Iskemi-reperfusjon Modell av akutt nyreskade og Post Injury fibrose i Mus

Summary

Vi beskriver modeller av moderat og alvorlig ischemi-reperfusjon-induserte nyreskade i hvilken musene gjennomgår unilateral nyre stilken fastspenning etterfulgt av simultan eller forsinket kontralaterale nefrektomi, henholdsvis. Disse modellene konsekvent gir opphav til renal dysfunksjon og etter skade fibrose, men alvorlig skade og overlevelse er avhengige mus bakgrunn, alder og kirurgisk utstyr.

Abstract

Iskemi-reperfusjon indusert akutt nyreskade (IR-AKI) er mye brukt som en modell av AKI i mus, men resultatene er ofte ganske variabel med høye, ofte urapportert dødelighet som kan forvirrer analyser. Bilateral renal pedicle Klemmingen vanligvis brukes til å indusere IR-AKI, men forskjellene mellom effektive klemme press og / eller nyre svar på iskemi mellom nyrer ofte føre til mer variable resultater. I tillegg er kortere klemme ganger kjent for å indusere mer variabel rørformet skade, og mens musene som gjennomgår bilateral skade med lengre klemme ganger utvikle mer konsekvent rørformet skade, de ofte dør innen de første tre dagene etter skade på grunn av alvorlig nyresvikt. For å bedre etter skade overlevelse og få mer konsistente og forutsigbare resultater, har vi utviklet to modeller av ensidig iskemi-reperfusjon skade etterfulgt av kontralateral nefrektomi. Begge operasjonene er utført ved hjelp av en dorsal tilnærming, redusere kirurgisk stress som følge from ventral laparotomi, som vanligvis brukes for mus IR-AKI operasjoner. For induksjon av moderate skader BALB / c mus gjennomgå ensidig klemming av nedsatt pedicle for 26 min og også gjennomgå samtidig kontralateral nefrektomi. Ved hjelp av denne tilnærmingen, 50-60% av musene utvikler moderat AKI 24 timer etter skade, men 90-100% av mus overleve. Å indusere mer alvorlig AKI, BALB / c mus gjennomgå renal pedicle klemming i 30 min etterfulgt av kontralateral nefrektomi 8 dager etter skade. Dette gjør funksjonell vurdering av nedsatt restitusjon etter skade med 90-100% overlevelse. Tidlig etter skade tubuliskade samt post skade fibrose blir meget ensartet ved hjelp av denne modellen.

Introduction

En rekke eksperimentelle modeller av akutt nyreskade (AKI) er utviklet for å matche mangfoldet og kompleksiteten i den menneskelige tilstand (se referanse for en fersk, omfattende gjennomgang ^1). Hver av disse modellene har sine egne styrker og svakheter, og mens hver etterligner de tilsvarende menneskelige forhold med varierte effektivitet, ingen nøyaktig modellere patofysiologien av sine menneskelige kolleger. Iskemi reperfusjon (IR)-indusert AKI har blitt utviklet som en modell for akutt iskemi nyreskade hos gnagere. Mens alvorlighetsgrad av renal tubulær skade sett i denne modellen er sjelden observert hos pasienter med nedsatt hypoperfusjon skader ^2, til tross for sine begrensninger og i stor grad på grunn av den relativt reproduserbar natur av denne modellen, har sin omfattende bruk, forutsatt, og det er forventet, vil fortsette å gi viktig innsikt i mange av de felles grunnleggende mekanismene for AKI, reparasjon og terapi ^tre. IR kirurgi krever familiarity med musen nyre anatomi, som vi har vist i en forenklet form i figur 1. Nedsatt iskemi-reperfusjon (IR) skade kirurgi kan utføres via ventral (laparotomi) eller dorsal (retroperitoneal) tilnærminger. Vi bruker en dorsal tilnærming siden det er mindre traumatisk, slik at raskere utvinning ganger og forbedret overlevelse (spesielt når den først lære prosedyren). Nedsatt IR skade kan utføres ensidig eller bilateralt. Imidlertid fører forskjeller mellom effektive klemme press (noe som kan resultere fra interposition av perihilar fett mellom klemmen) og / eller forskjeller i renal svar på iskemi mellom sidene til mer variable resultater. Mens dette ikke er et uoverstigelig problem, kan det øke variabiliteten mellom eksperimenter, som er et stort problem for denne modellen. Ensidig IR kan utføres med contra-lateral nephrectomy. Det er vår metode for valg siden den reduserer variabiliteten i fastspenning mellom pedicles, og på samme tid enllows en å vurdere nyrefunksjonen, som er upåvirket med unilateral IR alene. Det har vært diskusjon om hva som er den mest praktiske g. optimale metode for å vurdere nyrefunksjonen hos mus. Blod urea nitrogen (BUN) er et mål på nyrefunksjonen og er et nyttig "first look" markør i enkelte modeller av AKI, inkludert IR skade. Imidlertid kan BUN nivåene påvirkes av volum status av musene som kan bli påvirket, spesielt etter ventrale tilnærming IR skade, da forsinket gjenvinning reduserer oralt inntak av væske til et antall dager etter kirurgi. Serum kreatinin er mindre påvirket av væskebalansen, men er tydelig preget av muskelmasse. En av vanskelighetene med serumkreatinin målinger har vært problemer med deteksjon av ikke-kreatinin kromogener i museserum ved hjelp av pikrinsyre baserte teknikker. Som et alternativ, har en rekke sentre utviklet en HPLC-basert metode for å kvantifisere mus kreatinin som ikke er berørt av denne gjenstand ^fire. Men unlike BUN og pikrinsyre kreatinin-analyser, som bare krever 5-10 mL serum, HPLC-analyser krever ~ 25 mL serum per analysen, som hvis det utføres i duplikat vil kreve ~ 100 mL fullblod per analysen. Dette kan være begrensende for mus studier. Noen sentre har utviklet mer sensitive HPLC og massespektrometri-baserte metoder som tillater analyse av mindre prøvevolumer ^{5, 6.} Men disse teknologiene ikke er allment tilgjengelig. Et alternativ, enzymatisk kaskade analysen (som krever bare 5-10 mL serum) har blitt evaluert i mus og rotter serumprøver og vist til tett parallell HPLC målinger av serum kreatinin mens pikrinsyre analyser alltid over-estimat kreatininverdier ^7. Selv om denne assay ikke blir mye brukt i den AKI litteraturen, er analysen kommersielt tilgjengelig, lett å bruke, og vi finner gir pålitelige resultater med denne modell av IR-indusert AKI i mus.

Protocol

1. Autoklaver alle kirurgiske instrumenter før operasjonen. Merk at hvis man utfører flere operasjoner på forskjellige mus, skyll instrumenter etter bruk og deretter sterilisere med en varm perle sterilisator. Det er ikke tilstrekkelig til å synke ned i 70% etanol.
2. Gi 0,5 ml S / C steril normal saltløsning preoperativt og umiddelbart postoperativt å kompensere for tap av kroppsvæske under operasjonen.
3. Vei musene.
4. Anesthetize mus ved hjelp av IP Urea / Ketamin blanding. Det tar vanligvis 3-5 minutter for musene å nå kirurgisk plan anestesi.
5. Barbere det kirurgiske området med nok grenseområdet for å holde håret fra forurensende snittet området. Dette må utføres i et forberedende område, ikke hvor operasjonen er utført.
6. Påfør ophthalmic smøre salve på øynene for å hindre uttørking under inngrepet.
7. Plasser musen utsatt på den oppvarmede overflaten dekket med absorberende benk pad. Tape bena til kirurgisk overflate.
8. Hvis du brukervannbadet system, sett varme ved 38 ° C 1 time før kirurgi.
9. Aseptisk forberedelse på Betadine løsning vattpinne pinne: skrubbe fra midten av området mot periferien 3x, hver gang fulgt av skrubbing med Nolvasan å fjerne Betadine. Alle Betadine bør fjernes fra det kirurgiske felt før innsnitt ved å skylle med Nolvasan. Før du starter aseptisk prosedyre hansker bør endres for å være steril.
10. Dekk kirurgiske feltet med en steril kirurgisk drapere. Dette vil hindre at tilfeldig hår kommer inn i operasjonsområdet, og gir et område som å legge sterile instrumenter under operasjonen.
11. Palpate nyre plassering gjennom huden.
12. Skjær dorsal huden langs midtlinjen av mus (ca 1,5 cm) med saks og pinsett.
13. Separat hud og underhud lag over venstre og høyre dorsal sidene gjennom dette snittet ved stump disseksjon med saks og pinsett.
14. Lag et lite snitt gjennom høyre flAnk muskel og fascia over nyrene og exteriorize høyre nyre.
15. Nøye dissekere de øvre og nedre stolper i nyrene fri fra omgivende vev. Legg merke til at fettvev fra rundt den øvre pol inneholder binyrene bærer sin egen blodtilførsel som kan skyves av nyre, men åpenbart ikke bør fjernes fra mus (figur 1). Etter frigjørende nyre fra omkringliggende vev, knytte 4-0 silke sutur rundt hilum av høyre nyre hjelp av en dobbel kirurgisk knute. La den ene enden av sutur ~ 2 i lang tid å holde opp nyrene som du klipper distal til knuten, slik at du kan visualisere området som skal skjæres. Vanne stubben med sterilt saltvann.
16. Lukk muskelen laget ved hjelp av absorberbare sutur.
17. Lag et lite snitt gjennom venstre flanke muskel og fascia over nyrene og exteriorize venstre nyre (Figur 2A).
18. Hold forsiktig nyre med butte pinsett mens slippe nedsattpedicle fra omkringliggende fettvev ved hjelp av tang (figur 2B-2F). For mye press på nyrene ved hjelp av butte pinsett kan forårsake nyreskade slik at man trenger å huske dette når vi designer "humbug"-kontroller for studiene. Hvis du finner ut at humbug kontroller utvikler nyreskade (som dokumentert av en økning i serum kreatinin), en alternativ metode du kan vurdere å slippe den omkringliggende fettvev fra renal pedicle er å forsiktig rulle vev med saltvann gjennomvåt steril bomull- tipped vattpinner. I vår erfaring fettet er ganske tett knyttet til nedsatt pedicle og kan ikke enkelt fjernes med bomullspinner, så dette kan ikke være den første tilnærmingen du ønsker å bruke. Men som andre aspekter ved denne modellen, er dette noe som du er nødt til å etablere selv med praksis og erfaring.
19. Klemme venstre renal pedicle bruk av ikke traumatisk vaskulær klemme bruker holder tang (for å lette klemmen plassering), bruke tidsur for forskjellige CLAmp ganger avhengig av mus belastning og skade alvorlighetsgrad som kreves (se tabell 1).
20. Dekk venstre nyre med huden (figur 2H).
21. Dekk huden snittet med saltvann gjennomvåt gasbind.
22. Exteriorize nyre, bekrefter uniform mørke utseende og løsne klemmen etter de angitte tider, og bekrefter at mørke utseende reverserer jevnt gjennom nyrene (figur 2I / G). Hvis nyrene ikke raskt og jevnt re-perfuse (rosa opp) musen bør utelukkes fra videre analyse. Skyv nyre tilbake i retroperitoneal plass.
23. Lukk muskelen laget ved hjelp av absorberbare sutur.
24. Lukk hudlaget bruker monofilament nylon ikke-absorberbare sutur.
25. Administrere buprenorfin smertelindring.
26. Overfør mus vekk fra det kirurgiske feltet på en varmepute før de våkner.
27. Returnere musene til dyrerom.
28. Følge nøye med mus og gi ekstra doserav buprenorfin som angitt ovenfor hver 8-12 timer for smerte eller ubehag. Kliniske tegn som resulterer i administrasjon av analgetika omfatter depresjon eller andre atferdsendringer, unormal utseende eller holdning som Pilo-ereksjon, krum holdning, mangel på stell og spising eller immobilitet.

Representative Results

Moderat IR-indusert AKI. Ensidig IR med samtidig contralateral nephrectomy reduserer betydelig variasjon i resultatene, men med kortere klemme ganger nødvendige for musene å overleve denne prosedyren, vi likevel funnet at bare 50-60% av musene utviklet forventet nyresvikt 24 timer etter skade (figur 3A). I praksis skaper vanskeligheter evaluere data med mindre studier omfatter behandlingsregimer som kan startes i minst 24 timer etter skaden, slik at tid til å vurdere nyrefunksjonen og kast mus som ikke utvikler nyresvikt.

Alvorlig IR-indusert AKI. I tillegg til å utføre ensidig IR med samtidig kontralaterale nephrectomy, utfører vi ensidig IR alene. Mus kan overleve mye lengre perioder av iskemi og har en tendens til å utvikle mer alvorlig etter skade fibrose. Med samme periode i iskemi, mus utsatt for ensidig iskemi utviklop mer alvorlig fibrose enn bilateral iskemi eller unilateral iskemi med nephrectomy ^8, så denne modellen også brukes som en modell av post-AKI fibrose. Ulempen er at det ikke er mulig å vurdere funksjonell restitusjon etter unilateral IR-skade slik at det ikke er noen måte å vurdere alvorligheten av skaden uten høsting nyre vev og det er kanskje ikke mulig for lengre sikt studier. Av denne grunn har vi utviklet en protokoll for å fremkalle alvorlig ensidig IR skade, og vurdere nedsatt funksjonell restitusjonsperioden ved å utføre kontralaterale nephrectomy åtte dager etter den opprinnelige skaden. Ved hjelp av denne tilnærmingen 90-100% av musene overlever skaden, men viktigst musene utvikler veldig konsekvent nyreskade og kan evalueres for funksjonell restitusjon etter AKI fra dag 9 og utover (Figur 3B). Disse funnene er i tråd med studier på rotter indikerer at lengre renal pedicle klemme ganger indusere mer bestanddel renal tubulær skade enn kortere klemme ti mes designet for å fremkalle milde til moderate AKI ^ni. I tillegg, i samsvar med tidligere studier ^8, disse musene gjennomgående utvikle post skade renal fibrose (som vi har vurdert på dag 28). Dette er ikke forbundet med proteinuri i det minste på en BALB / c bakgrunn: etter alvorlig IR-AKI på dag 28 etter skade urin albumin / kreatinin-ratio er 0,8 ± 0,04 (gjennomsnitt ± SEM i mg / mg). Det er ukjent om den alvorlige IR-AKI modellen gir opphav til proteinuri på annen bakgrunn.

Figur 1. Anatomy of musen nedsatt hilum. Illustrating posisjon nyrevaskulær slire i forhold til ureter, perinefrisk fett pads og binyrene med blodtilførsel. Den svarte sirkelen markerer plasseringen av mikro-klemmen.

50495/50495fig2.jpg "/>
Figur 2. Eksponering og klemming av mus nyre vaskulær slire (A), eksponering av venstre nyre etter disseksjon av hud og muskel lag;. (B - E), er The venstre nyre holdt forsiktig med butte pinsett mens perinefrisk fett er nøye fjernes med pinsett. (F), Exposed venstre renal pedicle (grønn pil). Den hvite stiplede linje markerer den forventede posisjon av ureter innenfor perihilar fettpute. Denne regionen må unngås med den vaskulære klemmen. (G), Micro-klemme brukt til venstre nyre. (H) som har bitt seg til venstre nyre er dekket med huden. (I), (G), Utseende av nyre før (A), under (I) og etter (G) etter fjerning av den vaskulære klemmen.

fig3.jpg "/>
Figur 3. Funksjonell bedring etter AKI. Endringer i serum kreatinin (ved enzymatiske analyser) etter moderate IR skade (26 min klemme tid) og kontralateral nefrektomi (A), endringer i serum kreatinin etter induksjon av alvorlig skade (30 min klemme tid) og kontralateral nefrektomi på Dag 8 (B). Studier som er utført i BALB / c-mus, n = 6 per gruppe. Resultater uttrykt som gjennomsnitt + /-SEM serumkreatinin i mg / dl, målt ved hjelp av enzymatisk assay.

Mus belastning	Omtrentlig Mouse alder	Omtrentlig Mouse vekt	Klemme typen	Selskapet og katalognummer	Iskemi tid for alvorlig skade	Iskemi tid for moderat skade	Varmepute temperatur
BALB / c 4-5 måneder	25-28 g	Vaskulær klemme (795 g trykk)	Roboz, RS-5459	30 min (eller lengre)	26 min	38 ° C
C57BL / 6	4-5 måneder	24-27 g	Vaskulær klemme (795 g trykk)	Roboz, RS-5459	29 minutter (eller lengre)	26 min	38 ° C
CD1	4-5 måneder	36-39 g	Vaskulær klemme (75-85 g trykk)	FST, 18055-02	29 minutter (eller lengre)	26 min	38 ° C

Tabell 1. Anbefalt vaskulære klemmer, iskemi ganger, og musestammer at vi har vurdert.

Discussion

Vi beskriver to modeller av IR-AKI å studere virkningene av moderat og alvorlig nyreskade. Disse modellene tillate oss å indusere konsekvent og forutsigbar skade med lav dødelighet. Vår protokollen skisserer mange av de vanskeligheter og fallgruver tradisjonelt forbundet med denne modellen. Videre har vi vist at avhengig av lengden på renal pedicle festebraketter, induserer modellen en stor grad reversibel mild og moderat AKI, eller mer alvorlig AKI med ufullstendig utvinning og vedvarende nedsatt fibrose. Etter skade fibrose i den alvorlige IR-AKI-modellen kan resultere fra det faktum at mus som er i stand til å overleve med mer alvorlig nedsatt skade enn det som ville være mulig dersom disse ischemiske lengre tider ble utført bilateralt. Men det er også bevis for at tilstedeværelsen av en uninjured kontralateral nyre for de første dagene etter at IR forbedrer post-AKI fibrose ^åtte. Derfor, mens mekanismene for krysstale mellom uskadde og skadde nyrer gjenstår å etaetablert, kan denne mekanismen også stå for forbedret etter skade fibrose som vi observerer i denne modellen. Selv om det gjenstår å fastslå om funn ved hjelp av disse modellene kan oversettes til legemiddelselskap for menneskelig sykdom, gir de pålitelige modeller for å studere mekanismer og terapi i IR-AKI og for å forhindre post-AKI renal fibrose, en klinisk problem som fremstår som en stor bidragsyter i progressiv kronisk nyresykdom ^{10, 11.}

Det finnes en rekke kritiske forhold som kan påvirke graden av AKI følgende IR-skade som må være nøye på: mus belastning ^{12, 13} kjønn, alder ¹⁴ og vekt av musen, det vaskulære klemmen anvendes, og varmesystemer ^15. Velge riktig vaskulære klemmer kan være en utfordring. Effektivitet av klemmen er vurdert under kirurgisk prosedyre som nyrene bør bli jevnt svart innen 5-10 min av klemmen plassering. Det er imidlertid også important at hele nyre er re-perfused (rosa opp) raskt etter fjerning klemmen. Vi har funnet noen av de tyngre klemmer fungere godt med visse stammer (f.eks BALB / c og C57BL / 6), men i andre disse klemmer indusere vaskulær skade og nedsatt reperfusion er ofte ufullstendig (f.eks: CD1). En oppsummering av vaskulære klemmer, klemme vekter (trykk) og musestammer at vi har vurdert er listet opp i tabell 1. For varmesystemer, en rekke forskere bruke auto-regulerte varmeputer med temperaturfølere for å overvåke og opprettholde konstant kroppstemperatur. Mens teoretisk fordel, fant vi denne varmesystem kan føre til store svingninger i kroppstemperatur i løpet av operasjonen, som gir opphav til ganske varierende resultater. I tillegg er disse systemene forholdsvis kostbare så kan begrense i antall mus man kan operere på til enhver tid. Etter mye prøving og feiling har vi flyttet til en konstant temperatur, sirkulerende vann heating system. Den største fordelen med dette er at varme plattformen gir den mest stabile temperaturer (38 ° C) i løpet av operasjonen. Med den store plattformen området er det også mulig å operere på et antall mus på overflaten til enhver tid (som er et praktisk behov for de fleste IR-AKI studier). Når det er sagt, fant vi det var fortsatt betydelig variasjon i skade etter moderat (men ikke alvorlig) IR-AKI. Dette er ikke et problem for studier hvor behandlingene er satt i gang 24 timer eller mer etter skade, siden mus utvikler lite eller svært alvorlig skade kan fjernes fra undersøkelsen før randomisering ved analyse av serum kreatinin. Men hvis mus behandles før-skader, eller hvis genetiske modeller blir brukt, kan ytterligere kontroller på eksperimentell variabilitet trenger å bli innført. Siden svingninger i kroppens kjernetemperatur er sannsynlig å være den viktigste bidragsyter til variasjon i IR skade i denne modellen, en tilnærming for å begrense variasjon ville være å monitor kjerne temperaturer ved hjelp av endetarms sonder for å fastsette egnede dyr å inkludere eller ekskludere i senere analyser. De endelige hensyn er mus alder, vekt og kjønn. Mesteparten av vår erfaring har vært med BALB / c mus, og vi har fått de beste resultatene når mus nå stabil kroppsvekt ved 4-5 måneders alder, med kroppsvekt ~ 25-28 g. Til slutt, siden menn har større følsomhet overfor IR-AKI enn kvinner ^13, utfører vi alle våre studier med mannlige mus bare. Men det er flere variabler som er vanskelig å kontrollere, slik at hver lab og hver etterforsker må fastsette nøyaktige klemme ganger og betingelser for å indusere alvorlighetsgraden av skaden de ønsker i mus belastning for sine valg.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine (anesthetic)	Webster Veterinary	07-881-9413 (100 mg/ml)	Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine)
Xylazine (analgesic)	Webster Veterinary	07-808-1939 (100 mg/ml)	As above
Antisedan (anti-Xylazine)	Webster Veterinary	07-867-7097 (5 mg/ml)	Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg
Buprenorphine (analgesic)	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml)	Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution.
Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Betadine swab sticks	Purdue Products L.P.	NDC 67618-153-01
Nolvasan Surgical Scrub	Pfizer Animal Care	300253
Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery.
Iris Scissors	Integra Miltex	VWR 21909-404	For skin and muscle dissection
Curved iris forceps	FST	11065-07	To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat
Blunt forceps	ROBOZ	RS-5228	To manipulate kidneys
Vascular clamp (795 g pressure)	ROBOZ	RS-5459	Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains
Schwartz clip applying forceps	ROBOZ	RS-5450	For RS-5459 clamps
Vascular clamp (75-85 g pressure)	FST	18055-02	Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c
Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock	FST	18056-14	For FST 18055-02 clamps
Gayman T/Pump (water-bath heated platform)	Braintree Scientific	TP-650	The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery
15" W x 24" Heated platform	Braintree Scientific	HHP-2	Connect to Gayman heated water pump
Heating pad	Braintree Scientific	Model 39DP	Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery
Absorbable suture (Vicryl 5-0)	ETHICON	VCP834G	For fascia and muscle
Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B)	CP Medical	CP-B660B-03	For skin
Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm	FST	12501-13	To hold suture needles
Timer	FST	06-662-3	To quantify ischemia time
Hot bead sterilizer	FST	18000-45	To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol)
Electric razor	Braintree Scientific	CLP-22965
Tape	Durapore	1538-0
1 ml Syringe	EXELint	26044
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
Absorbent BenchPad	VWR	56617-014
Surgical drapes	VWR	21902-985	Need to be autoclaved
2’’ x 2’’ Gauze Pads	Medi-First	60673
Sterile gloves	Cardinal Health	2D7251
Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery.