En enkel fremgangsmåde er beskrevet til induktion af epitelial til mesenkymale overgang (EMT) i en række celletyper. Metoder til analyse af celler i EMT tilstande ved immuncytokemi er inkluderet.
Epitelial til mesenkymale overgang (EMT), er afgørende for korrekt morfogenese under udviklingen. Misregulation af denne proces har været impliceret som en vigtig begivenhed i fibrose og progression af carcinomer til et metastatisk tilstand. Forståelse af de processer, der ligger til grund for EMT er bydende nødvendigt for tidlig diagnosticering og klinisk kontrol af disse sygdomstilstande. Pålidelig induktion af EMT in vitro er et nyttigt redskab for lægemiddelforskning, samt at identificere fælles genekspression underskrifter til diagnostiske formål. Her vi demonstrere en enkel metode til induktion af EMT i en række forskellige celletyper. Metoder til analyse af celler præ-og post-EMT induktion med immuncytokemi er også inkluderet. Desuden har vi demonstrere effektiviteten af denne metode gennem antistof-baserede array analyse og migration / invasion assays.
Epitelial til mesenkymale overgang (EMT) er den proces, hvorved en polariseret epitelcelle undergår en række forandringer, som resulterer i en meget bevægelige, fibroblast-lignende mesenchymal celle. Denne proces sker dels via genekspression ændringer og nedbrydningen af adherens vejkryds, hvilket resulterer i en øget evne til at migrere og invadere. Fysiologisk EMT spiller vigtige roller under fosterudviklingen og sårheling. Tab af en ordentlig kontrol over EMT kan føre til fibrose og metastasering af karcinomer 1,2.
Reduktionen af E-cadherin på overfladen af epitelceller er et kritisk trin i udviklingen af en celle gennem EMT 3,4. E-cadherin er en single-pass transmembrane protein, der interagerer direkte med cadherin proteiner på tilstødende celler. Ud over dets rolle i celleadhæsion, E-cadherin påvirkninger cellesignalerende via interaktioner mellem den cytoplasmatiske hale af E-cadherin enda forskellige regulatoriske proteiner, især β-catenin. β-catenin spiller en rolle i stabiliseringen af adherens vejkryds. Under kanoniske Wnt signalering, er β-catenin frigivet fra E-cadherin og translokeres til kernen, hvor det virker som en nedstrøms transkriptionsfaktor i Wnt pathway 3,4,5. I kernen, har β-catenin vist sig at øge transkriptionen af flere EMT-relaterede faktorer, herunder Twist, Slug, fibronectin, og en række af matrixmetalloproteaser 3,6.
Ud over Wnts har TGF-β-signalering vist sig at spille en væsentlig rolle i EMT induktion både under normal udvikling og i sygdomstilstande 7,8,9. TGF-β er involveret i EMT, der opstår under ganen dannelse og i udviklingslandene hjerte 10. Det har også været impliceret i fibrose og cancer progression til metastase 7.
Den her beskrevne PR-procedureovides ensartet induktion af EMT i en række forskellige celletyper uden behov for genetisk manipulation. Denne procedure bruger en cocktail af E-cadherin, sFRP-1, og DKK 1 blokerende antistoffer og Wnt-5a og TGF-β1 rekombinante proteiner. Denne cocktail er designet til at blokere E-cadherin-baserede vedhæftning samtidig fremme Wnt og TGF-β-signalering. Muligheden for robust EMT induktion er afgørende for at forstå biologi denne proces, og hvordan man kan manipulere det til terapeutiske formål. Nuværende fælles markører for EMT, E-cadherin (nedreguleret i EMT) og Vimentin (opreguleret i EMT), kan findes co-udtrykt i kræft, og dermed ikke giver den bedste diagnostiske markører af potentielle metastatiske celler 12. Vigtigere er det, at analysen af en række celletyper, der har gennemgået EMT er nyttigt at udvikle fælles genekspression signaturer, der kan anvendes til diagnostiske formål i kræft og fibrose 11. Derudover har de seneste undersøgelser vist, at EMT kan spille en rolle i dannelsen af kræft stamceller, hvilket tyder på, at celler, der har undergået EMT kan være nyttige for lægemiddel-screening til at identificere forbindelser, der kan målrette disse celler 13.
Tidligere metoder til EMT induktion har generelt anvendt TGF-β stimulering eller gensplejsning. Skønt TGF-β alene har vist sig at inducere EMT i nogle celletyper, er det nu blevet vist, at TGF-β er nødvendig for EMT, men det er ikke tilstrækkeligt i alle celletyper 6,14. Brug genetisk modifikation for EMT induktion er tidskrævende og arbejdskrævende. Den her beskrevne metode anvender en kombination af faktorer, herunder, anti-human E-cadherin, anti-human sFRP-1, anti-human Dkk-1, rekombinant humant Wnt-5a og rekombinant human TGF-β1 til pålideligt fremkalde EMT. Denne kombination af faktorer er designet til at blokere e-cadherin-baserede friktion, et afgørende skridt for EMT induktion 4 og forbedre Wnt signalering ved at tilføje Wnt-5a protein samt bruge blokerende antistoffer til Wnt-hæmmere, sFRP-1 og Dkk -1. Wnt og TGF-β-signalering har vist sig at virke i en autokrin sløjfe til at inducere og vedligeholde mesenchymale celler state 6. Denne induktion metode undgår genmanipulation og er mere effektiv end anvendelse af TGF-β alene. Vigtigere er det, vi er i stand til at observere induktion af EMT i celletyper, herunder MCF7 og PANC-1-celler, som tidligere har vist sig ikke alene at reagere på TGF-β stimulation (figur 5) 14.
Celler behandlet med EMT Inducing Media Supplement show mindre kompakt og øget spindelformet morfologi (figur 1). Derudover er der et fald i overfladen E-cadherinekspression samtidig med en stigning i fibronectin udtryk, som er kendetegnende for EMT (fig. 2 og 3). Yderligere mesenchymale markører, såsom vimentin og sneglen er også opreguleret i EMT inducerede celler sammenlignet med ikke-inducerede kontroller (figur 4). Øget migration og invasion evner er de vigtigste funktionelle egenskaber mesenchymalceller. I in vitro </em> Migration og invasion assays celler behandlet med EMT Inducing Media Supplement påvist en signifikant øget kapacitet til at migrere og invadere (figur 6).
Denne simple metode til EMT induktion er nyttig til undersøgelse af EMT signalering som påvist ved hjælp af antistof-array expression i figur 7 viste. Forskellige celletyper kan sammenlignes præ-og post-EMT induktion at opnå fælles udtryk signaturer forbundet med EMT, såsom en stigning i phosphoryleret CREB og ERK1 / 2 ses i både MCF7-og A549 EMT-inducerede celler. S133 phosphorylering af CREB stimulerer DNA-binding og er blevet vist at virke nedstrøms for TGF-β1-inducerede EMT 15. ERK1 / 2 phosphorylering er også blevet vist at virke nedstrøms for TGF-β1-inducerede EMT 16. Forskelle i signalveje blandt celletyper kan også blive belyst som set med stigningen i GSK-3β fosforylering i A549 celler versus p70S6K phosphorylering i MCF7. GSK-3β phosphorylering ved serin 9 reducerer den funktion, og GSK-3β er blevet vist at inhibere pro-EMT transkriptionsfaktor sneglen 17. I modsætning hertil p70S6k inducerer sneglen aktivitet og phosphorylering er forbundet med aktivering af dette protein 18.
Samlet set ligetil og pålidelig induktion af EMT, især i cellerne tidligere har vist ikke at reagere alene på TGF-β, er nyttigt for forståelsen af biologi EMT, identificere fælles udtryk signaturer til brug som prognostiske markører, samt udvikling og evaluering af nye lægemidler til behandling af kræft og fibrotisk sygdom.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Julia Hatler og Martin Ramsden (R & D Systems) for nyttige drøftelser og manuskript gennemgang.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Epithelial cells of interest | We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1 | ||
EMT Inducing Media Supplement | R & D Systems | CCM017 | |
Recombinant Human TGF-β1 | R & D Systems | 240-B | Used at 10ng/ml |
Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody | R & D Systems | NL648R | Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry |
Anti-E-Cadherin | R & D Systems | MAB1838 | Used at 0.1 μg/ml for western blotting |
Anti-Fibronectin | R & D Systems | MAB1918 | Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting |
Anti-GAPDH | R & D Systems | AF5718 | Used at 0.2 μg/ml for western blotting |
Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody | R & D Systems | NL009 | Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry |
Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF109 | Used at 1:2000 for western blotting |
Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF007 | Used at 1:2000 for western blotting |
EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit | R & D Systems | SC026 | Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail. |
96 Well BME Cell Invasion Assay | R & D Systems | 3455-096-K | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations. |
Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit | R & D Systems | ARY002B | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations19. |
Mounting Media | R & D Systems | CTS011 | |
0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15350-061 | |
1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
95% Ethanol | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
Triton-X-100 | Roche Molecular Biochemicals | 789-704 | Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration. |
DAPI Solution | Sigma | D9542 | Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS. |
Fine pointed curved forceps | Thermo-Fisher Scientific | 08-875 | |
12 mm coverslips | Carolina Biological | 633009 | |
Nonfat dry milk | Used at 5% in TBST for blocking in western blotting | ||
TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] | For western blotting blocking and washing | ||
PVDF Membrane | For western blotting | ||
4-20% SDS-page gel | For western blotting | ||
ECL substrate | For western blotting | ||
15 ml conical tubes | |||
Plates/flasks, tissue culture treated | |||
24-well plates, tissue culture treated | |||
Pipettes / pipette tips | |||
Pipet Aid / pipets | |||
Hemocytometer | |||
37 °C Water Bath | |||
37 °C/5%CO2 Incubator | |||
Centrifuge | |||
Inverted light microscope | |||
Fluorescence microscope |