmembrane protein som direkte samhandler med cadherin proteiner på tilstøtende celler. I tillegg til sin rolle i celle adhesjon, E-cadherin påvirkninger cellesignalisering via interaksjoner mellom cytoplasma halen av E-cadherin enda rekke regulatoriske proteiner, spesielt β-catenin. β-catenin spiller en rolle i stabilisering av adherens veikryss. Under kanoniske Wnt signalering, er β-catenin løslatt fra E-cadherin og translocated til kjernen hvor det fungerer som en nedstrøms transkripsjonsfaktor i Wnt veien 3,4,5. I kjernen, har β-catenin har vist seg å øke transkripsjon av flere EMT-relaterte faktorer, inkludert Twist, Slug, Fibronectin, og en rekke av matriks-metallproteaser 3,6.
I tillegg til Wnts har TGF-β signale vist seg å spille en betydelig rolle i EMT induksjon både under normal utvikling og i syke tilstander 7,8,9. TGF-β er involvert i EMT som oppstår under gane dannelse og i å utvikle hjerte 10.. Det har også vært implisert i fibrosis og cancer i progresjon til metastase 7..
Fremgangsmåten som beskrives her provides konsistent induksjon av EMT i en rekke celletyper, uten behov for genetisk manipulering. Denne fremgangsmåten benytter en blanding av E-cadherin, sFRP-1, og Dkk-1-blokkerende antistoffer og Wnt-5a-og TGF-β1 rekombinante proteiner. Dette cocktail er utformet for å blokkere E-cadherin basert adhesjon og samtidig forbedre Wnt og TGF-β-signalering. Muligheten for robust EMT induksjon er avgjørende for forståelsen av biologien til denne prosessen og å manipulere den for terapeutiske formål. Nåværende vanlig markører av EMT, E-cadherin (downregulated i EMT) og vimentin (oppregulert i EMT), kan bli funnet co-uttrykt i kreft, og dermed ikke gir de beste diagnostiske markører av potensielle metastatisk celler 12. Viktigere er det nyttig å utvikle felles genekspresjon signaturer som kan brukes for diagnostiske formål innen cancer og fibrose 11 analyse av en rekke celletyper som har gjennomgått EMT. I tillegg har nyere studier vist at EMT kan spille en rolle i dannelsen av kreft stamceller, noe som tyder på at celler som har gjennomgått EMT kan være nyttig for legemiddel screening for å identifisere forbindelser som kan målrette disse cellene 13..
Tidligere metoder for EMT induksjon har generelt brukt TGF-β stimulering eller genetisk modifisering. Selv om TGF-β alene har vist seg å indusere EMT i visse celletyper, er det nå blitt vist at TGF-β er nødvendig for EMT, men det er ikke tilstrekkelig i alle celletyper 6,14. Ved hjelp av genmodifisering for EMT induksjon er tidkrevende og arbeidskrevende. Fremgangsmåten er beskrevet her anvender en kombinasjon av faktorer, inkludert, anti-human E-cadherin, anti-humant sFRP-1, anti-humant Dkk-1, rekombinant human Wnt-5a, og rekombinant human TGF-β1 for pålitelig å indusere EMT. Denne kombinasjon av faktorer som er utformet for å blokkere E-cadherin basert adhesjon, et kritisk trinn for EMT induksjon 4 og forbedre Wnt signalering ved å tilsette Wnt-5a protein, så vel som ved hjelp av blokkerende antistoffer mot Wnt inhibitorer, sFRP-1 og Dkk -1. Wnt og TGF-β-signalering har vist seg å virke på en autokrin sløyfe for å innføre og holde mesenchymale celler statistiskee 6. Denne metode unngår induksjon genmanipulering og er mer effektivt enn å bruke TGF β-alene. Viktigere, er vi i stand til å observere induksjon av EMT i celletyper, inkludert MCF7 og PANC-1-celler, som tidligere har blitt vist seg å ikke svare utelukkende til TGF-β stimulering (figur 5) 14.
Celler behandlet med EMT Induksjon Media Supplement vis mindre kompakt og økt spindelformet morfologi (fig. 1). I tillegg er det en reduksjon i overflate E-cadherin ekspresjon samtidig med en økning i Fibronectin uttrykk, som er kjennetegn for EMT (fig. 2 og 3). Ekstra markører mesenchymale som vimentin og Snail er også oppregulert ved EMT induserte celler i forhold til uninduced kontroller (figur 4). Økte migrasjon og invasjon evner er de viktigste funksjonelle egenskapene til mesenchymalceller. I in vitro </em> Migrering og invasjon assays, celler behandlet med EMT Induksjon Media Supplement viste en betydelig økt kapasitet til å migrere og invadere (figur 6).
Denne enkle metode for EMT induksjon er anvendelige for studium av EMT signalering som påvist ved hjelp av antistoffmatriseuttrykk data som er vist i figur 7. Forskjellige celletyper kan sammenlignes før og etter-EMT induksjon for å oppnå vanlige ekspresjonssystemer signaturer assosiert med EMT, slik som økning av fosforylert CREB og ERK1 / 2 sett i både MCF7-og A549 EMT-induserte celler. S133 fosforylering av CREB stimulerer DNA binding og har blitt vist å virke på nedstrømssiden av TGF-β1-indusert EMT 15. ERK1 / 2 fosforyleringen har også vist seg å virke på nedstrømssiden av TGF-β1-indusert EMT 16. Forskjeller i signalveier mellom cellene typer kan også bli belyst som sett med økningen i GSK-3β fosforylering i A549-celler versus p70S6K fosforylering i MCF7. GSK 3β-fosforylering ved serin 9 senker det funksjon, og GSK-3β har blitt vist å hemme pro-EMT transkripsjonsfaktor, sneglen 17. I motsetning til dette induserer p70S6K snegle-aktivitet og fosforylering er assosiert med aktivering av dette proteinet 18..
Generelle, enkel og pålitelig induksjon av EMT, spesielt i celler som tidligere vist for ikke å svare bare til TGF-β, er nyttig for å forstå biologien til EMT, identifisere felles uttrykk signaturer for anvendelse og prognostiske markører, og utvikling og evaluering av nye behandlingsformer for cancer , og fibrotisk sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Julia Hatler og Martin Ramsden (R & D Systems) for nyttig diskusjon og manuskript vurdering.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Epithelial cells of interest | We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1 | ||
EMT Inducing Media Supplement | R & D Systems | CCM017 | |
Recombinant Human TGF-β1 | R & D Systems | 240-B | Used at 10ng/ml |
Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody | R & D Systems | NL648R | Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry |
Anti-E-Cadherin | R & D Systems | MAB1838 | Used at 0.1 μg/ml for western blotting |
Anti-Fibronectin | R & D Systems | MAB1918 | Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting |
Anti-GAPDH | R & D Systems | AF5718 | Used at 0.2 μg/ml for western blotting |
Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody | R & D Systems | NL009 | Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry |
Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF109 | Used at 1:2000 for western blotting |
Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF007 | Used at 1:2000 for western blotting |
EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit | R & D Systems | SC026 | Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail. |
96 Well BME Cell Invasion Assay | R & D Systems | 3455-096-K | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations. |
Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit | R & D Systems | ARY002B | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations19. |
Mounting Media | R & D Systems | CTS011 | |
0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15350-061 | |
1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
95% Ethanol | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
Triton-X-100 | Roche Molecular Biochemicals | 789-704 | Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration. |
DAPI Solution | Sigma | D9542 | Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS. |
Fine pointed curved forceps | Thermo-Fisher Scientific | 08-875 | |
12 mm coverslips | Carolina Biological | 633009 | |
Nonfat dry milk | Used at 5% in TBST for blocking in western blotting | ||
TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] | For western blotting blocking and washing | ||
PVDF Membrane | For western blotting | ||
4-20% SDS-page gel | For western blotting | ||
ECL substrate | For western blotting | ||
15 ml conical tubes | |||
Plates/flasks, tissue culture treated | |||
24-well plates, tissue culture treated | |||
Pipettes / pipette tips | |||
Pipet Aid / pipets | |||
Hemocytometer | |||
37 °C Water Bath | |||
37 °C/5%CO2 Incubator | |||
Centrifuge | |||
Inverted light microscope | |||
Fluorescence microscope |