Summary
Time-lapse mikroskopi av fluorescerande autophagy markörer medger övervakning av den dynamiska autophagy svar med hög tidsupplösning. Använda specifik autophagy och organell markörer i en kombination av tre olika färger, kan vi följa bidrag av ett protein till autophagosome bildning i en robust rumsliga och tidsmässiga sammanhang.
Abstract
Autophagy är en cellulär reaktion utlöst av brist på näringsämnen, speciellt frånvaron av aminosyror. Autophagy definieras genom bildning av dubbla membranstrukturer, som kallas autophagosomes, som sekvestrerar cytoplasman, långlivade proteiner och aggregat protein, defekta organeller, och även virus eller bakterier. Autophagosomes smälter så småningom med lysosomer som leder till bulk nedbrytning av deras innehåll, med de producerade näringsämnen återvinns tillbaka till cytoplasman. Därför är autophagy avgörande för cell homeostas, och oregelbundenhet i autophagy kan leda till sjukdom, främst neurodegeneration, åldrande och cancer.
Autophagosome formation är en mycket komplicerad process, för vilken celler har tilldelats en specifik grupp av proteiner, som kallas maskiner kärnan autophagy. Kärnan autophagy maskiner är funktionellt kompletteras med ytterligare proteiner involverade i olika cellulära processer, t.ex. i membrane handel, i mitokondrie och lysosomala biologin. Samordning av dessa proteiner för bildning och nedbrytning av autophagosomes utgör den mycket dynamiska och sofistikerade svar autophagy. Live cell imaging gör att man kan följa den molekylära bidraget från varje autophagy-relaterat protein ned till nivån av ett enda autophagosome formation händelse och i realtid, därför denna teknik erbjuder en hög temporal och spatial upplösning.
Här använder vi en cellinje stabilt uttrycker GFP-DFCP1, att upprätta en rumsliga och tidsmässiga sammanhang för vår analys. DFCP1 märken omegasomes, som är prekursor strukturer leder till autophagosomes bildning. Ett protein av intresse (POI) kan markeras med antingen en röd eller cyanfluorescerande taggen. Olika organeller, såsom ER, mitokondrier och lysosomer, är alla involverade i olika steg av autophagosome formation, och kan märkas med en specifik tracker färgämne. Time-lapse mikroskopi av AutopHagy i denna experimentella upplägg, gör att information kan extraheras om den fjärde dimensionen, dvs tid. Därför kan vi följa bidrag POI att autophagy i tid och rum.
Introduction
Autophagy är en mycket dynamisk process, som kräver samordning av ett stort antal proteiner för det slutliga resultatet av autophagosome formation 1-3. Mikroskopi är förmodligen den teknik som oftast tillämpas för att studera autophagy 4. Lokaliseringen av de flesta autophagy proteiner har studerats i fixerade celler, både av immuno-färgning av de endogena proteiner och genom uttryck av fluorescensmärkta exogena proteinet. Dessutom har elektronmikroskopi (EM), enbart och i kombination med immun-guld märkning, beskrivs de fina detaljerna i dessa strukturer 5,6. Trots att dessa tekniker har etablerat vår förståelse av autophagosome bildning i de tre dimensionerna av utrymmet, har de misslyckats med att ge tillräcklig mängd information om den 4: e dimensionen - tiden. Live cell imaging övervinner denna barriär eftersom det tillåter efter bildandet av en autophagosome så nära som möjlig till realtid 7. Denna teknik användes först för att studera autophagy av Yoshimori och kollegor 8, och har blivit allt vanligare framöver.
Time-lapse mikroskopi fångar lokalisering av POI i levande celler och över en tidsperiod. Genom att jämföra denna information med en väl karakteriserad autophagy och / eller organell markör, kan levande cell imaging analys sätta POI i större rumsliga och tidsmässiga sammanhang autophagosome formation. Live-cell imaging analys bygger på repetitiva infångandet av POI lokalisering längs alla stegen autophagosome formation, medan avbildning av fasta celler är baserad på en enda fångst. Därför kan levande cell imaging bevisa bidrag POI vid specifika steg autophagosome formation, medan avbildning av fasta celler kan bara anta rollen av POI, baserat på dess genomsnittliga lokalisering i många autophagosomes samtidigt fångade i olika skeden av deras lifecykel.
Även levande cell imaging är en metod för hög analytisk kraft, den har vissa inneboende begränsningar, vilket bör beaktas. Först av allt kräver levande cell imaging uttrycket av en eller flera exogena fluorescensmärkta proteiner. Fluorescerande markörer tenderar att vara stora i storlek och de kan ibland förändra beteendet hos ett protein på grund av steriska skäl. Denna situation accentueras för membranproteiner, som de behöver för att fungera i det begränsade utrymmet i de två dimensionerna av membran. Av notera, autophagosomes är membranstrukturer, och följaktligen deras bildning kräver ett stort antal membran-associerade proteiner.
En annan uppsättning problem är ansluten till uttryck nivåer av POI. I princip bör ett exogent protein att uttryckas vid nivåer som är jämförbara med det endogena proteinet. Detta säkerställer att viktiga regulatorer av dess sub-cellulär lokalisering inte kommer vara mättad, och the Analysen kommer att vara biologiskt relevant. Dessutom bör överuttryck av autophagy proteiner undvikas, som när de uttrycks ovan de endogena nivåerna, de tenderar att hämma autophagy respons 9. Omvänt bör eftersom expressionsnivåer av POI vara hög nog för att tillåta efter dess lokalisering för en god tid utan foto-blekning, har en kompromiss som skall uppnås. Att uppnå optimalt uttryck nivåer av ett exogent protein i däggdjur celler kräver en hel del finjusteringar, men det är möjligt genom upprättande och screening cellinjer som stabilt uttrycker olika nivåer av POI.
Den rumsliga upplösningen som kan uppnås med standard fluorescensmikroskopi är en annan begränsande faktor. Upplösning kan begränsas av ett antal skäl, men i bästa fall, kommer sidoupplösning vara runt 250 nm. Detta innebär att alla objekt separerade med ett avstånd som är mindre än detta kommer att visas ansluten (eller som en endaobjekt) och objekt som är mindre än 250 nm kommer att vara representerade i bilden större än de egentligen är. Därför bilderna bör alltid tolkas med detta i åtanke och komplementära metoder såsom EM kommer att krävas för att lösa fina ultra-strukturell detalj.
Slutligen kräver levande cell imaging inneboende utsätta en cell för ljus, eventuellt under en längre tid. Detta kan förändra de fysiologiska svaren hos en cell, ett fenomen som kallas foto-toxicitet.
Vi har framgångsrikt använt levande cell avbildning av PI3P-bindande proteinet DFCP1 att beskriva för första gången att autophagosomes härrör från PI3P-rika ringliknande strukturer benämnda omegasomes, som är i nära anslutning till ER strängarna 10,11. Vi har tydligt visat att LC3-positiva strukturer börjar bildas i nära samarbete med omegasomes. Vi föreslår här att använda en cellinje som stabilt uttrycker GFP-DFCP1 för den levande cellenavbildning av proteinet av intresse, upprättas en robust spatial och temporal ram för karakterisering av dess roll i autophagosome formation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Cellberedning
- Seed låg passage antal HEK-293T-celler som stabilt uttrycker GFP-DFCP1 på 22 täckglas mm runda, odlingsceller natten i Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM), till ett sammanflöde av 30-40% (målet för ett sammanflöde av 80% efter 2 dagar - dag för levande cell imaging).
2. Cell Transfektion
- Förbered transfektion komplex mix för varje platta, innehållande 100 ^ OptiMEM jag minskat serum-medium, 3 pl X-tremeGENE 9 DNA transfektionsreagens, och 0,5 pg av pECFP-LC3 plasmid-DNA. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned och inkubera 15 min vid rumstemperatur. [Obs: vi har upprepade gånger funnit att andra transfektionsreagens såsom Lipofectamine 2000, har en hel del toxicitet, och dessutom, de producerar fluorescerande partiklar på egen hand som stör många mikroskopitekniker.]
- Aspirera mediet från plattorna och tillsätt färsk DMEM förvärmas vid 37 ° C.
- Lägg till transfection komplexet till celler genom pipettering, inkubera celler för 24 timmar.
Tre. Cell inkubation med Organelle Marker (tillval)
- Lägg MitoTracker / Lysotracker till DMEM vid en slutlig koncentration av 75 nM, och hålla på is, i en falk rör täckt med aluminiumfolie, längs hela experimentella dagen, för att undvika exponering för ljus och repetitiva frysning och upptining cykler.
- Ta en alikvot på 2 ml av MitoTracker / Lysotracker-innehållande medium och värma upp vid 37 ° C, aspirera medium från transfekterade celler och ersätta med MitoTracker / Lysotracker-innehållande medium och inkubera celler i 30 - 60 min.
4. Framställning av inkubationskammaren för levande cell imaging (figur 1)
- Ren metall och plast O-ringar med 75% etanol och tillämpa silikonfett på kanten av metallen O-ringen.
- Använd pincett bort täckglaset från plattan och torka överskottet av mediet från undersidan av täckglaset,Undvik att blanda för mycket medium med fettet, eftersom detta kommer att öka sannolikheten för läckage.
- Låt täckglas att vila på kanten av plasten O-ringen och montera metall O-ringen på toppen av plast O-ringen, med täckglas inklämt däremellan, för att skapa en sluten kammare.
- Fyll kammare med mediet från plattan, från denna punkt och om, undvika långvarig inkubering av cellerna i DMEM-medium utan ett buffrande medel, för att förhindra förändringar i pH för att inträffa, eftersom bikarbonatbuffert systemet DMEM kräver artificiell CO 2 koncentration av 5-10% och CO 2 koncentrationen av omgivande luft är mycket lägre.
Fem. Svält Celler
- Sätt inkubationskammaren på mikroskop scenen.
- Aspirera det kompletta mediet och tvätta med 2 ml svält mediet tre gånger, för att säkerställa att inga aminosyror har förblivit från DMEM, som så småningom kommer att hämma autophagy svar; ställa intimer ON.
6. Mikroskopi
- Ett lämpligt bildsystem konfigurerat för levande cell brett fält epi-fluorescens kommer att krävas. Detta kommer typiskt att innefatta ett forsknings-grade inverterat mikroskop ram, en intensiv brett spektrum ljuskälla, speglar och filter som är specifika för det fluorescerande protein (er) / färg (er) av intresse, en hög kvalitet objektivlins, en känslig CCD / sCMOS kamera och en inkubation kammare. Alla de stora mikroskop tillverkare erbjuder kompletta brett fält system lämpligt för levande cell imaging, men det är också möjligt att hem-bygga ett system med komponenter från en mängd olika tillverkare och kontrollera den med öppen källkod såsom Micro-chef ( http: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki / ). Den viktigaste aspekten enligt vår mening är att använda ett system med hög känslighet så att expressionsnivåer av de fluorescerande reportrar kan hållas till ett minimum.
- Selecting lämpliga celler till bilden.
- Välj stora och platta celler som gör att mer autophagosome bildande händelser som ska fångas. Också välja celler som redan har börjat producera ett större antal omegasomes.
- Starta videoinspelning efter 30 min eller långt in autophagy svar, för att fånga en större kvot av autophagosome bildande händelser per video.
- Imaging.
- Använd en hög förstoring lins (100x 1,4 NA).
- Justera intensiteten av excitationsljus till 10-20% av den maximala för att förhindra foto-blekning.
- Ställ in kameran (Hamamatsu ORCA ER, pixelstorlek 6.45 pm) till 100-500 ms exponering, 2x2 binning och 100 vinst.
- Ställ in hastigheten bilden förvärvet till 1 frame var 10 sekund.
7. Skapa Montages av autophagosome Formation Händelser med ImageJ
[Detta kan göras på ett icke-systematiskt sätt genom att helt enkelt skanna sammanslagna video för eventiler av intresse, men det kan också vara systematiseras enligt nedan.]
- Öppna bildstaplar för 3 (eller 2) fångade kanaler i ImageJ / Fiji.
- Applicera grönt, rött och blått LUT (uppslagstabeller) till motsvarande kanal, slå ihop tre färger och spara.
- Från fliken Analysera, välj Verktyg> ROI manager ... > Ange, välj sedan ett slumpmässigt område definierad storlek i den första bilden i stapeln.
- Från bilden, välj duplicera, i syfte att kopiera det markerade området av stapeln.
- Från fliken Bild, väljer Staplar> Gör montage ... att skapa en trevande montage med alla bildrutor fångas. Skanna alla bildrutor i montage för en komplett autophagosome formation händelse, föra anteckningar om den första och sista bildrutan av händelsen.
- Från fliken Analysera, välj Verktyg> ROI manager ... välja samma område i den första bilden i stapeln för de andra 2 färgerna liksom för den sammanslagna färger bilden och duplicera stackar.
- Från tHan fliken Arkiv, välj Ny> Bild, och satt för bredd beroende på antalet pixlar som ursprungligen valts med ROI chef, fastställts för höjd 4 gånger höjden satt i ROI manager plus 3 bildpunkter för utrymmet mellan de tre färgerna och de samman, och satt skivor som antalet bildrutor i varje stapel.
- Från fliken Bild, väljer Staplar> Verktyg> Infoga ..., sedan in varje sub-stack ovanpå varandra, vilket lämnar utrymme för en pixel i mellan.
- Från fliken Bild, väljer Staplar> Gör montage ... att skapa ett montage börjar och slutar med den första och sista bildrutan i autophagosome fångade bildandet händelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det protokoll som beskrivs, har vi använt tidsförlopp mikroskopi för att följa lokaliseringen av GFP-märkta LC3 i en cellinje stabilt uttrycker GFP-märkta DFCP1 under autophagy inducerande förhållanden. Resultatet av detta experiment är tillfångatagandet av två serier eller högar av bilder, en från den gröna och en från den blå kanalen, motsvarande GFP-DFCP1 och CFP-LC3. Vi har vidare analyserat dessa videor med ImageJ, i syfte att skapa montage motsvarande enstaka autophagosome bildning händelser som beskrivs i protokollet avsnittet. Denna analys tillät oss att bevisa att en LC3-positiv autophagosome härstammar från en DFCP1-positiv omegasome. I det montage som visas i figur 2, blir bildandet av en omegasome framgår av den andra ramen, i form av en liten fläck. Den omegasome börjar expandera för att bilda den karaktäristiska ringen-liknande struktur, och når sin maximala diameter efter 6 minuter. Därefter startar omegasome collapsing och så småningom försvinner, efter ca 10 min. Sätta nu bildandet av LC3-positiva struktur eller autophagosome inom ramen för omegasome formation, observerar vi att autophagosome visas efter omegasome, och blir tydligt efter ca 1,5 min. Den autophagosome börjar expandera i nära samarbete med omegasome, första plats och sedan ringa, och när omegasome börjar kollapsa de autophagosome knoppar av. Så småningom autophagosome stannar bakom, uppenbarligen för att smälta samman med lysosomerna, efter omegasome försvinner. Denna analys ger en tydlig indikation om det funktionella sambandet mellan de två strukturerna, enligt vilken LC3 positiva autophagosomes härstammar från motsvarande omegasomes.
I ett annat exempel, har vi lagt till en lysosom tracker för att fånga den tidsmässiga och rumsliga sammanslutning av formande autophagosome med lysosomer (Figur 3
Emellertid kan samma typ av analys ger tolkningsbara resultat, på grund av en rad olika skäl. I exemplet som presenteras i fig. 4, blir resultaten tolkningsbara grund av en drift i fokus. Video startar framgångsrikt fånga bildandet av en autophagosome, men en drift i fokus sker efter 3 min markeringen. Den videoinspelning fortsätter ur fokus för nästa 6 minuter, men så småningom fokus manuellt korrigeras efter 9 till 10 min mark. Denna analys dock, gör det omöjligt att särskilja huruvida autophagosome formation händelsen fångades när fokus är korrigerad ärinledande händelse som nästan är klar, eller en ny som har börjat efter drift i fokus.
Ytterligare problem kan tillskrivas den konfluens av de odlade cellerna. Till exempel när celler odlas vid högre än optimal confluency, tvingas de att expandera på toppen av en intilliggande cell, vilket gör att fokus ganska utmanande. Dessutom celler som odlas på hög sammanflöde tenderar att vara stressad, ökar nivåerna av bakgrunden autophagy aktivitet före inledandet av svält.
Slutligen, fluorescens-relaterade frågor är ganska vanligt. GFP har svagare fluorescens aktivitet jämfört med GFP, och ofta blir foto-blekt i senare skeden av video erövrare. Analys av sådana filmer kan leda till falskt negativa slutsatser om den rumsliga sammanslutning av POI med bildande autophagosomes. Dock kan dessa problem lösas genom att använda någon av de varianter som mTurquise2. En annan vanlig phenomenon härrör från det faktum att fluorescensen av röda taggar inte kyles vid det lägre pH i lysosomer. Många autophagy proteiner avsluta fysiologiskt sin livscykel in i lysosomer, medan autophagosomes småningom smälta samman med lysosomer. Dessutom är icke-funktionella proteiner ofta riktade för nedbrytning i lysosomer. Därför kan man sluta efter den icke-relaterade sammanslutning av autophagosomes med lysosomer, istället för en verklig fysikalisk association av mellan en röd-taggad POI och omegasomes.
Figur 1. Inkubation kammare. Plasten O-ringen passar runt kanten av metall O-ringen och har i botten en tunn avsats som sträcker sig inåt. Den täckglas placeras på kanten av plasten O-ringen, och plast O-ringen är monterad i botten av metall O-ringen. Detta sätt, är täckglas sandwiched mellan de två O-ringarna, vilket skapar en sluten kammare.
Figur 2. Celler som uttrycker GFP-DFCP1 och CFP-LC3 fick svälta under 30 min och avbildas med en hastighet av en bild varje 10 sek. En montage av en representativ autophagosome formation händelse presenteras. Signaler från gröna och blå kanalerna är pseudo-färgad grön och röd motsvarande. Pilar indikerar den första urskiljbara omegasome och autophagosome. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Celler som uttrycker GFP-DFCP1 och GFP-LC3, inkuberades med Lysotracker röd, svalt under 30 min och avbildas med en hastighet av en ram var 15 sek. En montage av en representativ autophagosome formation händelse presenteras. Signaler från grönt, rött och blått kanaler är pseudo-färgade grön, blå och röd motsvarande. Pilar indikerar den första urskiljbara omegasome och autophagosome. Arrowhead indikerar den första fångst av autophagosome fusion med lysosomen. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Celler som uttrycker GFP-DFCP1 och CFP-LC3 fick svälta under 30 min och avbildas med en hastighet av en bild varje 10 sek. En montage av ett exempel på sub-o ptimal capture presenteras. Signaler från gröna och blå kanalerna är pseudo-färgad grön och röd motsvarande. Pilar indikerar den första urskiljbara omegasome och autophagosome. Klicka här för att visa en större bild .
Video 1. Video av autophagosome bildandet händelse presenteras i figur 2. Uppspelningen är 4 bilder per sekund. Klicka här för att se filmen .
Video 2. Video av autophagosome bildning händelsen presenteras i figur 3. Pilen anger första, bildandet av den omegasome, och för det andra den fusion av autophagosome med lysosomen. Uppspelningen är 4 bilder per sekund."> Klicka här för att se filmen.
Video 3. Video av autophagosome bildandet händelse presenteras i Figur 4. Uppspelningen är 4 bilder per sekund. Klicka här för att se filmen .
Tabell 1. Förteckning över specifika reagens och utrustning som krävs för det protokoll, tillsammans med motsvarande operatör och katalognummer.
BUFFERTAR
| Buffert | Komposition | Steg Bilar |
| Svält mediet | 20 mM HEPES pH 7,4 | 5,2 |
| 140 mM NaCl | ||
| 1 mM CaCl2 | ||
| 1 mM MgCl2 | ||
| 5 mM Glukos | ||
| 1% BSA |
Tabell 2. Förteckning över buffertar används i detta protokoll. De använda buffertar, deras sammansättning och det första steget där de används i protokollet anges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs i detta protokoll möjliggör visualisering av ett proteins lokalisering under autophagosome formation. Vi har provat olika metoder för att visualisera händelserna beskrivas inklusive punkt-konfokala, spinning disk konfokala och total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Vi har funnit att för allmänna ändamål standard brett fält epi-fluorescens ger den bästa kompromissen mellan känslighet och upplösning. Detta säkerställer god signal till brus, minimal photo-bleaching/photo-toxicity och snabba förvärv. Bristen på optiska sektionering är inte en fråga om lämpliga regioner i cellen väljs för att bild, dvs periferin där cellen sprids och platt. Det är dock viktigt att det bildgivande systemet används på rätt sätt har konfigurerats (både i fråga om den hårdvara som används och systeminställningarna).
För bästa rumslig upplösning, är det rekommenderat att använda en hög förstoring, high numerisk bländare oljeimmersion lins (vattennedsänkning linser kommer att erbjuda någon fördel avbildning på närhet till täckglas). Det föreslås att balansera belysningsstyrka (t.ex. med neutral densitet filter), kamerainställningarna (exponeringstid, binning och förstärkning) för att maximera signal-till-brus och minimerar blekning. Detta måste göras empiriskt, men som en guide när du använder en 100x 1,4 NA objektiv vi brukar minska kraften i vår exciteringsljus till 10-20% av max och ställa in kameran (Hamamatsu ORCA ER, pixelstorlek 6.45 pm) till 100-500 ms exponering, 2x2 binning och 100 vinst.
Bilden Förvärvstakten bör fastställas inom intervallet 1 bildruta varje 1-10 sek. Förvärva bilder vid högre bildfrekvens kommer att säkerställa bättre kontinuitet mellan bilder (bättre tidsupplösning) men kommer att utsätta celler till mer ljus och därmed öka photo-bleaching/photo-toxicity.
Om avbildning mer fluorescencE-kanalerna, måste det säkerställas att fördröjningen mellan kanalen capture minimeras (minska exponeringstiden, passar snabba filter växlare). Detta kommer att minska risken för rörelseartefakter som förekommer i den sammansatta bilden. Om rörelseartefakter som visar sig vara svårt att undvika att överväga att använda en bild splitter (en enhet för att underlätta samtidigt förvärvar två fluorescens kanaler med en kamera) eller en dubbel kamera adapter.
Imaging blå kanalen kräver valet av lämpliga filter och speglar för att förhindra cross-utsläppet i den blå fluorescens till den gröna kanalen. Vi har med framgång använt en Olympus CellR mikroskop, som använder Till Polychrome V belysningsanordning, möjliggör specifikt val av våglängd, bandbredd och intensitet och så är mycket flexibel. Dock är ljuskällan "läckande" med några vita ljus som kommer igenom förutom den valda wavelengths.For Därför har vi utrustat (multi) bandpass excitationsfilter ikuber, så det finns ytterligare filtrering av excitationsljuset. Följande kombination av speglar / filter användes (alla Semrock). För GFP & mCherry: Exciter FF01-479-585, Sändare FF02-525/40 (GFP) och FF01-607/36 (mCherry), kalljusreflektor Mirror FF505/606-Di01. För GFP: Exciter FF01-416/501, FF01-523/610 Sändare, kalljusreflektor Mirror FF440/520-Di01. Vi har också använt en annan CellR mikroskop, vilket har gett suboptimala resultat, med gränsöverskridande utsläpp av blå fluorescens till den gröna kanalen. Detta mikroskop använder en vit ljuskälla och har en snabb filterhjul för att välja excitations wavelengths.This innebär att våglängdsselektering är begränsad till de åtta filter i hjulet, men det finns en separat hjulet för att reglera intensiteten. Följande kombination av speglar / filter användes. För GFP (Semrock): Magnetiseringsmaskin FF01-470/40, FF02-525/50 Emitter, dikroisk spegel FF495-DI02. För den gemensamma fiskeripolitiken och mCherry: Exciter FF01-427/10 (CFP, Semrock) 572/23 (mCherry, Chroma), Sändare FF01-472/30 (GFP, Semrock) 632/60 (mCherry, Chroma), kalljusreflektor Mirror 89006bs (Chroma).
Betydelsen av denna teknik jämfört med andra avbildningstekniker är tvåfaldigt: För det första kan den fånga lokalisering av proteinet av intresse i levande celler, och andra, kan det öka informationen extraheras lägga den fjärde dimensionen av tid. Men som med exogena proteiner finns det alltid möjlighet att mislocalization, antingen på grund av ökade uttryckningsnivåer eller på grund av märkning, bör därför levande cell imaging kombineras med immuno-färgning av endogena POI i fixerade celler, för att bekräfta resultaten . Slutligen är det värt att notera att levande cell imaging kan kombineras med immuno-EM, för att öka den rumsliga upplösningen av analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vårt arbete stöds av bioteknik och Biological Sciences Research Council. Vi vill tacka Prof Tamotsu Yoshimori för vänligt förse oss med plasmiden för uttryck av GFP-LC3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41965 | |
| OptiMEM I | Invitrogen | 31985-062 | |
| MitoTracker Red FM | Invitrogen | M22425 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Applied Science | 6365787001 | |
| 22 mm coverslips | VWR | 631-0159 | |
| 35 mm plates | Fisher NUNC | 153066 | |
| Silicon grease | RS Components Ltd. | RS 494-124 | |
| O-rings | Custom made | ||
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A-7816 | Suggested alternative to custom-made O-rings |
| Microscope | Olympus | IX81 | Inverted microscope |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 100XO | N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5 |
| Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600 10B | Progressive scan interline CCD |
| Illuminator | TILL Photonics | Polychrome V | Ultrafast monochromator |
| Incubation chamber | Solent Scientific | Cell^R IX81 | |
| Software | Olympus | SIS xcellence |
References
- Mizushima, N. Autophagy: process and function. Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).
- Klionsky, D. J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).
- Klionsky, D. J. Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve. Autophagy. 4, 740-743 (2008).
- Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).
- Hayashi-Nishino, M., et al. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Mizushima, N., et al. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).
- Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy. 6, 764-776 (2010).
- Axe, E. L., et al. Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).
- Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue. Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).
