Summary
私たちは、マウスが受けている中等度および重度の虚血再灌流誘発性腎傷害のモデルを記述する一方的な腎茎それぞれ、同時または遅延対側腎摘出続いクランプ。これらのモデルは、一貫して腎機能障害や損傷後の線維化を生じさせるが、傷害の重症度と生存率は、マウス、背景、年齢や手術用機器に依存している。
Abstract
虚血再灌流誘発される急性腎傷害（IR-AKI）が広く、マウスにおけるAKIのモデルとして使用されますが、結果は、多くの場合、分析を混乱させることが高く、頻繁に報告されていない死亡率が非常に可変であるされています。両側性腎茎クランプは、一般的にIR-AKIを誘導するために使用されますが、効果的なクランプ圧および/または腎臓の間で虚血性腎応答の違いは多くの場合、変数の結果につながるされています。また、短いクランプ時間がより変動細管障害を誘導することが知られており、より長いクランプ時間でバイラテラル損傷を受けたマウスは、より一貫した管状の損傷を開発するが、それらはしばしば重度の腎不全に起因する損傷後の最初の3日以内に死亡する。損傷後の生存率を改善し、より一貫した予測可能な結果を得るために、我々は、反対側の腎摘出術に続いて一方的な虚血再灌流障害の2つのモデルを開発した。両方の手術をfを得外科応力を低減する、背アプローチを使用して実行され一般的にマウスIR-AKIの手術に使用ロム腹開腹、。中程度の傷害をBALB / cマウスの誘導のために一方的には26分間腎茎のクランプ受け、また同時対腎摘出を受ける。このアプローチを使用して、マウスの50〜60％は、損傷後の適度なAKI 24時間を開発するが、マウスの90〜100％は生き残る。より厳しいAKIを誘導するために、BALB / cマウスは、8日後の傷害反対側の腎摘出術に続いて30分間クランプ腎椎弓根を受ける。これは、90〜100％の生存率と損傷後の腎回復の機能評価を可能にします。初期の損傷後尿細管障害と同様にポスト傷害線維症は、このモデルを使用して高度に一貫しています。
Introduction
急性腎臓損傷（AKI）の実験モデルの様々な（最近の、包括的なレビュー1リファレンスを参照してください）人間の条件の多様性と複雑さを一致させるために開発されている。これらの各モデルは、独自の長所と短所があり、それぞれが様々な効率化に対応する人間の条件を模倣しながら、どれも正確に彼らの人間の対応の病態をモデル化しません。虚血再灌流（IR）誘発AKIは、げっ歯類の急性虚血誘発性腎障害のモデルとして開発されました。このモデルで見られる尿細管傷害の重症度はほとんどその限界にもかかわらず、腎低灌流傷害患者2で観察されておらず、主な理由このモデルの比較的再現性質のため、その広範な使用が提供していると、それが期待されている間、継続します共通の基本AKIのメカニズム、修理、治療3の多くの重要な洞察を提供する。 IR手術は家族を必要とします我々は、 図1の簡略化した形で示されているマウスの腎臓の解剖とiliarity。腎臓の虚血再灌流（IR）傷害の手術を腹側（開腹）または背側（後腹膜）のアプローチを介して行うことができる。それは少ない外傷であるため、我々はより速い回復時間と生存率の改善を（最初の手順を学習する場合は特に）ができ、背のアプローチを使用しています。腎IR傷害は一方的にまたは両側行うことができます。しかし、効果的なクランプ圧（クランプ顎の間perihilar脂肪の介在に起因するもの）および/または側面間虚血、腎応答の違いの差がより変動結果につながる。これは克服できない問題ではありませんが、それはこのモデルのための主要な課題となっている実験では、間の変動性を高めることができます。片側IRは対側腎摘出術を行うことができる。これは、椎弓根間のクランプの変動を減少するための選択肢の私たちの方法であり、同時にllows片側IR独りで影響を受けません腎機能を評価するための1、。マウスでは腎機能を評価するための最も実用的な対最適な方法であるかについて議論がありました。血中尿素窒素（BUN）は、腎機能の尺度を提供し、IR傷害を含むAKIのいくつかのモデルにおいて有用 "一見"マーカーである。しかし、BUNレベルが回復の遅れが日手術後数の流体の経口摂取を減少させるときに、特に腹側アプローチIR損傷後の、影響を受ける可能性があるマウスの体積の状態によって影響を受けることができる。血清クレアチニンは少ない水和の状態に影響されますが、明らかに筋肉量に影響されます。血清クレアチニン測定の困難の一つは、ピクリン酸ベースの技術を使用して、マウス血清中の非クレアチニン色原体の検出に問題があった。代替として、中心の数は、このアーティファクト4によって影響されないマウスクレアチニンを定量化するHPLCに基づく方法を開発した。しかし、UNLIKE BUNと血清のみの5-10μLを必要とピクリン酸クレアチニンアッセイは、HPLC-アッセイは〜25μlのアッセイあたりの血清、重複で行った場合1アッセイあたり全血の〜100μlのが必要になります。を必要とするこれは、マウスの研究に限定することができる。いくつかのセンターでは、小さいサンプル量5、6の分析を可能にする、より高感度HPLCおよび質量分析ベースのメソッドを開発しました。しかし、これらの技術は広く利用可能ではありません。常にピクリン酸アッセイ間の代替、酵素カスケードアッセイ（血清のわずか5〜10μlのを必要とする）は、マウスおよびラットの血清サンプルで評価し、血清クレアチニンの密接並列HPLC測定することが示されているオーバー推定クレアチニン値7。このアッセイが広くAKI文献に使用されていないが、アッセイは使用するために、シンプルな市販されており、我々は、マウスのIR誘発性AKIのこのモデルでは信頼性の高い結果が得られます見つける。
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Protocol
- 手術前に、すべての手術器具をオートクレーブ。一つは別のマウスで複数の手術を行っている場合、ホットビーズ滅菌器を使用して滅菌した後、使用後の楽器をすすぎ、あることに注意してください。これは、70％エタノールに浸漬するのに十分ではない。
- 手術中の体液の損失を補償するために、術前術後に、すぐに0.5ミリリットルS / C無菌生理食塩水を与える。
- マウスの重量を量る。
- IPキシラジン/ケタミン混合物を用いてマウスを麻酔。それは、通常、外科的な平面麻酔に達するためにマウスで3-5分かかります。
- 切開部位を汚染から髪を保つために十分な国境地帯で手術部位を剃る。これは、手術が行われる場合に、予備領域にない行う必要がある。
- 手順の実行中に、乾燥を防ぐために、目に眼科潤滑軟膏を適用します。
- 吸収ベンチパッドで覆われて加熱された表面上に発生しやすいマウスを置きます。手術の表面にテープ脚。
- 使用している場合水浴システム、手術前に38℃で1時間に設定した熱。
- 無菌調製は、ベタジンソリューション綿棒スティックを使用して：ベタジンを削除するNolvasanとスクラブが続くたびに、3倍の外周部に向かってサイトの中心からスクラブ。すべてベタジンはNolvasanですすぐことで切開する前に手術野から削除する必要があります。無菌手順手袋を開始する前に無菌になるように変更されるべきである。
- 滅菌外科用ドレープと手術野をカバーしています。これは、手術野に入ることから浮遊毛を防ぎ、手術中に無菌の楽器を築くための領域を提供する。
- 皮膚から腎臓の場所を触診する。
- はさみや鉗子を用いたマウス（約1.5 cm）のの正中線に沿って背部皮膚をカットします。
- はさみやピンセットを用いて鈍的切開によってこの切開を通して左右の背側面上に独立した皮膚と皮下層。
- 右FLを通して小さな切開を行います腎臓上記の筋肉や筋膜をANKと右の腎臓を体外に出す。
- 慎重に周囲組織から遊離腎臓の上下の極を解剖。上極の周りから脂肪組織が 腎臓をオフにプッシュすることができますが、明らかにマウス（ 図1）から削除されるべきではない、独自の血液供給を運ぶ副腎が含まれていることに注意してください。周囲の組織から解放腎臓後、二重手術の結び目を使用して右の腎臓の門の周りに4-0絹縫合糸を結ぶ。縫合糸の一端を残す〜あなたがカットするためにサイトを視覚化できるように、結び目に遠位切断されている限りで2が腎臓を保持する。滅菌生理食塩水で切り株を灌漑。
- 吸収性縫合糸を用いて、筋層を閉じます。
- 左脇腹の筋肉と腎臓上記の筋膜を通して小さな切開を行い、左腎臓（ 図2A）を体外に出す。
- 腎を放出しながら、慎重に鈍鉗子を使用して腎臓を開催鉗子（ 図2B-2F）を使用して脂肪組織を取り巻くから茎。研究のために "偽"コントロールを設計する際に1つのニーズはこれを覚えておくように鈍鉗子を使用して、腎臓にあまり圧力が腎障害を引き起こす可能性があります。あなたが偽のコントロールが腎障害を（として血清クレアチニンの上昇によって証明）開発していることが判明した場合は、腎茎から周囲の脂肪組織を解放するために考慮することができる別の方法は優しく生理食塩水に浸した滅菌と組織を転がすことで綿先端が綿棒。我々の経験では脂肪がかなりきつく腎茎に取り付けられており、簡単に綿棒で除去することができませんので、これはあなたが使用したいと思う最初のアプローチではありません。しかし、このモデルの他の側面と同様に、これはあなたが練習と経験を自分のために確立しなければならないというものです。
- 保持鉗子（クランプの配置を容易にする）を用いて、非外傷性血管クランプを使用して、左腎椎弓根をクランプする、異なるCLAのためにタイマを使用融点時間はマウス系統と（ 表1を参照）が必要傷害重症度に応じ。
- 皮膚（ 図2H）と左腎をカバーしています。
- 生理食塩水に浸したガーゼで皮膚切開をカバーしています。
- 腎臓を体外に出す、制服薄暗い外観を確認し、指示された時間後にクランプを解除し、その薄暗い外観は腎臓全体に均一に反転（ 図2I / G）を確認します。腎臓は急速かつ均一に再灌流（ピンクアップ）されない場合は、マウスは、さらに分析から除外されるべきである。そっと後腹膜腔に戻し腎臓を押してください。
- 吸収性縫合糸を使用した筋層を閉じます。
- モノフィラメントナイロン非吸収性縫合糸を使用したスキン層を閉じます。
- ブプレノルフィン鎮痛を管理します。
- 彼らが目を覚ますまで、加熱パッド上に離れて手術野からマウスを転送します。
- 動物の部屋にマウスを返します。
- 密接にマウスを監視し、付加的な用量を与えるブプレノルフィンのように痛みや不快感のために、すべての8-12時間の上に示された。鎮痛薬を投与し、その結果臨床症状は、うつ病や他の行動の変化、異常な外観、またはそのようなPILO-勃起、猫背姿勢、グルーミングや食事の欠如、あるいは不動などの姿勢があります。
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Representative Results
同時対側腎摘出術との適度なIR-誘発AKI。片側IRは、実質的結果にばらつきは減少しますが、この手順を生き残るためには、マウスのために必要な短いクランプ時間で、我々はまだ、マウスのわずか50〜60％が期待腎不全24時間を開発しましたことがわかった後に傷害（ 図3A）。実用的な面では、これは研究では、時間は腎機能を評価し、腎不全を発症しないマウスを破棄することができ、損傷後少なくとも24時間を開始することができ、治療レジメンを伴わない限り、データを評価する難しさを作成します。
重度IR-誘発AKIは同時対腎摘出と一方的なIRを実施することに加えて、我々だけでは一方的なIRを実行します。マウスは、虚血のはるかに長い期間を生き残る、より重度の損傷後の線維症を開発する傾向があることができます。虚血の同期間では、マウスは、一方的な虚血deveにさらさ腎摘出8との二国間の虚血または一方的な虚血より垂れより重度線維ので、このモデルはまた、ポストAKI線維症のモデルとして使用されます。欠点は、腎臓組織を採取し、長期的な研究のために可能ではないかもしれなくても損傷の重症度を評価する方法がないので、それは一方的なIR損傷後の機能回復を評価することは不可能であるということである。このような理由から、我々は深刻な一方的なIRの傷害を誘発し、8日間オリジナル損傷後対側腎摘出術を行うことにより、腎機能回復を評価するためのプロトコルを開発した。このアプローチを使用したマウスの90〜100％、傷害を生き残るが、重要なのはマウスは非常に一貫性の腎障害を開発し、9年以降（ 図3B）日からAKIに続く機能回復のために評価することができます。これらの知見は、もはや腎茎クランプ時間が短くクランプTIより構成尿細管傷害を誘発することを示すラットの研究と一致している MESは、AKI 9軽度から中等度の誘導に設計されています。また、先行研究8と一致し、これらのマウスは、一貫して、ポスト傷害腎線維化を（私たちは28日目に評価している）を開発。これは、少なくともBALB / cの背景にタンパク尿に関連付けられていない：28日後の傷害尿中アルブミン/クレアチニン比でIR-AKI厳しい後0.8は±0.04（μgの/ MGにおける平均±SEM）。それは深刻なIR-AKIモデルは他の背景で蛋白尿を生じさせるかどうかは不明である。
図1。マウス腎門部の解剖学。血液供給と尿管に関連する腎血管鞘の位置が、腎周囲脂肪パッドと副腎を示す。黒丸は、マイクロクランプの位置をマークします。
50495/50495fig2.jpg "/>
図2。マウスの腎臓の血管シースの露出とクランプ（）、皮膚と筋層の切開後に左腎の露出が、（B - E）、左腎は腎周囲脂肪が注意深くピンセットを使って除去しながら優しく鈍鉗子を使用して開催されます。 （F）、左腎茎（緑色の矢印）を露出。白の破線はperihilar脂肪パッド内尿管の予想される位置をマークします。この領域は、血管クランプ。（G）、左腎。（H）に印加されるマイクロクランプを回避する必要がある左腎臓、皮膚で覆われている。（I）、（G）、腎臓の出現の前にクランプ（A）中の（I）および（G）血管クランプを除去した後の後。
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図3。 AKI後の機能回復。適度IR傷害（26分クランプ時間）と対側腎摘出後の血清クレアチニンの変化（酵素アッセイによって）（）、重度の損傷の誘導後の血清クレアチニンの変化（30分クランプ時間）とに反対腎摘出は8日目（B）。 BALB / cマウスで行った研究はn =グループ当たり6。酵素アッセイを用いて測定したMG / DLで+ /-SEM血清クレアチニンを意味するように結果が表明した。
| マウス株 | おおよそマウス年齢 | おおよそのマウスの重量 | 型クランプ | 当社及びカタログ番号 | 重傷のための虚血時間 | 中程度の傷害のための虚血時間 | 暖房パッド温度 |
| BALB / cの 4-5ヶ月 | 25〜28グラム | 血管クランプ （795グラム圧） | ROBOZ、RS-5459 | 30分（またはそれ以上） | 26分 | 38°C | |
| C57BL / 6 | 4-5ヶ月 | 24〜27グラム | 血管クランプ （795グラム圧） | ROBOZ、RS-5459 | 29分（以上） | 26分 | 38°C |
| CD1 | 4-5ヶ月 | 36〜39グラム | 血管クランプ （75〜85グラム圧力） | FST、18055から02 | 29分（以上） | 26分 | 38°C |
表1。我々は評価されていることをお勧めし血管クランプ、虚血時間、およびマウス系統。
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Discussion
私たちは、中等度および重度の腎障害の影響を研究するためのIR-AKIの2つのモデルを記述する。これらのモデルは、私たちは、低死亡率と一貫性のある予測可能な傷害を誘発することができます。我々のプロトコルでは、伝統的にこのモデルに関連付けられた困難や落とし穴の多くを概説します。さらに、腎茎クランプの長さに応じて、モデルが不完全回復と持続的な腎線維症で、主に可逆軽度及び中等度のAKI、またはより厳しいAKIを誘導することが示されている。重度のIR-AKIモデルにおける損傷後の線維症は、マウスは、これらの長い虚血時間は両側が行われていれば可能であるよりもより重篤な腎障害で生き残ることができるという事実に起因する可能性がある。しかし、IR後の最初の数日間は無傷対側腎の存在が後AKI線維8を高めるという証拠もある。したがって、ながら無傷と負傷腎臓間のクロストークのメカニズムが確立されずに残っているlished、このメカニズムはまた、我々はこのモデルで観察することが強化された損傷後の線維化を考慮することがあります。それはこれらのモデルを使用して結果は、ヒトの疾患の治療薬に変換することができるかどうか決定されていないが、それらはIR-AKIにおけるメカニズムと治療を研究するために、ポストAKI腎線維症、として浮上している臨床的問題を防止するために信頼性のあるモデルを提供進歩的な慢性腎臓病10、11の主要な貢献者。
マウス系統12、男女13、年齢14、マウスの重量、使用血管クランプ、および暖房システム15：慎重に出席する必要があるIR損傷後AKIの重症度に影響を与えることができる重要な問題がいくつかあります。右の血管クランプを選択すると、挑戦することができます。腎臓は、クランプの配置5-10分以内に均一に黒くなるべきであるようにクランプの効率は、外科手術中に評価される。しかし、それはまたimpoなどである全体の腎臓は、クランプを削除した後に急速に（ピンクアップ）を再灌流されていることをrtant。我々は重いクランプの一部を発見したと、特定の菌株（ 例えば BALB / cおよびC57BL / 6）でうまく動作しますが、他では、これらのクランプは血管損傷を誘導し、腎臓の再灌流はしばしば不完全である（ 例 ：CD1）。我々が評価されてきた血管のクランプは、クランプ量（圧力）およびマウス株の概要を表1に記載されている。加熱システムは、多くの研究者は、一定の体温を監視し、維持するために温度プローブを使用した自動調節加熱パッドを使用してください。理論的には有利なものの、我々はこの加熱システムはかなり変数結果を生じさせ、外科手術の過程で体温大きな変動をもたらし得るがわかった。さらに、これらのシステムは比較的高価であるので、1つが一度に動作することができるマウスの数に制限することができる。試行錯誤の多くの後、私たちは水ょんを循環、一定温度に移動しましたティンシステム。その主な利点は、加熱プラットフォームは手術を通じて安定温度（38°C）を得ることである。大規模なプラットフォーム領域で、それは（ほとんどのIR-AKI研究のための実用的な要件である）任意の一時点で表面上にマウスの数を操作することも可能である。 、我々は適度な（ただし、重度）IR-AKIに続く負傷の大幅なばらつきが残っていた見つけたことを言って。これは、治療が不十分であったり、過度に重傷を開発したマウスから、24時間以上の損傷後に着手している血清クレアチニンの分析によって無作為化の前に試験から除外することができる研究のための問題ではありません。マウスは、事前傷害または遺伝モデルが使用されている場合は治療を受けている場合は、実験的な変動性に関する追加のコントロールが導入される必要があるかもしれません。コア体温の変動が、このモデルにおけるIR損傷のばらつきの主な原因である可能性が高いので、ばらつきを制限する一つのアプローチは、mになります含める、またはその後の分析から除外するための適切な動物を決定するために直腸プローブを用いonitorコア温度。最終的な考慮事項は、マウスの年齢、体重、性別です。我々の経験のほとんどは、BALB / cマウスとされており、マウスは体重と、年齢の4-5ヶ月で安定した体重に到達したとき〜25〜28グラムを、我々は最良の結果を得た。男性が女性より13 IR-AKIに大きな感受性を持っているので、最後に、我々は唯一のオスのマウスを用いた我々の研究のすべてを実行します。しかし、制御が困難であり、追加の変数が存在するため、各研究室、各研究者は、彼らが自分の好きなマウス系統に望む傷害の重症度を誘発するために正確なクランプ時間と条件を確立する必要があります。
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Disclosures
著者らは、開示する利害の衝突を持っていません。
Acknowledgments
博士デCAESTECKERの研究室では、NIH 1RO1 HL093057-01と1RC4DK090770-01でサポートされています。博士はハリスの研究室はDK38226、DK51265、DK62794および退役軍人からの資金によってサポートされています。またバンダービルトオブライエン腎傷害センター助成1P30 DK079341が提供するマウスの腎臓の傷害手術、血清クレアチニン、および線維アッセイのサポート。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (anesthetic) | Webster Veterinary | 07-881-9413 (100 mg/ml) | Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine) |
| Xylazine (analgesic) | Webster Veterinary | 07-808-1939 (100 mg/ml) | As above |
| Antisedan (anti-Xylazine) | Webster Veterinary | 07-867-7097 (5 mg/ml) | Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg |
| Buprenorphine (analgesic) | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml) | Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution. |
| Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Betadine swab sticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-01 | |
| Nolvasan Surgical Scrub | Pfizer Animal Care | 300253 | |
| Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery. | |||
| Iris Scissors | Integra Miltex | VWR 21909-404 | For skin and muscle dissection |
| Curved iris forceps | FST | 11065-07 | To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat |
| Blunt forceps | ROBOZ | RS-5228 | To manipulate kidneys |
| Vascular clamp (795 g pressure) | ROBOZ | RS-5459 | Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains |
| Schwartz clip applying forceps | ROBOZ | RS-5450 | For RS-5459 clamps |
| Vascular clamp (75-85 g pressure) | FST | 18055-02 | Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock | FST | 18056-14 | For FST 18055-02 clamps |
| Gayman T/Pump (water-bath heated platform) | Braintree Scientific | TP-650 | The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery |
| 15" W x 24" Heated platform | Braintree Scientific | HHP-2 | Connect to Gayman heated water pump |
| Heating pad | Braintree Scientific | Model 39DP | Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery |
| Absorbable suture (Vicryl 5-0) | ETHICON | VCP834G | For fascia and muscle |
| Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B) | CP Medical | CP-B660B-03 | For skin |
| Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm | FST | 12501-13 | To hold suture needles |
| Timer | FST | 06-662-3 | To quantify ischemia time |
| Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol) |
| Electric razor | Braintree Scientific | CLP-22965 | |
| Tape | Durapore | 1538-0 | |
| 1 ml Syringe | EXELint | 26044 | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| Absorbent BenchPad | VWR | 56617-014 | |
| Surgical drapes | VWR | 21902-985 | Need to be autoclaved |
| 2’’ x 2’’ Gauze Pads | Medi-First | 60673 | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | 2D7251 | |
| Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery. | |||
References
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