Ett enkelt förfarande beskrivs för induktion av epitelial till mesenkymala övergång (EMT) i en mängd olika celltyper. Metoder för analys av celler i EMT stater genom immuncytokemi ingår.
Epitelceller till mesenkymala övergång (EMT) är nödvändig för korrekt morfogenes under utveckling. Felaktig reglering av denna process har varit inblandad som en viktig händelse i fibros och progression av cancer till en metastaserande tillstånd. Att förstå de processer som ligger bakom EMT är absolut nödvändigt för tidig diagnos och klinisk kontroll av dessa sjukdomstillstånd. Pålitlig induktion av EMT in vitro är ett användbart verktyg för läkemedelsutveckling samt att identifiera gemensamma genuttryck signaturer för diagnostiska ändamål. Här visar vi en enkel metod för induktion av EMT i en mängd olika celltyper. Metoder för analys av celler före och efter-EMT induktion genom immuncytokemi ingår också. Dessutom visar vi hur effektiv denna metod genom antikroppsbaserad array analys och migration / invasion analyser.
Epitelceller till mesenkymala övergång (EMT) är den process genom vilken en polariserad epitelceller genomgår en rad olika förändringar som resulterar i en mycket rörlig, fibroblast-liknande mesenkymala celler. Denna process sker delvis genom genuttryck förändringar och nedbrytningen av adherensgränssnitten korsningar, vilket resulterar i en ökad förmåga att migrera och invadera. Fysiologiskt, EMT spelar viktiga roller under embryonal utveckling och sårläkning. Förlust av ordentlig kontroll över EMT kan leda till fibros och metastasering av cancer 1,2.
Reduktionen av E-cadherin på ytan av epitelceller är ett kritiskt steg i framskridandet av en cell genom EMT 3,4. E-cadherin är en enkelpasstransmembranprotein som direkt interagerar med cadherin proteiner på angränsande celler. Utöver sin roll i celladhesion, E-cadherin influenser cellsignaler via interaktion mellan den cytoplasmatiska svansen av E-cadherin enda olika regulatoriska proteiner, främst β-catenin. β-catenin spelar en roll i stabiliseringen av adherensgränssnitten korsningar. Under canonical Wnt-signalering, är β-catenin frigörs från E-cadherin och translokeras till cellkärnan där den verkar som en nedströms transkriptionsfaktor i Wnt banan 3.4.5. I kärnan, har β-catenin visats öka transkriptionen av flera EMT relaterade faktorer inklusive Twist, Slug, fibronektin, och en mängd matrismetalloproteaser 3,6.
Förutom Wnts har TGF-β signalering visats spela en betydande roll i EMT induktion både under normal utveckling och i sjukdomstillstånd 7,8,9. TGF-β är involverad i EMT som inträffar under gommen bildning och i framkallnings hjärta 10. Det har också varit inblandad i fibros och i cancer progression till metastaser 7.
Det förfarande som beskrivs här provides konsekvent induktion av EMT i en mängd olika celltyper utan behov av genmanipulation. Denna procedur använder en cocktail av E-cadherin, sFRP-1, och Dkk-1-blockerande antikroppar och Wnt-5a och TGF-β1 rekombinanta proteiner. Denna cocktail är utformad för att blockera E-cadherin-baserade vidhäftning samtidigt förbättra Wnt och TGF-β signalering. Möjligheten för robust EMT induktion är avgörande för att förstå biologin av denna process och hur man manipulerar den för terapeutiska syften. Nuvarande gemensamma markörer för EMT, E-cadherin (nedregleras i EMT) och Vimentin (uppregleras i EMT), finns co-uttrycks i cancer och därmed inte ger den bästa diagnostiska markörer för potentiella metastaserande celler 12. Viktigt är att analysera en mängd olika celltyper som genomgått EMT användbart att utveckla gemensamma genuttryck signaturer som kan användas för diagnostiska ändamål i cancer och fibros 11. Dessutom har nya studier visat att EMT kan spela en roll i bildandet av cancer stamceller, vilket tyder på att celler som har genomgått EMT kan vara användbara för läkemedelsscreening för att identifiera föreningar som kan rikta dessa celler 13.
Tidigare metoder för EMT induktion har generellt använt TGF-β stimulering eller genetisk modifiering. Fastän TGF-β ensamt har visat sig inducera EMT i vissa celltyper, har det nu visats att TGF-β är nödvändigt för EMT, men det är inte tillräckligt i alla celltyper 6,14. Med hjälp av genetisk modifiering för EMT induktion är tidsödande och arbetsintensivt. Den metod som beskrivs här använder en kombination av faktorer innefattande anti-human-E-cadherin, anti-human sFRP-1, anti-human Dkk-1, rekombinant human Wnt-5a, och rekombinant humant TGF-β1 att tillförlitligt inducerar EMT. Denna kombination av faktorer är utformad för att blockera E-cadherin-baserad adhesion, ett kritiskt steg för EMT induktion 4, och öka Wnt signalering genom att lägga till Wnt-5a-proteinet samt använda blockerande antikroppar till Wnt-hämmare, sFRP-1 och Dkk -1. Wnt-och TGF-β-signalering har visats för att agera i en autokrin loop för att inducera och upprätthålla den mesenkymala cell STATe 6. Denna induktion metod undviker genetisk manipulation och är mer effektivt än att använda TGF-β ensam. Huvudsakligen har vi möjlighet att observera induktion av EMT i celltyper, inklusive MCF7 och PANC-1-celler, som tidigare har visat att inte bara svara på TGF-β stimulering (Figur 5) 14.
Celler behandlade med EMT Induktion Media Supplement show mindre kompakt och ökad spindel-formad morfologi (Figur 1). Dessutom finns det en minskning i ytan E-cadherin expression samtidigt med en ökning av Fibronektin uttryck, som är kännetecken för EMT (figurerna 2 och 3). Ytterligare mesenkymala markörer som Vimentin och Snail också uppregleras i EMT inducerade celler jämfört med icke-inducerade kontroller (Figur 4). Ökad migration och invasion förmågor är de viktigaste funktionella egenskaper mesenkymala celler. I in vitro- </em> Migration och invasion analyser, celler som behandlats med tillägget EMT Induktion Media visade en signifikant ökad förmåga att migrera och invadera (Figur 6).
Denna enkla metod för EMT induktion är användbar för studium av EMT-signalering såsom visas med hjälp av expressionsdata antikropp array som visas i figur 7. Olika celltyper kan jämföras före och efter-EMT induktion för att få vanliga uttryck signaturer i samband med EMT, exempelvis ökningen av fosforylerad CREB och ERK1 / 2 ses i både MCF7 och A549 EMT-inducerade celler. S133 fosforylering av CREB stimulerar DNA-bindning och har visats verka nedströms av TGF-β1-inducerad EMT 15. ERK1 / 2 fosforylering har även visats verka nedströms av TGF-β1-inducerad EMT 16. Skillnader i signalvägar mellan celltyper kan också belysas såsom ses med ökningen i GSK-3β fosforylering i A549-celler kontra p70S6K fosforylering i MCF7. GSK-3β fosforylering vid serin 9 minskar den funktion och GSK-3β har visats inhibera den pro-EMT transkriptionsfaktör, snigel 17. Däremot p70S6K inducerar Snail aktivitet och dess fosforylering är associerad med aktivering av detta protein 18.
Sammantaget, okomplicerad och pålitlig induktion av EMT, särskilt i celler som tidigare visat att inte svara enbart TGF-β, är användbara för att förstå biologin av EMT, identifiera gemensamma uttrycks signaturer för att användas som prognostiska markörer, samt utveckling och utvärdering av nya behandlingar för cancer och fibrotisk sjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka för Julia Hatler och Martin Ramsden (R & D Systems) för bra diskussioner och manuskript översyn.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Epithelial cells of interest | We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1 | ||
EMT Inducing Media Supplement | R & D Systems | CCM017 | |
Recombinant Human TGF-β1 | R & D Systems | 240-B | Used at 10ng/ml |
Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody | R & D Systems | NL648R | Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry |
Anti-E-Cadherin | R & D Systems | MAB1838 | Used at 0.1 μg/ml for western blotting |
Anti-Fibronectin | R & D Systems | MAB1918 | Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting |
Anti-GAPDH | R & D Systems | AF5718 | Used at 0.2 μg/ml for western blotting |
Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody | R & D Systems | NL009 | Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry |
Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF109 | Used at 1:2000 for western blotting |
Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF007 | Used at 1:2000 for western blotting |
EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit | R & D Systems | SC026 | Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail. |
96 Well BME Cell Invasion Assay | R & D Systems | 3455-096-K | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations. |
Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit | R & D Systems | ARY002B | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations19. |
Mounting Media | R & D Systems | CTS011 | |
0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15350-061 | |
1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
95% Ethanol | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
Triton-X-100 | Roche Molecular Biochemicals | 789-704 | Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration. |
DAPI Solution | Sigma | D9542 | Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS. |
Fine pointed curved forceps | Thermo-Fisher Scientific | 08-875 | |
12 mm coverslips | Carolina Biological | 633009 | |
Nonfat dry milk | Used at 5% in TBST for blocking in western blotting | ||
TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] | For western blotting blocking and washing | ||
PVDF Membrane | For western blotting | ||
4-20% SDS-page gel | For western blotting | ||
ECL substrate | For western blotting | ||
15 ml conical tubes | |||
Plates/flasks, tissue culture treated | |||
24-well plates, tissue culture treated | |||
Pipettes / pipette tips | |||
Pipet Aid / pipets | |||
Hemocytometer | |||
37 °C Water Bath | |||
37 °C/5%CO2 Incubator | |||
Centrifuge | |||
Inverted light microscope | |||
Fluorescence microscope |